动物营养学报    2019, Vol. 31 Issue (10): 4757-4765    PDF    
引用本文
范曜天, 孙劼, 夏光亮, 赵芳芳, 孙华, 王洪荣. 添加槐花、香蕉花和杭白菊对体外诱导人工瘤胃酸中毒缓解效果的研究[J]. 动物营养学报, 2019, 31(10): 4757-4765.  
FAN Yaotian, SUN Jie, XIA Guangliang, ZHAO Fangfang, SUN Hua, WANG Hongrong. Alleviating Effects of Adding Sophora japonica, Musa nana flower and Chrysanthemum morifolium on Induced Artificial Rumen Acidosis in Vitro[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2019, 31(10): 4757-4765.  
添加槐花、香蕉花和杭白菊对体外诱导人工瘤胃酸中毒缓解效果的研究
范曜天 , 孙劼 *, 夏光亮 , 赵芳芳 , 孙华 , 王洪荣     
扬州大学动物科学与技术学院, 扬州 225009
收稿日期: 2019-03-26
基金项目: 江苏省现代农业（肉羊）产业技术体系（JATS[2018]305）；国家自然科学基金项目（31872988，31572429）；扬州大学高端人才支持计划（2016）
作者简介: 范曜天(1995-), 男, 江苏南通人, 硕士研究生, 研究方向为反刍动物瘤胃微生物代谢调控。E-mail:929745448@qq.com.
通信作者: 王洪荣, 教授, 博士生导师, E-mail:hrwang@yzu.edu.cn.
*同等贡献作者
摘要: 本试验旨在研究添加槐花、香蕉花和杭白菊对体外诱导人工瘤胃酸中毒的缓解效果，为实际生产中缓解瘤胃酸中毒的应用提供理论依据。试验采用体外批次培养法，分别在高非纤维性碳水化合物底物[非纤维性碳水化合物/中性洗涤纤维（NFC/NDF）为2.30]和常规底物（NFC/NDF为1.19）中添加槐花、香蕉花和杭白菊，研究其对于瘤胃发酵参数的影响。试验采用单因素设计，试验分4组，每组设置3个重复。3种植物的添加量均为10 mg/mL，对照组不添加植物干粉，分别于发酵后的3、6、9、12 h，采集发酵液用于各发酵参数的测定。结果表明：1）常规底物中，香蕉花组各发酵阶段的体外发酵液pH均高于对照组（P>0.05）；高非纤维性碳水化合物底物中，对照组各发酵阶段的体外发酵液pH显著高于杭白菊组（P < 0.05）。2）常规底物中，发酵3、6 h时，香蕉花组的体外发酵液乳酸浓度显著高于对照组（P < 0.05）；发酵12 h时，槐花组、香蕉花组和杭白菊组的体外发酵液乳酸浓度均显著低于对照组（P < 0.05）。高非纤维性碳水化合物底物中，发酵3、6 h时，香蕉花组的体外发酵液乳酸浓度显著高于对照组（P < 0.05）；发酵12 h时，杭白菊组的体外发酵液乳酸浓度显著低于对照组（P < 0.05）。3）发酵12 h时，各组的体外发酵液氨态氮浓度无显著差异（P>0.05），但发酵过程中存在差异。4）常规底物中，发酵12 h时，槐花组和杭白菊组的体外发酵液总挥发性脂肪酸浓度和丙酸比例显著高于对照组和香蕉花组（P < 0.05），乙酸和丁酸比例显著低于对照组和香蕉花组（P < 0.05）。高非纤维性碳水化合物底物中，发酵12 h时，杭白菊组的体外发酵液总挥发性脂肪酸浓度显著高于对照组和香蕉花组（P < 0.05），乙酸、丙酸、丁酸比例与对照组无显著差异（P>0.05）。由此可见，杭白菊能缓解瘤胃乳酸累积，而香蕉花则具有调控瘤胃pH相对衡定的能力，因此香蕉花和杭白菊在缓解瘤胃酸中毒方面有潜在价值。
关键词: 槐花    香蕉花    杭白菊    瘤胃酸中毒    
Alleviating Effects of Adding Sophora japonica, Musa nana flower and Chrysanthemum morifolium on Induced Artificial Rumen Acidosis in Vitro
FAN Yaotian , SUN Jie *, XIA Guangliang , ZHAO Fangfang , SUN Hua , WANG Hongrong     
College of Animal Science and Technology, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China
Corresponding author: WANG Hongrong, professor, E-mail:hrwang@yzu.edu.cn.
*Contributed equally
Abstract: The aim of this experiment was to investigate the alleviating effect of adding Sophora japonica, Musa nana flower and Chrysanthemum morifolium on induced artificial rumen acidosis in vitro, and to provide a theoretical basis for the application of alleviating rumen acidosis in production. The experiment used in vitro batch culture to study the effects of adding Sophora japonica, Musa nana flower and Chrysanthemum morifolium on rumen fermentation parameters in substance with high non-fibrous carbohydrates substance[non-fibrous carbohydrates/neutral detergent fiber (NFC/NDF) was 2.30] and conventional substance (NFC/NDF was 1.19), respectively. Single factor design was used in the experiment, the experiment was divided into 4 groups, and each group was repeated 3 times. Three plants were added 10 mg/mL in rumen fluid, and the control group did not add plant powder. Samples were collected on 3, 6, 9 and 12 h cultured in vitro and fermentation parameters were measured. The results showed as follows:1) in conventional substance, the pH at each fermentation stage of Musa nana flower group was higher than that of the control group (P>0.05); in high non-fibrous carbohydrates substance, the pH at each fermentation stage of control group was significantly higher than that of Chrysanthemum morifolium group (P < 0.05). 2) In conventional substance, at fermentation 3 and 6 h, the concentration of lactic acid in fermentation fluid in vitro of Musa nana flower group was significantly higher than that of the control group (P < 0.05); at fermentation 12 h, the concentration of lactic acid in fermentation fluid in vitro of Sophora japonica group, Musa nana flower group and Chrysanthemum morifolium group was significantly lower than that of the control group (P < 0.05). In high non-fibrous carbohydrates substance, at fermentation 3 and 6 h, the concentration of lactic acid in fermentation fluid in vitro of Musa nana flower group was significantly higher than that of the control group (P < 0.05); at fermentation 12 h, the concentration of lactic acid in fermentation fluid in vitro of Chrysanthemum morifolium group was significantly lower than that of the control group (P < 0.05). 3) At fermentation 12 h, there was no significant difference on concentration of ammonia nitrogen in fermentation fluid in vitro among all groups (P>0.05), but there were differences in the fermentation process. 4) In conventional substance, at fermentation 12 h, the total volatile fatty acids concentration and propionic acid proportion in fermentation fluid in vitro of Sophora japonica group and Chrysanthemum morifolium group were significantly higher than that of control group and Musa nana flower group (P < 0.05), and the proportions of acetic acid and butyric acid were significantly lower than that of control group and Musa nana flower group (P < 0.05). In high non-fibrous carbohydrates substance, at fermentation 12 h, the concentration of total volatile fatty acids in fermentation fluid in vitro of Chrysanthemum morifolium group were significantly higher than that of control group and Musa nana flower group (P < 0.05), and the proportions of acetic acid, propionic acid and butyric acid had no significant difference with the control group (P>0.05). In conclusion, Chrysanthemum morifolium can alleviate the accumulation of lactic acid in rumen, and Musa nana flower can balance the rumen pH, therefore Musa nana flower and Chrysanthemum morifolium have potential ability to alleviate rumen acidosis.
Key words: Sophora japonica    Musa nana flower    Chrysanthemum morifolium    rumen acidosis    

由于我国缺乏优质的粗饲料资源，在反刍动物饲养过程中为了追求高产，常常在饲粮中大量使用高淀粉精料，增加了患亚急性瘤胃酸中毒(subacute ruminal acidosis，SARA)的风险。Krause等[1]认为，SARA发生的原因大致可以分为以下几种：内外源瘤胃缓冲不足、过量摄入易快速发酵的碳水化合物以及机体适应性不足。Erdman[2]研究表明，饲粮中添加碳酸氢钠(NaHCO3)等缓冲剂对于提高瘤胃pH具有积极的作用，但是受饲粮组分的影响较大。合理控制饲粮中非纤维性碳水化合物/中性洗涤纤维(NFC/NDF)，能有效预防SARA的发生。Hutton等[3]的体外试验研究表明，在瘤胃发酵液中添加光秃爱沙木可有效缓解发酵过程中的乳酸蓄积，提高发酵液pH，且作用效果与维吉尼亚霉素相媲美。一些药用植物因其富含皂苷、多酚、黄酮、挥发油等物质，具有对瘤胃微生物及瘤胃发酵调控的作用。因此，天然药用植物及其提取物作为反刍动物饲料添加剂以调控瘤胃发酵成为研究热点。

槐花(Sophora japonica)具有凉血止血、清肝泻火的功效，对于治疗糖尿病以及抗菌消炎有显著作用，广泛的应用于人与动物的医疗保健中[4-6]。Park等[7]研究发现，饲喂含有槐花的饲粮可以显著改善高脂肪饮食中小鼠体内葡萄糖和脂肪的含量。Jung等[8]、苗明三等[9]研究也证明，槐花对于大鼠糖尿病的缓解有积极作用。香蕉(Musa nana)的花蕾常作为废弃物丢弃，但是经研究表明其具有丰富的药用价值，特别是糖尿病的防治以及抗菌消炎方面[10]。Ngamsaeng等[11]体外研究表明，香蕉花中矿物质含量较高，对于维持反刍动物体内离子平衡具有重要作用。Kang等[12-13]将香蕉花粉作为瘤胃缓冲剂添加于阉牛和泌乳奶牛的饲粮中，发现其能提高瘤胃pH，促进纤维瘤胃中分解菌的生长。杭白菊(Chrysanthemum morifolium)具有重要的药用价值并富含多种活性成分，特别是黄酮类物质[4, 14]。夏道宗等[15]证实杭白菊黄酮对于治疗氧化损伤有一定的功效。Yamamoto等[16]研究表明，杭白菊的热水提取物可以降低小鼠的血糖水平。以上的3种植物或其次级代谢产物均对糖代谢具有一定的调节作用，但是在反刍动物碳水化合物代谢上鲜有报道。因此，本试验选取槐花、香蕉花和杭白菊作为添加物，分别添加到不同NFC/NDF的半纯合饲粮底物中，研究其对体外诱导人工瘤胃酸中毒的缓解效果，为实际生产中缓解瘤胃酸中毒的应用提供依据。

1 材料与方法 1.1 试验动物

试验选取3只处于干奶期、体况良好并装有永久性瘤胃瘘管的萨能奶山羊为瘤胃液的供体，饲粮组成及营养水平如表 1所示。每日07:00和19:00各饲喂1次，自由饮水。

表 1 饲粮组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the diet (DM basis)
1.2 试验设计

试验采用单因素设计，研究在高非纤维性碳水化合物底物(NFC/NDF为2.30)和常规底物(NFC/NDF为1.19)中添加槐花、香蕉花和杭白菊对于人工瘤胃发酵参数的影响。参照Hutton等[3]的方法，3种植物的添加量均为10 mg/mL瘤胃液，槐花、香蕉花和杭白菊均购于扬州市中草药店，65 ℃烘干，粉碎并过1 mm筛。对照组不添加植物干粉，每组设置3个重复，分别于发酵后的3、6、9、12 h，采集发酵液用于各发酵参数的测定。

1.3 体外培养试验方法 1.3.1 瘤胃液采集

于晨饲前进行瘤胃液的采集，选用自制真空负压装置从山羊瘤胃中抽取瘤胃液，采集瘤胃液时需从瘤胃的前、中、后3个不同的部位进行收集，而后迅速混匀经4层纱布过滤，装入提前39 ℃预热且充满二氧化碳(CO2)的保温瓶中带回实验室，于39 ℃恒温水浴锅中保温，并持续通CO2以保证厌氧环境。

1.3.2 发酵液和底物的配制

试验采用半纯合饲粮为底物，底物组成如表 2所示[17]；人工唾液盐参照Menke等[18]的方法配制；充分混匀，39 ℃持续通入CO2，按照瘤胃液与人工唾液为1 : 2的比例混合均匀，取60 mL分装至装有底物的120 mL的厌氧培养瓶中，并向瓶内连续通入约5 s的CO2气体，而后用橡皮塞封口，加样完成后将培养瓶迅速置于39 ℃恒温振荡水浴摇床，以125 r/min的速度持续振荡培养12 h。水浴过程中每隔2 h放气1次，采样时，将培养瓶取出并置于冰水浴以结束发酵，而后收集、分装培养液，用于相关指标的测定。

表 2 底物组成 Table 2 Composition of substrates
1.4 测量指标与方法

发酵液pH的测定采用雷磁pHS-3C型pH计于各取样点立即测定；挥发性脂肪酸(volatile fatty acid，VFA)浓度测定参照Erwin等[19]的方法，采用气相色谱仪(GC-14B，日本津岛公司)测定；乳酸浓度的测定采用乳酸测试盒(A019-2，南京建成生物工程研究所)测定；氨态氮(NH3-N)浓度根据Broderick等[20]的方法采用酚-次氯酸钠比色法测定。

1.5 数据处理

试验数据经Excel 2010整理，通过SPSS 25.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，并采用Duncan氏法进行多重比较，结果以平均值±标准差的形式表示。P < 0.05为差异显著。

2 结果与分析 2.1 槐花、香蕉花和杭白菊对体外发酵液pH的影响

由表 3可知，随着发酵时间的延长，发酵液pH逐渐下降。常规底物中，香蕉花组各发酵阶段的体外发酵液pH均高于对照组，但差异不显著(P>0.05)；槐花组和杭白菊组各发酵阶段的体外发酵液pH显著低于对照组(P < 0.05)，且槐花组和杭白菊组之间无显著差异(P>0.05)。

表 3 不同NFC/NDF培养底物中添加3种药用植物对人工瘤胃发酵参数的影响 Table 3 Effects of adding three medicinal plants into different NFC/NDF culture substrates on artificial rumen fermentation parameters

高非纤维性碳水化合物底物中，对照组各发酵阶段的体外发酵液pH最高，杭白菊组最低，且2组之间差异显著(P < 0.05)；香蕉花组各发酵阶段的体外发酵液pH与对照组无显著差异(P>0.05)，且槐花组发酵阶段的体外发酵液pH与杭白菊组无显著差异(P>0.05)。

2.2 槐花、香蕉花和杭白菊对体外发酵液乳酸浓度的影响

由表 3可知，常规底物中，发酵3、6 h时，香蕉花组的体外发酵液乳酸浓度最高，且与对照组差异显著(P < 0.05)，槐花组和杭白菊组的体外发酵液乳酸浓度与对照组无显著差异(P>0.05)；发酵9 h时，各组的体外发酵液乳酸浓度无显著差异(P>0.05)；发酵12 h时，槐花组、香蕉花组和杭白菊组的体外发酵液乳酸浓度均显著低于对照组(P < 0.05)，杭白菊组的体外发酵液乳酸浓度显著低于槐花组和香蕉花组(P < 0.05)。

高非纤维性碳水化合物底物中，发酵3、6 h时，香蕉花组的体外发酵液乳酸浓度最高，并与对照组差异显著(P < 0.05)；发酵9 h时，各组的体外发酵液乳酸浓度无显著差异(P>0.05)；发酵12 h时，杭白菊组的体外发酵液乳酸浓度显著低于对照组(P < 0.05)。

2.3 槐花、香蕉花和杭白菊对体外发酵液NH3-N浓度的影响

由表 3可知，常规底物中，对照组的体外发酵液NH3-N浓度始终最低，除体外发酵9 h外，槐花组的体外发酵液NH3-N浓度始终最高；发酵3 h时，各组的体外发酵液NH3-N浓度无显著差异(P>0.05)；发酵6 h时，对照组的体外发酵液NH3-N浓度显著低于其他各组(P < 0.05)；发酵9 h时，对照组的体外发酵液NH3-N浓度显著低于槐花组和香蕉花组(P < 0.05)。发酵12 h时，各组的体外发酵液NH3-N浓度无显著差异(P>0.05)。

高非纤维性碳水化合物底物中，发酵3 h时，槐花组的体外发酵液NH3-N浓度显著高于对照组、香蕉花组和杭白菊组(P < 0.05)；发酵6 h时，槐花组的体外发酵液NH3-N浓度显著高于对照组(P < 0.05)；发酵9 h时，槐花组的体外发酵液NH3-N浓度显著高于对照组、香蕉花组和杭白菊组(P < 0.05)；发酵12 h时，各组的体外发酵液NH3-N浓度无显著差异(P>0.05)。

2.4 槐花、香蕉花和杭白菊对体外发酵液VFA比例及浓度的影响

如图 1所示，随着发酵的进行，体外发酵液总挥发性脂肪酸(total volatile fatty acid，TVFA)浓度逐渐增加，且对照组的体外发酵液TVFA浓度低于其他各组。常规底物中，发酵3、6 h，对照组的体外发酵液TVFA浓度显著低于其他各组(P < 0.05)；发酵9 h时，对照组的体外发酵液TVFA浓度与槐花组差异显著(P < 0.05)；发酵12 h时，槐花组和杭白菊组的体外发酵液TVFA浓度显著高于对照组和香蕉花组(P < 0.05)。整个发酵过程中，香蕉花组的体外发酵液乙酸比例高于其他各组，且对照组与香蕉花组之间无显著差异(P>0.05)，槐花组与杭白菊组之间无显著差异(P>0.05)。发酵6、9、12 h时，杭白菊、槐花组的体外发酵液丙酸比例显著高于香蕉花组和对照组(P < 0.05)，杭白菊组与槐花组之间无显著差异(P>0.05)；发酵12 h时，香蕉花组的体外发酵液丙酸比例显著低于其他各组(P < 0.05)。发酵3 h时，各组的体外发酵液丁酸比例无显著差异(P>0.05)；发酵6、9、12 h时，对照组的体外发酵液丁酸比例显著高于槐花组(P < 0.05)，对照组与香蕉花组之间无显著差异(P>0.05)，槐花组与杭白菊组之间无显著差异(P>0.05)。

数据柱标相同小写字母表示差异不显著(P＞0.05)，不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)。 Value columns with the same small letter mean no significant difference (P > 0.05), while with different small letters mean significant difference (P < 0.05). 图 1 不同NFC/NDF培养底物中添加3种药用植物对体外发酵液VFA比例及浓度的影响 Fig. 1 Effects of adding three medicinal plants into different NFC/NDF culture substrate on in vitro fermentation fluid VFA proportion and concentration

高非纤维性碳水化合物底物中，发酵3 h时，各组的体外发酵液TVFA浓度无显著差异(P>0.05)；发酵6、9 h时，对照组的体外发酵液TVFA浓度显著低于其他各组(P < 0.05)；发酵12 h时，杭白菊组的体外发酵液TVFA浓度显著高于香蕉花组和对照组(P < 0.05)。发酵6 h时，香蕉花组的体外发酵液乙酸比例显著高于槐花组和杭白菊组(P < 0.05)；发酵9 h时，对照组的体外发酵液乙酸比例显著高于槐花组和杭白菊组(P < 0.05)，且香蕉花组与对照组之间无显著差异(P>0.05)。除发酵12 h槐花组的体外发酵液丙酸比例显著高于对照组(P < 0.05)外，其余时间槐花组、杭白菊组的体外发酵液丙酸比例显著高于对照组(P < 0.05)，且槐花组与杭白菊组之间差异不显著(P>0.05)，香蕉花组与对照组之间差异不显著(P>0.05)。发酵6 h，对照组、香蕉花组的体外发酵液丁酸比例显著高于槐花组(P < 0.05)；发酵12 h时，对照组的体外发酵液丁酸比例显著高于槐花组(P < 0.05)。

3 讨论

目前多数学者以瘤胃pH在5.2~5.6、并且每天持续3 h作为诊断SARA的依据[28]。试验结果显示，高非纤维性碳水化合物底物中添加香蕉花、槐花和杭白菊的发酵液pH低于对照组，但香蕉花组与对照组差异不显著，且常规底物中香蕉花组各发酵时期的pH高于对照组，说明香蕉花能维持瘤胃液pH的稳定。而槐花与杭白菊使发酵液pH降低，可能与发酵液TVFA的浓度有关。

反刍动物碳水化合物的利用都是以VFA的形式，特别是其中的乙酸、丙酸、丁酸，可占TVFA总量的95%左右[21]。试验中植物添加组的体外发酵液TVFA浓度高于对照组；槐花组和杭白菊组的体外发酵液乙酸、丁酸比例低于对照组，体外发酵液丙酸比例高于照组；而香蕉花组的体外发酵液乙酸比例高于对照组，体外发酵液丙酸比例低于对照组。造成这一差异的原因可能是因为槐花和杭白菊内含有较高比例的易降解的糖。范文秀等[29]对槐花进行营养成分分析时指出，槐花还原糖的含量为4.12%。金潇潇[30]对多种菊花进行分析，发现菊花可溶性糖的含量介于1.86%~ 8.40%。葛永斌等[31]研究表明，杭白菊中果糖和葡萄糖含量分别为1.964%、1.712%，因此槐花和杭白菊在发酵时产生的丙酸更多。而香蕉花已经被证实含有大量的膳食纤维，且主要是不溶性纤维，所以发酵过程中容易产生更多的乙酸[10, 32]。

瘤胃酸中毒的原因十分的复杂，目前多数学者认为乳酸产生菌与乳酸利用菌的失衡导致乳酸在瘤胃中大量的蓄积是引起该病的主要原因[33]。本试验中，体外发酵12 h时，植物添加组的体外发酵液乳酸浓度均低于对照组，且杭白菊组与对照组之间差异显著，说明在瘤胃发酵过程中添加杭白菊能显著缓解乳酸的累积。研究报道，杭白菊主要活性成之一的挥发油，具有抑制革兰氏阳性菌及其他有害菌生长的作用[34]。而谢宝昌等[35]把杭白菊与瘤胃细菌混合培养时证明无抑制作用，同时纤维分解菌的药敏试验也无抑制作用，这可能是因为纤维分解菌主要为革兰氏阴性菌造成的。瘤胃中乳酸产生菌大多为革兰氏阳性菌，而乳酸利用菌多为革兰氏阴性菌，因此杭白菊中的挥发油可能抑制了乳酸产生菌的繁殖或者相较于乳酸利用菌而言产生菌的抑制作用更强，从而缓解了在体外诱导SARA情况下乳酸的堆积。

瘤胃液中的NH3-N浓度是反映瘤胃微生物对于饲粮中含氮物质的利用情况的重要指标。本试验中，体外发酵12 h时，各组的体外发酵液NH3-N浓度无显著差异。但在发酵的过程中3种植物添加物组的体外发酵液NH3-N浓度与对照组存在差异，这可能是因为槐花、香蕉花和杭白菊中含有丰富的氨基酸等含氮物质，总的含氮量超过对照组，且瘤胃微生物氮的分解作用大于微生物对于氨的利用，所以在最初的发酵液中NH3-N浓度会与对照组相比有所升高，但是随着发酵时间的延长，多余的氨也被瘤胃微生物利用，因此组间的差异不显著[10, 29, 36]。

4 结论

杭白菊能缓解瘤胃乳酸累积，而香蕉花则具有调控瘤胃pH相对恒定的能力，因此香蕉花和杭白菊在缓解瘤胃酸中毒方面有潜在价值。

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