断奶应激、免疫力低下及腹泻严重威胁着仔猪的生长发育[1]，寻找绿色、安全的饲料添加剂来缓解这一问题已成为当前畜牧工作者研究的重中之重。八角提取物(Illicium verum extracts，IVE)和杜仲叶提取物(Eucommia ulmoides leaves extracts，ELE)作为新型绿色饲料添加剂，具有安全和不易产生耐药性等优点，同时具有抑菌、抗氧化及提高免疫力等多种作用[2-4]。然而，IVE和ELE对不同品种断奶仔猪免疫功能和抗氧化能力的影响却鲜有报道。因此，本试验旨在研究IVE和ELE对断奶仔猪免疫功能和抗氧化能力的影响，同时比较杜×长×大(Duroc×Landrace×Yorkshire，DLY)和本土里岔黑(Chinese native Licha-black，LCB)断奶仔猪的差异，为IVE和ELE在不同品种猪上的应用提供科学依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料IVE：山东农业大学动物营养研究实验室提取，提取方法为乙醇提取法。主要成分：反式茴香脑≥55.50%，草稿脑≥6.17%，茴香醛≥4.56%。
ELE：山东龙昌动物保健品有限公司提供。主要成分：杜仲多糖≥20.00%，黄酮≥8.00%，绿原酸≥5.00%。
金霉素(chlortetracycline，CHL)：山东雨泽银丰动物药业有限公司提供。
1.2 试验设计选择体重[(11.22±0.32) kg]相近的健康DLY和LCB断奶仔猪各48头，随机分为4组，每组3个重复，每个重复8头猪(DLY和LCB各4头)，各组间体重差异不显著(P>0.05)。对照组饲喂基础饲粮，试验组分别饲喂在基础饲粮的基础上添加500 mg/kg IVE、250 mg/kg ELE和50 mg/kg CHL的试验饲粮。基础饲粮组成及营养水平见表 1。预试期7 d，正试期42 d。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) |
每天记录各组断奶仔猪的采食量和剩料量，试验前、试验末和每周称量各组断奶仔猪的体重，计算其平均日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)和料重比(F/G)。
1.3.2 血清生化指标试验结束后，每个重复随机选择1头DLY和1头LCB断奶仔猪，空腹前腔静脉采血10 mL放置于真空抗凝管，用于外周血淋巴细胞增殖率的测定；另采血10 mL于温水浴静置10 min，然后2 000 r/min离心10 min，分离血清并分装编号，-20 ℃冰箱中保存待测。采用全自动生化分析仪(COBUS MIRA Plus，瑞士罗士公司)测定血清总蛋白、胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)和尿素氮含量。
1.3.3 血常规参数采用KX-21型血细胞分析仪(SYSMEX东亚有限公司，日本)测定全血白细胞计数、红细胞计数、血小板计数、淋巴细胞百分率和血红蛋白浓度。
1.3.4 外周血淋巴细胞增殖率取放置于真空抗凝管中的全血10 mL与10 mL磷酸盐缓冲液(PBS)混匀，加入到20 mL猪淋巴细胞分离液(Percoll细胞分层液)中，于1 800 r/min离心20 min；用移液枪收集红细胞和血浆之间的外周血淋巴细胞，并加入到PBS中进行洗涤，1 000 r/min离心10 min，重复洗涤1次；加入红细胞裂解液去除红细胞，重复1次；将淋巴细胞悬浮于RPMI-1640完全培养液并调整细胞浓度到3×106个/mL。将上述提纯的细胞，计数后加入到96孔细胞板中，每孔加入100 μL；将细胞板置于37 ℃细胞培养箱中培养，24 h后每孔加入10 μL 5 mg/mL 3-(4, 5-二甲基噻唑-2)-2, 5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)(滤网除菌)溶液，继续培养4 h后，每孔加入90 μL 50%二甲基亚砜(DMSO)-10%十二烷基硫酸钠(SDS)溶液，使用酶标仪在570 nm波长下检测吸光度(OD)值。
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取待测血清，按照试剂盒说明测定血清免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)和免疫球蛋白G(IgG)含量。IgA(E027)、IgM(E025)和IgG(E026)试剂盒购于南京建成生物工程研究所。
1.3.6 屠宰试验与样品采集采血结束后，屠宰断奶仔猪，放血后打开胸腔和腹腔，准确称取脾脏重量，计算脾脏指数；然后在空肠和十二指肠中部各取1份5 g左右的样品，生理盐水冲洗内容物后，置于冻存管中-80 ℃液氮保存。
1.3.7 肌肉抗氧化酶活性和丙二醛含量剖开背部将背最长肌表面清除干净，取10 g左右置于10 mL离心管中，-20 ℃保存。于4 ℃分别放置24和48 h后，37 ℃水浴解冻，取适量在冰浴条件下用组织匀浆机将其制成10%的匀浆，4 000 r/min离心后，取上清待测。采用黄嘌呤氧化酶法(羟胺法)测定超氧化物歧化酶(SOD)活性，采用化学比色法测定谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性和丙二醛(MDA)含量。SOD(A001)、GSH-Px(A005)和MDA(A003)试剂盒购于南京建成生物工程研究所。
1.3.8 组织RNA提取及抗氧化相关基因的mRNA相对表达量根据GenBank已报道的猪的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPx4)和p38丝裂原激活蛋白激酶(p38MAPK)基因序列，用Primer 6.0软件进行引物设计，由华大基因合成，引物序列见表 2。
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表 2 引物序列 Table 2 Primer sequences |
取出-80 ℃保存的空肠和十二指肠样品50~100 mg，按照Trizol试剂盒说明书(Invitrogen公司，美国)提取总RNA，利用紫外分光光度计检测RNA的质量和浓度，结果显示OD值均在1.8~2.0。检测后的总RNA立即进行反转录。反转录按照PrimeScript@ RT Master Mix Perfect Real Time试剂盒说明书进行操作。荧光定量PCR的反应体系为20 μL，其扩增条件均为95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火延伸34 s，95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40个循环，60 ℃检测荧光信号。每个样品做3个重复。荧光定量PCR检测结果用2-△△Ct法进行数据处理，分析空肠和十二指肠GPx4和p38MAPK的mRNA相对表达量。
1.4 数据统计试验数据使用SAS 9.3软件进行统计。仔猪品种和饲粮添加剂间差异采用双因素方差分析进行统计分析，各平均值之间用Duncan氏法进行多重比较。试验数据用平均值和SEM表示，P < 0.05表示差异显著。
2 结果 2.1 IVE和ELE对DLY和LCB断奶仔猪生长性能的影响由表 3可知，与对照组相比，IVE、ELE和CHL组DLY和LCB断奶仔猪的ADG均显著增加(P < 0.05)，IVE、ELE和CHL组LCB断奶仔猪的F/G显著降低(P < 0.05)。DLY断奶仔猪的ADG显著高于LCB断奶仔猪(P < 0.05)，而ADFI和F/G显著低于LCB断奶仔猪(P < 0.05)。仔猪品种与饲料添加剂的交互作用对断奶仔猪的ADG、ADFI和F/G均有显著影响(P < 0.05)。
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表 3 IVE和ELE对DLY和LCB断奶仔猪生长性能的影响 Table 3 Effects of IVE and ELE on growth performance of DLY and LCB weaned piglets |
由表 4可知，与对照组相比，IVE组DLY和LCB断奶仔猪的血清总蛋白含量显著增加(P < 0.05)，IVE和ELE组DLY和LCB断奶仔猪的血清尿素氮含量显著降低(P < 0.05)，ELE组LCB断奶仔猪的血清HDL含量显著增加(P < 0.05)，血清LDL含量则显著降低(P < 0.05)。LCB断奶仔猪的血清尿素氮和LDL含量显著高于DLY断奶仔猪(P < 0.05)，而血清HDL含量显著低于DLY断奶仔猪(P < 0.05)。仔猪品种与饲料添加剂的交互作用对断奶仔猪的血清生化指标均无显著影响(P>0.05)。
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表 4 IVE和ELE对DLY和LCB断奶仔猪血清生化指标的影响 Table 4 Effects of IVE and ELE on serum biochemical indexes of DLY and LCB weaned piglets |
由表 5可知，饲粮中添加IVE和ELE对DLY和LCB断奶仔猪的红细胞计数、白细胞计数、血小板计数、血红蛋白浓度和淋巴细胞百分率均无显著影响(P>0.05)。仔猪品种与饲料添加剂的交互作用对断奶仔猪的血常规参数无显著影响(P>0.05)。
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表 5 IVE和ELE对DLY和LCB断奶仔猪血常规参数的影响 Table 5 Effects of IVE and ELE on blood routine parameters of DLY and LCB weaned piglets |
由表 6可知，与对照组相比，ELE组DLY断奶仔猪的外周血淋巴细胞增殖率、血清IgA和IgG含量显著增加(P < 0.05)，LCB断奶仔猪的外周淋巴细胞增殖率和血清IgA含量显著增加(P < 0.05)；CHL组LCB断奶仔猪的血清IgM含量显著降低(P < 0.05)。DLY断奶仔猪的脾脏指数、血清IgM和IgG含量均显著低于LCB断奶仔猪(P < 0.05)。仔猪品种与饲料添加剂的交互作用对断奶仔猪的血清IgM含量有显著影响(P < 0.05)。
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表 6 IVE和ELE对DLY和LCB断奶仔猪脾脏指数、外周血淋巴细胞增殖率和血清免疫球蛋白含量的影响 Table 6 Effects of IVE and ELE on spleen index, peripheral blood lymphocyte proliferation rate and serum immunoglobulin contents of DLY and LCB weaned piglets |
由表 7可知，与对照组相比，IVE和ELE组DLY和LCB断奶仔猪背最长肌中的SOD活性(24和48 h)和LCB断奶仔猪背最长肌中的GSH-Px活性(24 h)显著增加(P < 0.05)，DLY断奶仔猪背最长肌中的MDA含量(24和48 h)显著降低(P < 0.05)；IVE组LCB断奶仔猪背最长肌中的MDA含量(24和48 h)显著降低(P < 0.05)。与IVE组相比，CHL组DLY和LCB断奶仔猪背长肌中的GSH-Px活性(24和48 h)显著降低(P < 0.05)。DLY断奶仔猪背最长肌中的GSH-Px活性(24 h)显著高于LCB断奶仔猪(P < 0.05)，而MDA含量(48 h)显著低于LCB断奶仔猪(P < 0.05)。仔猪品种与饲料添加剂的交互作用对断奶仔猪背最长肌中的SOD和GSH-Px活性及MDA含量无显著影响(P>0.05)。
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表 7 IVE和ELE对DLY和LCB断奶仔猪背最长肌抗氧化酶活性和丙二醛含量的影响 Table 7 Effects of IVE and ELE on antioxidant enzymes activities and MDA content of longissimus dorsi muscle of DLY and LCB weaned piglets |
由表 8可知，与对照组相比，IVE和ELE组DLY断奶仔猪十二指肠和空肠中GPx4和p38MAPK的mRNA相对表达量和LCB十二指肠中GPx4的mRNA相对表达量显著增加(P < 0.05)。DLY断奶仔猪十二指肠和空肠中GPx4的mRNA相对表达量显著高于LCB断奶仔猪(P < 0.05)。仔猪品种与饲料添加剂的交互作用对断奶仔猪十二指肠和空肠GPx4和p38MAPK的mRNA相对表达量无显著影响(P>0.05)。
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表 8 IVE和ELE对DLY和LCB断奶仔猪十二指肠和空肠抗氧化相关基因mRNA相对表达量的影响 Table 8 Effects of IVE and ELE on mRNA relative expression levels of antioxidant-related genes of duodenum and jejunum of DLY and LCB weaned piglets |
近年来，植物提取物作为生长促进剂引起学者的关注，但其对动物生长性能的影响存在争议。本课题组前期研究证实八角粉对仔猪[5]、八角粉和八角油对肉鸡[6]和产蛋鸡[7]的有利作用；但研究认为杜仲叶粉降低生长和肥育猪的ADG和ADFI[8]，21日龄敌草快诱导仔猪饲粮中添加100 mg/kg杜仲黄酮对ADG无显著影响，ADFI有升高趋势[9]。以上结果表明，植物提取物对动物生长性能的影响与植物种类、加工方法、活性成分纯度和添加剂量有关。本研究表明IVE和ELE能够促进DLY和LCB断奶仔猪的生长性能，但其机制需要进一步验证。
3.2 IVE和ELE对DLY和LCB断奶仔猪血清生化指标的影响血清总蛋白是血清中含量最多的成分，其含量的高低与动物机体蛋白质代谢密切相关[10]，饲粮蛋白质消化吸收良好血清总蛋白含量升高。尿素氮是蛋白质分解代谢的产物，其含量的高低反映了饲粮蛋白质利用率的高低，饲粮蛋白质利用率越高，体内氨基酸利用率越高，血清尿素氮含量越低[11]。研究表明，肉鸡饲粮中添加百里香和八角茴香精油可显著提高饲粮利用率[12-13]。丁晓等[14]研究表明，饲粮中添加IVE精油可显著提高肉鸡对部分氨基酸的利用率。王建辉等[15]研究表明，饲粮中添加ELE能显著降低生长育肥猪的血清尿素氮含量。本试验中，与对照组相比，IVE组断奶仔猪的血清总蛋白含量显著增加，IVE和ELE组的血清尿素氮含量显著降低，说明饲粮中添加IVE和ELE可提高断奶仔猪血清总蛋白含量，降低血清尿素氮含量，原因可能是IVE茴香精油和ELE京尼平可以刺激肝脏分泌胆汁，促进消化酶活性和胃液分泌，刺激胃肠蠕动[5, 16-17]，加强对饲粮蛋白质的消化，氨基酸利用率提高，机体蛋白质合成代谢旺盛，进而引起总蛋白含量升高和尿素氮含量降低。此外，LCB断奶仔猪的血清尿素氮含量显著高于DLY断奶仔猪，说明DLY断奶仔猪的蛋白质代谢能力比LCB断奶仔猪要强，原因之一可能是LCB断奶仔猪的粗蛋白质表观消化率低于DLY断奶仔猪[18]。
3.3 IVE和ELE对DLY和LCB断奶仔猪脾脏指数、外周血淋巴细胞增殖率和血清免疫球蛋白含量的影响外周血淋巴细胞增殖率是反映机体细胞免疫功能的重要手段之一[19]。研究表明，饲粮中添加1 500 mg/kg的杜仲素可显著提高贵妃鸡的外周血淋巴细胞转化率，增强淋巴细胞的免疫应答[20]。本试验中，与对照组相比，ELE组断奶仔猪的外周血淋巴细胞增殖率显著增加，与CHL组相比也有增加趋势。
免疫球蛋白是机体对抗原物质产生免疫应答的重要产物，具有各种免疫功能[21]。研究表明，ELE绿原酸能增加小鼠体内IgG含量，并促进肠系膜淋巴结产生白细胞介素-4(IL-4)[22]，饲粮中添加200 mg/kg ELE可显著提高肉兔的血清IgA含量[23]。Lin等[24]研究也表明，ELE绿原酸能显著提高小鼠血清IgG含量，增加IgG抗体形成细胞数量。本试验中，饲粮中添加ELE显著提高断奶仔猪的血清IgA和IgM含量，且LCB断奶仔猪的血清IgM和IgG含量显著高于DLY断奶仔猪，说明LCB断奶仔猪的体液免疫水平高于DLY断奶仔猪，提示LCB断奶仔猪具有更强的免疫力和抗病力。仔猪品种和饲料添加剂的交互作用对断奶仔猪的血清IgM含量有显著影响，说明饲粮中添加ELE可提高断奶仔猪的机体免疫力，原因可能是ELE绿原酸可以促进IL-4的合成，有利于淋巴细胞的增殖分化[22]；地黄普内酯有促进T淋巴细胞增殖分化的功能，可以增强细胞免疫[25]；且杜仲叶也可促进免疫器官的发育，提高机体的免疫应答，促进免疫球蛋白的合成和分泌，增强机体免疫力。
研究表明，饲粮中添加八角和百里香混合精油对肉鸡的脾脏指数无显著影响[12]；丁晓等[26]研究发现，饲粮中添加八角油对肉鸡的脾脏指数有显著影响。本试验中，饲粮中添加IVE和ELE对断奶仔猪的脾脏指数无显著影响，但DLY断奶仔猪的脾脏指数显著低于LCB断奶仔猪，这可能是猪的品种对脾脏指数有一定程度的影响，其相关作用机理仍需进一步研究。
3.4 IVE和ELE对DLY和LCB断奶仔猪背最长肌抗氧化酶活性和丙二醛含量的影响研究表明，饲粮中添加杜仲素可提高断奶仔猪的血清GSH-Px活性，降低血清MDA含量，提高机体的抗氧化能力[27]。饲粮中添加3%或4%杜仲叶粉代替部分次粉可提高育肥猪肝脏中的GSH-Px活性，降低肝脏MDA含量[28]。泌乳期和妊娠后期母猪饲粮中添加八角可不同程度提高血清和乳的SOD和GSH-Px活性，降低MDA含量，提高母猪的抗氧化能力[29]。本试验中，IVE和ELE可提高断奶仔猪背长肌中的SOD和GSH-Px活性，降低MDA含量，且其对DLY断奶仔猪的作用效果优于LCB断奶仔猪，说明断奶仔猪饲粮中添加IVE和ELE可提高抗氧化酶活性，提高机体的抗氧化能力，并且对DLY断奶仔猪有更好的促进作用。推测可能是由于八角茴香精油中的主要成分酚类和黄酮类化合物以及ELE中的绿原酸和黄酮类等多种化学成分具有抗氧化作用，能提供氢离子与体内的过氧化产物发生反应，分解和清除机体自由基，提高抗氧化酶活性，保护机体的正常代谢功能[30-32]。
3.5 IVE和ELE对DLY和LCB断奶仔猪十二指肠和空肠抗氧化相关基因mRNA相对表达量的影响GPx4由Ursini等在1982年首次从猪肝脏中分离纯化得到[33]，具有清除体内过氧化物、保护生物膜及抗氧化作用[34]。Gatellier等[35]研究表明，GPx4既可以分解过氧化氢，也可以分解过氧化脂质。陈伟[36]研究表明，猪GPx4的mRNA表达量越高，GPx4酶活性就越高。本试验中，IVE和ELE组断奶仔猪十二指肠和空肠中GPx4的mRNA相对表达量高于对照组和CHL组，说明IVE和ELE对GPx4酶活性有促进作用。与IVE和ELE可提高机体抗氧化酶活性，从而提高机体抗氧化能力的研究结果相一致。
p38MAPK于1993年由Brewster等[37]首次发现，于1994年由Han等[38]用高渗环境和内毒素刺激小鼠肝脏分离纯化得到。p38MAPK传导通路参与细胞生长、分化、凋亡、应激反应等多种细胞过程的调节[39]。研究发现，氧化应激与p38MAPK信号通路激活密切相关[40]。本试验中，IVE和ELE组断奶仔猪十二指肠和空肠中p38MAPK的mRNA相对表达量高于CHL组和对照组，说明饲粮中添加IVE和ELE可提高机体的抗氧化能力。且DLY断奶仔猪十二指肠和空肠中GPx4和p38MAPK的mRNA相对表达量高于LCB断奶仔猪，提示猪的品种对GPx4和p38MAPK的mRNA表达有一定影响，与陈伟[36]的研究一致。
4 结论① IVE和ELE提高DLY和LCB断奶仔猪的生长性能及背最长肌、十二指肠和空肠的抗氧化能力。
② ELE提高DLY和LCB断奶仔猪的免疫功能，调节脂代谢。
③ LCB断奶仔猪的自身免疫水平高于DLY断奶仔猪，而生产性能、背长肌、十二指肠和空肠的抗氧化性能以及蛋白质代谢能力不如DLY断奶仔猪。
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