2. 中国科学院大学, 北京 100008
2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100008, China
呕吐毒素,又称脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON),主要是镰刀菌属真菌在生长过程中的有毒次级代谢物[1]。霉菌的生长可以发生在植物生长的各个阶段,在粮食作物收割、仓储、加工、运输、销售、使用等各个环节均可能受到霉菌的污染。因此,DON广泛存在于受霉菌污染的花生、米糠、玉米、小麦、秸秆和油料等作物及它们的加工产品中。DON还有细胞毒性和遗传毒性,如影响细胞周期的分布,抑制细胞进入S期,使细胞停滞在G0/G1期,具有明显的抗增殖作用[2],且能诱导细胞发生凋亡[3-4],还能抑制生物大分子,如DNA、RNA、蛋白质的合成[5]。在动物上,DON能导致厌食、生长抑制、体重减轻、代谢紊乱等毒性症状[6-8]。在断奶仔猪中,饲粮中含DON降低了仔猪的生长性能、免疫功能和抗氧化能力,引起肠道的通透性增加、绒毛损伤、肠细胞凋亡和蛋白质合成的降低[9],还能诱导自噬[10]。目前有关DON脱毒处理主要为物理、化学和生物脱毒方法,但DON仍然难以避免,如何使其对仔猪生产危害最小至关重要。氯喹(CQ)是一种抗疟疾药物,具有明显的抗炎、抗氧化和器官保护作用[11],还能通过阻断自噬体融合和降解,具有抑制自噬的作用[12-14],具有较低的毒性。目前,它是临床治疗中唯一可用的自噬抑制剂。在硫酸葡聚糖钠(DSS)诱导的小鼠结肠炎模型中,CQ可显著延缓结肠长度缩短、炎症细胞浸润、组织损伤和体重减轻[15]。CQ抑制自噬以及同时发挥抗炎作用可能改善仔猪生长性能和血液生化指标,因此,本试验采用DON诱导断奶仔猪损伤模型,利用CQ抑制自噬,研究其对仔猪生长性能、脏器指数、血液生化指标和抗氧化能力的调控作用,以期为缓解DON的毒害作用提供参考。
1 材料与方法 1.1 试验材料禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum R6576)菌种由华中农业大学提供;CQ购自生工生物工程(上海)股份有限公司;雷帕霉素购自Sigma-Aldrich公司。
1.2 基础饲粮参照NRC(2012)营养需要、《中国饲料营养成分及营养价值表》(2015年第26版)和《猪饲养标准》(NY/T 65—2004)配制基础饲粮,其组成及营养水平见表 1。
配制马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA),121 ℃高压蒸汽灭菌20 min,冷却后在超净工作台接F.graminearum R6576菌种,置于28 ℃恒温培养箱中培养5~6 d,用接种针将菌丝打碎接种在220 mL羧甲基纤维素酯培养基(CMC)(1 L容量瓶中),使用恒温振荡摇床28 ℃、200 r/min培养7 d。然后将处理好的CMC液体培养基溶液按40 mL/kg均匀喷洒平铺于室内饲粮,搅拌混匀。处理过程中保持饲粮厚度适中,含水量均匀且相对湿度在20%左右,温度28 ℃左右,处理7 d。将霉变饲粮与基础饲粮按1 : 1混合均匀。试验周期为40 d,共处理饲粮3次,每次每组取样2份装入干净自封袋中,标记日期及组别,-20 ℃保存,用于检测DON含量。
1.4 动物试验和饲养管理选择24头初始体重[(7.10±0.58) kg]相近的健康长×大二元杂交猪,随机分为3组,分别为对照组(CON组,基础饲粮)、DON组(饲粮中含1.5 mg/kg DON)、DON+CQ组(饲粮中含1.5 mg/kg DON,并灌服CQ),每组8头,每头为1个重复。试验开始时各组均饲喂常规基础饲粮,CON和DON组灌服8 mL生理盐水;DON+CQ组灌服8 mL CQ(10 mg/mL),试验开始后第7天,DON和DON+CQ组饲喂含1.5 mg/kg DON的霉变饲粮,持续1周(保持CQ的添加),试验期共14 d。试验仔猪均单栏饲养于不锈钢代谢笼内,每天08:30、12:30和16:30各喂料1次,每天09:00灌服CQ或生理盐水1次,自由采食和饮水。试验期间每天准确记录每头猪的实际采食量,观察猪群健康情况。室内按常规程序进行清扫、消毒,并保持猪舍通风、清洁。
1.5 样品采集于试验第14天,随机从每组选取体重相近的猪6头,禁食12 h后通过颈静脉采血5 mL,血样室温放置2 h后再离心10 min(4 ℃、3 000 r/min),制备血清,-20 ℃冰箱保存;另采集5 mL置于含肝素钠的采血管中,室温静置2 h后再离心10 min(4 ℃、3 000 r/min),制备血浆,-20 ℃冰箱保存。采血后屠宰,打开腹腔分离出心脏、肝脏、脾脏和肾脏等主要器官,按各器官形状仔细剪除剥离其表面黏附的脂肪,用生理盐水清洗血污并吸干表面水分,然后用电子分析天平称量,精确到0.001 g。
1.6 测定指标及方法 1.6.1 生长性能和脏器指数试验开始第1天早晨对每头猪进行空腹称重,为初始体重,饲养14 d后再次空腹称重,记录猪的体重,并计算每组猪的平均日增重(ADG);记录每头猪每天的给料量和剩料量,计算每组猪的平均日采食量(ADFI)以及料重比(F/G)。脏器指数按如下公式计算:
脏器指数(%)=(脏器绝对重量/体重)×100。
1.6.2 血清生化指标测定采用BECKMAN公司CX4型全自动血液生化分析仪测定血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)活性及白蛋白(ALB)、尿素氮(UN)、葡萄糖(GLU)、肌酐(CREA)含量。
1.6.3 血清激素指标测定血清生长激素(GH)、胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)含量均按南京建成生物工程研究所的试剂盒说明进行测定。
1.6.4 血浆抗氧化能力测定分别采用黄嘌呤氧化酶-黄嘌呤反应法和还原型谷胱甘肽法测定血浆超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性,采用铁还原/抗氧化反应法测定血浆总抗氧化能力(T-AOC),2-硫代巴比妥酸法测定血浆丙二醛(MDA)含量。所有试剂盒均购于南京建成生物工程研究所,严格按照说明书进行操作。
1.7 数据分析试验数据用Excel 2013进行初步处理,采用SPSS 20.0统计分析软件中的单因子方差分析(one-way ANOVA)进行差异显著性检验,差异显著时采用Duncan氏法进行多重比较。P < 0.05为差异显著,试验数据以“平均值±标准误”表示。
2 结果 2.1 CQ抑制自噬对摄入DON污染饲粮仔猪生长性能和脏器指数的影响由表 2可知,与CON组相比,DON组仔猪ADG和ADFI显著降低(P < 0.05),DON+CQ组仔猪ADG和ADFI与其他2组均无显著差异(P>0.05),F/G显著低于DON组(P < 0.05)。由图 1可知,与CON组相比,DON组仔猪肝脏指数显著提高16.8%(P < 0.05),其余脏器指数组间无显著差异(P>0.05)。
由表 3可知,与CON组相比,DON组血清UN含量及ALT和ALP活性显著提高(P < 0.05),DON+CQ组血清UN含量和ALP活性显著低于DON组(P < 0.05)。
由图 2可知,与CON组相比,DON组血清GH和IGF-1含量显著降低(P < 0.05);DON+CQ组血清GH和IGF-Ⅰ含量显著高于DON组(P < 0.05),缓解DON的负面影响。
由表 4可知,与CON组相比,DON组血浆SOD、GST、GSH-Px活性和T-AOC显著降低(P < 0.05),而MDA含量显著升高(P < 0.05);DON+CQ组血浆SOD、GST、GSH-Px活性和T-AOC显著高于DON组(P < 0.05),MDA含量显著低于DON组(P < 0.05)。
DON会导致氧化应激、诱导细胞自噬、造成细胞凋亡和组织损伤[2-4, 10, 16-17]。据报道,自噬能调节抗氧化能力,其机制包括调节活性氧(ROS)形成和相关抗氧化酶活性,对于细胞在DON作用下的存活至关重要[18-20]。但过度自噬会使ROS过量增加,可能最终导致自噬障碍[21],从而造成细胞凋亡。
本研究采用CQ抑制自噬对DON诱导的仔猪生长抑制、脏器指数变化、血液生化影响和血浆抗氧化损伤进行干预作用。研究表明,DON可通过扰乱食欲肽[22]和IGF-Ⅰ分泌,并通过诱导细胞因子信号抑制物的表达,干扰GH的分泌,使机体分解代谢增强[15],不同程度地影响仔猪采食量和日增重[23-25]。本试验中,DON造成仔猪ADG显著降低,且肝脏发生增生病变,CQ抑制自噬在一定程度上减小了DON造成的生长抑制和肝脏增生。可能与CQ抑制自噬调节磷脂酶A2(PLA2)活性,减少脑组织病变,对脑损伤发挥保护作用[26]有关,CQ还可抑制炎症及免疫反应[12, 27-28],如缓解雄性小鼠酒精肝中毒[12],对肝脏有保护作用。在DON的刺激下,哺乳仔猪肝脏组织细胞内血清AST和ALT渗透到血液中,其活性显著升高[29]。DON还可通过干扰核糖体肽基转移酶的活性中心,而抑制蛋白质合成[30],增加蛋白质降解。本试验中,CQ能缓解DON造成的血清ALT和ALP活性升高以及ALB含量降低。这表明CQ抑制自噬对DON诱导的肝脏损伤有一定保护作用,增强其解毒功能,能抑制细胞内蛋白质的降解[31],有利于其合成代谢,缓解DON诱导的血液生化指标变化。
氧化应激是DON造成机体损伤的另一种已知机制,产生大量自由基[32-33]消耗体内抗氧化剂;同时DON抑制SOD、过氧化氢酶等抗氧化酶的活性,造成脂质过氧化和MDA等氧化标志物的过量产生,这些物质可使细胞膜结构产生严重损伤,破坏抗氧化平衡,使细胞功能紊乱[34]。本试验研究发现,DON使血浆中SOD和GSH活性减少,CQ治疗可恢复血浆SOD和GSH活性,降低MDA含量。这表明CQ抑制自噬增加血液中的抗氧化酶水平中和ROS,发挥抗氧化作用[31, 35]。CQ抑制自噬还能使一氧化氮(NO)含量升高,调节体内氧化与抗氧化系统平衡[35],适量的NO可以清除氧自由基,从而保护细胞膜,减轻组织损伤[36]。试验结果表明,CQ抑制自噬在抗氧化平衡,缓解DON诱导的氧化应激有重要作用。DON有遗传毒性、皮肤毒性、器官毒性,还可引起动物的肠道疾病,如造成肠上皮坏死、扰乱肠屏障功能和损伤免疫应答[37-38],而CQ能抑制自噬,同时还有抗炎、抗氧化应激的作用[27],后续研究CQ抑制自噬对DON诱导的肠屏障损伤干预作用,对进一步了解缓解DON毒害具有重要意义。
4 结论① DON摄入降低了仔猪生长性能,引起肝脏组织增生;CQ抑制自噬能缓解DON造成的仔猪生长抑制。
② DON处理导致血清生化指标变化显著,如血清UN含量及ALT和ALP活性显著增高,而血清GH和IGF-Ⅰ含量显著降低。CQ预处理能缓解DON的作用,改善血液生化以及生长素类激素指标,可能与其抑制自噬有关。
③ DON组血浆抗氧化酶活性降低,而MDA含量升高,造成仔猪抗氧化能力下降;CQ抑制自噬能提高抗氧化酶活性,提高机体抗氧化能力,一定程度上缓解DON诱导的氧化应激作用。
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