在动物机体中，自由基的含量应当处在一个相对平衡的状态，体内自由基的过量产生会对机体T细胞造成损伤，降低免疫功能，甚至带来心脑血管等疾病[1]。因此，寻找一种天然的抗氧化剂来清除过量产生的自由基得到了越来越多的关注。在众多天然草本植物中，黑沙蒿因其丰富的营养成分和生物活性成分受到了广泛关注。近些年的研究表明，在动物饲粮中添加黑沙蒿及其提取物能够提高畜禽的生长性能，并显著增强其抗氧化功能，可作为天然的植物源饲料添加剂投入到动物生产中。研究表明，在肉仔鸡饲粮中添加黑沙蒿水提物可显著提高其平均日增重(ADG)[2]。此外，在饲粮中添加黑沙蒿水提物可提高常规饲养条件下和免疫应激条件下肉仔鸡血清及组织中的抗氧化酶活性及相应抗氧化酶基因的表达，进而提高肉仔鸡的抗氧化功能[3-4]。秦哲[5]的研究显示，在小白鼠饲粮中添加黑沙蒿水提物可显著提高小白鼠血清和肠组织中的超氧化物歧化酶(SOD)活性，提高肝组织中谷胱甘肽过氧化酶(GPx)活性，并降低血清及组织中丙二醛(MDA)的含量。吴迎朝[6]研究表明，在饲粮中添加黑沙蒿水提物能提高断奶仔猪的抗氧化能力。在反刍动物上也有类似发现，张永胜[7]研究表明在饲粮中添加3%黑沙蒿能促进绒山羊羔羊的抗氧化功能。由此可见，黑沙蒿及其提取物是一种潜在的植物源饲料添加剂，但目前的大多数研究主要集中在黑沙蒿及黑沙蒿水提物对畜禽的影响方面，而对于究竟是黑沙蒿中何种活性物质发挥了作用及其作用机制的研究还鲜见报道。
研究表明，多糖是植物煎煮后的汤剂中主要的活性成分[8]，且具有显著的抗氧化、免疫调节、抗肿瘤和抗炎等作用[9-12]，因此可以推断黑沙蒿中的多糖组分可能是提高动物生长性能和抗氧化能力的主要原因之一。研究表明，给早期断奶大鼠灌胃200 mg/kg BW的马齿苋多糖可显著降低其料重比[13]，而给糖尿病模型大鼠灌胃125~500 mg/kg BW的沙蒿多糖可加快其体重的恢复，并增强机体内抗氧化酶的活性，抑制脂质过氧化物的产生[14]。而在肉仔鸡饲粮中添加200 mg/kg的黄芩多糖可显著提高其生长性能[15]。由此推断，具有无残留和无耐药性等特点的植物多糖是目前有望替代抗生素的较为理想的绿色饲料添加剂。然而，迄今尚未就黑沙蒿多糖(Artemisia ordosica polysaccharide，AOP)对动物的生长性能及抗氧化作用的影响进行系统研究。本试验在前人及本课题组前期研究工作的基础上，采用水提-醇沉法制备AOP，并选取0.03 %的添加剂量来探究饲粮中添加AOP对大鼠生长性能和抗氧化功能的影响，为AOP在动物饲粮中的科学应用提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料与仪器雄性Wistar大鼠(180~220 g)购自内蒙古医科大学实验动物中心；血清生化指标测定试剂盒为上海荣盛生物药业有限公司产品；组织抗氧化指标测定试剂盒为南京建成生物工程研究所产品；RNAisoTM Plus、PrimeScriptTM RT reagent Kit(Perfect Real Time)及TB Premix Dimer EraserTM试剂盒均为大连宝生物有限公司产品。
旋转蒸发仪(RE-5298型，上海亚荣生化仪器厂)、真空冷冻机(SJIA-10N-50，宁波布双嘉仪器有限公司)、全自动生化分析仪(日立747，日本)、分光光度计(V-1000型，上海翱艺仪器有限公司)、低温高速离心机(Sigma，德国)、全自动酶标仪(Synergy H4 BioTek，日本)、电泳仪(Bio-Rad 164-5050 Powerpac Basic，美国)、凝胶成像分析仪(Tanon Gis-1000，上海天能科技生物公司)、掌上离心机(LX-200，海门市其林贝尔仪器制造有限公司)、实时定量PCR仪(Roche，美国)。
1.2 AOP的制备黑沙蒿植株(菊科蒿属)于8月采自内蒙古鄂尔多斯境内的库布齐沙地草原。参照Zhang等[16]，采用水提-醇沉法制备AOP，具体过程如下：将采集的整株黑沙蒿用蒸馏水冲洗后，放在阴凉处室温干燥。干燥后的整株黑沙蒿磨成粉末，过60目筛。取200 g黑沙蒿粉加入到6 L的蒸馏水中，在60 ℃下水浴4 h。随后收集提取液并使用0.45 μm过滤器过滤，将过滤后的滤液旋转蒸发，浓缩至原提取液体积的1/5。在提取液中加入4倍体积的无水乙醇，在4 ℃下沉淀多糖48 h。多糖完全沉淀后，于12 000×g下离心15 min，收集沉淀下的多糖，并真空冷冻干燥，制成干粉于-20 ℃保存备用。
1.3 试验动物与试验设计试验选取12只雄性Wistar大鼠，随机分为2个组，每组6只。2组大鼠分别饲喂基础饲粮(对照组)和在基础饲粮中添加0.03% AOP的饲粮(添加AOP组)，试验期为21 d。试验用基础饲粮为市购鼠粮，由玉米、豆粕、鱼粉、草粉、磷酸氢钙、草酸钙及多种维生素与矿物质预混料等组成，其营养水平如下：水分≤10%、粗蛋白质≥20%、粗脂肪≥4%、粗纤维≤5%、粗灰分≤8%、钙1.0%~1.8%、总磷0.6%~1.2%、赖氨酸≥1.32%及蛋氨酸+半胱氨酸≥0.78%。将基础饲粮粉碎，在添加AOP组饲粮中加入0.03%的AOP，随后将添加AOP组和对照组饲粮重新制成颗粒后饲喂。在整个试验期间，所有试验大鼠均自由采食和饮水，温度维持在24 ℃，光照周期为每天12 h光照和12 h黑暗。
1.4 测定指标及方法 1.4.1 生长性能测定于试验第0天(试验开始前)和第21天称重和结料，试验期间每天记录大鼠的采食量以计算各组的ADG、平均日采食量(ADFI)及增重耗料比(G/F)。各指标计算公式如下：
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试验至结束时，大鼠禁食12 h，在戊巴比妥钠麻醉后，从腹部动脉采集血液，抗凝管收集，静置30 min后，3 000×g离心10 min制备血清，-80 ℃保存。使用相应试剂盒，在全自动生化分析仪上，采用紫外分光度法测定血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)活性以及总胆红素(TBIL)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、葡萄糖(GLU)、胆固醇(CHO)、肌酐(CRE)、尿素(UREA)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、钙(Ga)和磷(P)含量。
1.4.3 肝脏、脾脏和肾脏组织中抗氧化指标及相关基因表达的测定将大鼠处死后，进行组织样本的采样，用预冷的生理盐水清洗肝脏、脾脏和肾脏，置于冻存管中并将其放入液氮中速冻，随后转移到-80 ℃保存。称取0.5 g的组织样，加入4.5 mL提前预冷的生理盐水中匀浆，匀浆液在4 ℃下于3 000×g离心10 min，收集上清液用于抗氧化指标的测定。总抗氧化能力(T-AOC)以及过氧化氢酶(CAT)、SOD、GPx活性和MDA含量采用比色法测定。肝脏、脾脏和肾脏中抗氧化酶活性以U/mg prot表示。组织中蛋白质含量采用考马斯亮蓝法测定。
组织中总RNA的提取采用RNAisoTM Plus裂解液法，用紫外分光光度计在260和280 nm处对提取的RNA进行定量和定性测定。采用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。cDNA的合成按照PrimeScriptTM RT reagent Kit(Perfect Real Time)的说明书进行。实时荧光定量PCR按照TB Premix Dimer EraserTM试剂盒进行操作，扩增条件：第1步，95 ℃ 30 s，共1个循环；第2步，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40个循环；第3步，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 30 s，共1个循环。本试验以β-肌动蛋白(β-actin)为内参基因，分别检测CAT、GPx1、SOD1、SOD2基因的表达量，各目的基因的表达量用2-△△Ct法计算。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司设计合成，引物序列及参数见表 1。
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表 1 引物序列及参数 Table 1 Primer sequences and parameters |
试验数据经Excel 2007整理后，利用SAS 9.0软件的一般线性模型(GLM)进行t检验。P < 0.05为差异显著，P < 0.01为差异极显著，0.05≤P < 0.10为有显著趋势。试验结果表示为平均值±标准差(mean±SD)。
2 结果与分析 2.1 AOP对大鼠生长性能的影响由表 2可知，与对照组相比，饲粮中添加AOP显著提高大鼠的ADG(P < 0.05)，极显著提高大鼠的G/F(P < 0.01)，而对大鼠的ADFI无显著影响(P>0.05)。
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表 2 AOP对大鼠生长性能的影响 Table 2 Effects of AOP on growth performance of rats |
由表 3可知，与对照组相比，饲粮中添加AOP极显著降低大鼠血清中ALP的活性(P < 0.01)，显著降低血清中CRE和UREA的含量(P < 0.05)，显著增加血清中TG、Ca和P的含量(P < 0.05)，而对大鼠血清中ALT和AST活性及TBIL、TP、ALB、GLU、CHO、TG、LDL-C和HDL-C含量无显著影响(P>0.05)。
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表 3 AOP对大鼠血清生化指标的影响 Table 3 Effects of AOP on serum biochemical indices of rats |
由表 4可知，与对照组相比，饲粮中添加AOP极显著增加大鼠肝脏中CAT活性(P < 0.01)，显著增加肝脏中GPx活性(P < 0.05)，有增加肝脏中T-AOC(P=0.09)和SOD活性(P=0.08)的趋势，而对肝脏中MDA含量无显著影响(P>0.05)。此外，与对照组相比，添加AOP组大鼠肝脏中SOD2基因的表达量极显著增加(P < 0.01)，肝脏中SOD1基因的表达量显著增加(P < 0.05)，肝脏中CAT基因的表达量有增加的趋势(P=0.07)，肝脏中GPx1表达量无显著变化(P>0.05)。
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表 4 AOP对大鼠肝脏抗氧化指标及相关基因表达的影响 |
由表 5可知，与对照组相比，饲粮中添加AOP极显著增加大鼠脾脏中GPx活性(P < 0.01)，显著增加脾脏中SOD活性(P < 0.05)，对肝脏中T-AOC、CAT活性及MDA含量无显著影响(P>0.05)。此外，与对照组相比，添加AOP组大鼠脾脏中GPx1基因的表达量极显著增加(P < 0.01)，脾脏中SOD1、SOD2、CAT基因的表达量显著增加(P < 0.05)。
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表 5 AOP对大鼠脾脏抗氧化指标及相关基因表达的影响 Table 5 Effects of AOP on antioxidant indices and related gene expression in spleen of rats |
由表 6可知，与对照组相比，饲粮中添加AOP显著增加大鼠肾脏中T-AOC(P < 0.05)，而对肾脏中SOD、CAT和GPx活性以及MDA含量无显著影响(P>0.05)。此外，与对照组相比，添加AOP组大鼠肾脏中SOD2基因的表达量显著增加(P < 0.05)，肾脏中CAT、GPx1、SOD1基因的表达量无显著变化(P>0.05)。
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表 6 AOP对大鼠肾脏抗氧化指标及相关基因表达的影响 Table 6 Effects of AOP on antioxidant indices and related gene expression in kidney of rats |
多年来，国内外学者致力于植物多糖等绿色饲料添加剂全部或部分替代抗生素的研究，植物多糖不同于抗生素等药物，它具有无残留、无耐药性及无污染等特点，且饲粮中添加适宜剂量的植物多糖能够促进动物的生长[13]，本试验研究也表明饲粮中添加0.03%的AOP可显著或极显著增加大鼠的ADG和G/F。但目前尚无针对AOP促进动物生长性能机制的报道。动物的生长性能与营养物质消化率密切相关。岳远西[2]研究表明，黑沙蒿水提物可增加动物机体对营养物质的消化率[6]，提高肠道消化酶活性并改善肠绒毛形态。吕美[17]研究表明，在饲粮中添加黄芪多糖能够提高肉仔鸡十二指肠食糜中淀粉酶、脂肪酶和总蛋白水解酶的活性，并提高粗蛋白质表观代谢率，进而改善肉仔鸡的生长性能，且其促生长作用与抗生素相当。黄小流等[13]研究表明，200 mg/kg BW马齿苋多糖可促进肠道绒毛发育，从而改善早期断奶大鼠的生长性能。血清中Ca和P可作为机体Ca、P营养状况的参考指标[18]，在本试验中观测到饲粮中添加0.03%的AOP后能显著提高大鼠血清中Ca和P的含量，说明AOP可以改善机体的Ca、P营养状况。综合前人研究和本试验结果可推断AOP的促生长作用可能与其促进机体对营养物质的消化、吸收及利用有关，其具体机制还有待进一步研究。此外，本试验结果还表明，饲粮中添加0.03%的AOP提高了大鼠血清中TG的含量，这提示AOP能促进大鼠机体脂类的代谢，而这与马齿苋多糖提高大鼠脂类代谢的研究结果[13]相一致，这也可能是AOP提高大鼠ADG的原因之一。
3.2 AOP对大鼠抗氧化功能的影响血液中ALT与AST活性是肝脏功能检查中常见的检测指标，当肝脏组织或细胞受到损伤时，ALT与AST就会更多地释放到血液中，其活性升高[19]。本试验结果显示，添加AOP组血清ALT与AST的活性与对照组相比并无显著变化，说明饲粮中添加0.03%的AOP并未伤及大鼠的肝脏。通常ALP存在于细胞中的，只有少量存在于血液中。血液中ALP活性的增加是肝胆疾病的症状之一，它是在某些疾病条件下细胞被破坏引起的[20]。在本试验条件下，饲粮中添加0.03%的AOP能显著降低大鼠血清中ALP的活性，因此推断，AOP在保护肝脏方面是有益的。测定血清中UREA和CRE含量可反映机体肾脏功能状态[21]，其含量越高，肾脏功能的损伤程度越严重。本试验结果表明，饲粮中添加0.03%的AOP显著降低了大鼠血清中UREA和CRE的含量，这表明AOP能够改善大鼠的肾脏功能。
研究表明，植物多糖可通过提高体内主要抗氧化酶类的活性，进而提高机体的抗氧化能力[22-24]。SOD能够催化超氧阴离子(O2-)生成为过氧化氢(H2O2)，CAT和GPx进一步消除生成的H2O2[25]，而MDA含量是衡量机体脂质氧化损伤程度的重要指标。本试验测定了饲粮中添加0.03% AOP对大鼠不同组织中抗氧化酶活性和脂质氧化损伤程度的影响，结果表明，饲粮中添加0.03%的AOP可不同程度地提高大鼠肝脏、脾脏和肾脏中抗氧化酶的活性及其基因表达量。研究表明，蒿属植物提高机体抗氧化酶活性的机制可能与核因子E2相关转录因子2(nuclear factor erythroid 2 related factor, Nrf2)的表达有关[26]。调控因子Nrf2是近年来新发现的一种核转录因子，以Kelch样ECH相关蛋白1(Keap1)-Nrf2-抗氧化反应元件(ARE)信号通路调控下游抗氧化酶[如SOD、CAT、谷胱甘肽硫转移酶(GST)]基因的表达，该信号通路是细胞对抗外源性刺激和氧化损伤的主要通路[27]。另有研究表明，黄芪多糖[28]和黄姜多糖[29]可以通过阻断核因子-κB(NF-κB)信号通路来抑制机体内活性氧分子的过量产生。而冬虫夏草多糖则可通过细胞外信号调节激酶(ERK)/Akt信号通路抑制血小板衍生因子-BB(PDGF-BB)诱导的炎症反应和活性氧分子的过量生成[30]。基于前人及本试验的研究结果可以推断，饲粮中添加0.03%的AOP可提高动物体内主要抗氧化酶类的活性，进而提高机体的抗氧化功能，而Toll样受体4(TLR4)/NF-κB、Keap1-Nrf2-ARE及ERK/Akt信号通路可能单独或共同参与对机体抗氧化功能的调控，但关于AOP发挥抗氧化功能的具体机制尚未见报道，仍需进一步研究探索。除此之外，植物多糖还可以通过直接清除体内自由基发挥其抗氧化作用。研究表明，植物多糖具有抗氧化功能可能是由于其含有丰富的生物活性物质，它们可以作为电子或氢的供体，减少自由基的形成，并清除自由基[31-32]。已有报道指出，海藻多糖和沙蒿多糖可通过清除机体过量产生的自由基来保护机体免受氧化损伤[33-34]，这也可能是AOP提高动物抗氧化功能的另一主要原因，其具体机制还有待进一步研究。
4 结论综上所述，饲粮中添加0.03%的AOP可提高大鼠的生长性能，并提高其肝脏、脾脏及肠道中抗氧化酶活性，进而增强机体的抗氧化功能，因此有望将其开发为一类可促进动物生长并增强机体抗氧化功能的天然饲料添加剂。
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