硒是动物机体必需的微量元素之一，能够保护机体免受氧化损伤，与动物的生长、繁殖和疾病预防密切相关[1]。然而，我国土壤严重缺硒，导致饲料原料中硒含量较低，易引发畜禽的硒缺乏症。目前饲粮中的硒主要以亚硒酸钠和酵母硒的形式添加，然而却存在吸收率低、潜在污染、毒性等问题[2]。纳米单质硒主要分为化学合成和生物转化2种形式，具有高活性和低毒性特点[3]。近年来研究发现，相较于化学合成的纳米单质硒，生物转化的纳米单质硒具有生物活性高、粒径分布均匀、形状规则、稳定性强等优势，且微生物发酵具有成本低、环保且高效等优点[4]。本课题组前期经多次筛选及纯化得到了1株Enterobacter cloacae Z0206菌株，可将10 mmol/L亚硒酸盐高效转化为红色纳米单质硒[5]。此外，用0.1 μmol/L Enterobacter cloacae Z0206生物纳米单质硒(BNS)处理猪上皮细胞显著提高了肠道抗氧化功能，并能保护肠道屏障结构和功能的完整[6]。本试验拟通过急性经口毒性试验来评价BNS的安全性，在此基础上采用耗竭-补偿法，在缺硒饲粮中补充亚硒酸钠、酵母硒和BNS 3种硒源，通过分析3种硒源对大鼠生长性能、组织硒沉积和抗氧化性能影响的差异，评价BNS的相对生物学效价，旨在为将其开发为一种安全高效的饲料添加剂提供理论基础。
1 材料与方法 1.1 试验材料BNS由本试验室自行制备。将活化的Enterobacter cloacae Z0206菌株接种于发酵培养基中，发酵培养基成分为：蔗糖25 g/L，酵母提取物5 g/L，胰蛋白胨5 g/L，三水合磷酸氢二钾2.62 g/L，磷酸二氢钾1 g/L，硫酸镁0.5 g/L；初始pH=7.5，发酵温度32 ℃，接种量1%(体积分数)，转速为250 r/min，亚硒酸钠添加浓度为10 mmol/L，发酵144 h，发酵结束后，-40 ℃、10 Pa冷冻干燥48 h，样品粉碎备用[4]。10 mmol/L亚硒酸钠发酵液中的总硒含量实测值为30 291 mg/kg，得到的BNS平均粒径为(139.43±7.44) nm[6]。亚硒酸钠购自美国Sigma-Aldrich公司，分析纯，含量>99%。酵母硒购自福邦酵母公司，硒含量实测值为2 100.67 mg/kg。硒含量检测参照GB/T 13883—2008《饲料中硒的测定》中的2, 3-二氨基萘荧光法，谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)活性检测试剂盒购于江苏凯基生物技术股份有限公司。
1.2 试验动物20只无特定病原体(SPF)级昆明小鼠(雌雄各占1/2)，体重18~22 g，购于广东省医学试验中心；84只清洁级Wistar雄性大鼠，体重(80±5) g，购于中科院上海斯莱克试验动物中心。试验鼠饲养于SPF级动物房，室温(22±1) ℃，相对湿度(60±5)%，明暗周期12 h : 12 h，试验鼠在动物房适应环境7 d，自由饮水，根据试验周期调整饮食。
1.3 BNS的安全性评价试验采用急性经口毒性试验的限量法，制备BNS最大溶解度溶液：将2.49 g BNS溶于100 mL蒸馏水中，其中硒浓度为0.75 mg/mL。间隔4 h分3次经口灌胃20只昆明小鼠，每次灌胃量为0.04 mL/g BW，试验前禁食14 h，自由饮水。灌胃结束1 h后给予正常饮食。连续观察14 d，记录小鼠中毒症状及死亡情况，试验结束后对小鼠进行剖检。
1.4 BNS的相对生物学效价评定将清洁级84只Wistar雄性大鼠随机分为硒缺乏组和对照组，硒缺乏组(60只)饲喂缺硒饲粮(硒含量为0.02 mg/kg，理论值)，缺硒饲粮组成及营养水平见表 1。对照组(24只)饲喂在缺硒饲粮基础上添加亚硒酸钠的饲粮(硒含量为0.15 mg/kg，理论值)，经过21 d硒耗竭期，2组随机各选6只屠宰取样，而后将硒缺乏组剩余大鼠54只随机分为3组，每组6个重复，每个重复3只，3只为1笼。3组大鼠分别饲喂在缺硒饲粮基础上添加亚硒酸钠、酵母硒和BNS的饲粮，饲粮中硒含量均为0.15 mg/kg，对照组继续饲喂原饲粮，进行为期35 d的硒补偿试验。
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表 1 缺硒饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the Se-deficient diet (air-dry basis) |
硒耗竭21 d结束后，各组选取6只大鼠屠宰取样。大鼠用乙醚麻醉，从腹主动脉采集血液于抗凝管中，于4 ℃、3 000 r/min离心15 min，取上清为血浆于EP管中，存于-80 ℃待测；采血结束后迅速取出肝脏、肾脏和肌肉样品，液氮速冻后-80 ℃保存。血浆和肝脏用于检测GPx活性，肝脏、肾脏和肌肉用于检测组织硒含量。同时，计算平均日采食量(ADFI)、平均日增重(ADG)和料重比(F/G)。
在补硒期的第7天、第21天和第35天，每组随机选取6只(每个重复各选1只)大鼠屠宰取样。采集大鼠血浆、肝脏、肾脏和肌肉样品，用于检测GPx活性和组织硒含量。以亚硒酸钠为标准参照物，选择血浆、肝脏GPx活性，肝脏、肾脏、肌肉硒含量作为判定指标，设定亚硒酸钠上述指标的相对生物学效价为100%，以补硒时间为横坐标，以GPx活性和组织硒含量为纵坐标进行回归分析并建立回归方程，采用斜率比法计算酵母硒和BNS的相对生物学效价。回归方程为：
Y=aX+b。
式中:Y为血浆、肝脏GPx活性，肝脏、肾脏、肌肉硒含量；X为补硒时间。
为了分析方便，组织硒含量在进行回归分析时将数据单位从mg/kg转换为μmol/kg。
1.5 数据处理与分析利用SPSS 21.0软件对试验数据进行分析，硒耗竭期的数据均采用t检验，其余数据采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，以P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异极显著。采用LSD法对组间数据进行多重比较，结果以平均值±标准误(mean±SE)表示；通过SPSS 21.0中的REG程序建立线性回归方程Y=aX+b，并进行显著性检验。
2 结果与分析 2.1 BNS的安全性评价由表 2可知，灌胃90.46 mg/kg BW BNS形式的硒后所有受试动物未见明显的中毒症状及死亡，经尸体剖检未发现明显的病理变化。结果显示，小鼠口服BNS的半数致死剂量(LD50)＞90.46 mg/kg BW(以硒计)。因此，BNS具有较好的安全性。
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表 2 BNS小鼠急性经口毒性试验结果 Table 2 Results of acute oral toxicity test of mouse for BNS |
由表 3可知，经过21 d的硒耗竭，与对照组相比，缺硒极显著降低了大鼠肝脏、肾脏和肌肉中硒含量(P＜0.01)，极显著降低了大鼠血浆和肝脏中GPx的活性(P＜0.01)，对大鼠末重、ADG、ADFI和F/G无显著影响(P＞0.05)。
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表 3 缺硒对大鼠生长性能、组织硒含量以及血浆和肝脏GPx活性的影响 Table 3 Effects of Se deficiency on growth performance, Se content in tissues and GPx activity in plasma and liver of rats |
由表 4可知，补硒35 d后，相比于亚硒酸钠组，BNS组和酵母硒组大鼠ADFI均显著提高(P＜0.05)；相比于亚硒酸钠组，BNS组大鼠末重、ADG有所提高，F/G降低有所降低，但差异均未达显著水平(P＞0.05)，酵母硒组也有相同的变化。结果提示，补充BNS能提高缺硒大鼠的采食量，BNS与酵母硒有同等效果。
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表 4 补充不同硒源对大鼠生长性能的影响 Table 4 Effects of supplementary different Se sources on growth performance of rats |
由表 5可知，随着补硒时间的延长，3种不同硒源处理的大鼠肝脏、肾脏以及肌肉中硒含量均增加。其中，肌肉中硒含量在补硒21 d时，3组基本恢复至对照组水平，在补硒35 d时，BNS组肌肉中硒含量极显著高于其他3组(P＜0.01)；肾脏中硒含量在补硒35 d时，3组均恢复至对照组水平，且BNS组和酵母硒组肾脏中硒含量均极显著高于亚硒酸钠组(P＜0.01)；肝脏中硒含量在补硒35 d时，3组均恢复至对照组水平。结果提示，缺硒大鼠在补硒一段时间后组织硒沉积能恢复至正常水平，且添加BNS的效果优于亚硒酸钠和酵母硒。
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表 5 不同硒源及补硒时间对大鼠组织硒含量的影响 Table 5 Effects of different Se sources and supplementary Se time on Se content in tissues of rats |
由表 6可知，随着补硒时间的延长，大鼠肝脏和血浆中GPx活性持续增加。补硒35 d时，经3种硒源处理的大鼠肝脏和血浆中GPx活性均恢复至对照组水平。与亚硒酸钠组和酵母硒相比，BNS组大鼠肝脏和血浆中GPx活性有所升高，但差异不显著(P＞0.05)。结果提示，缺硒大鼠在补硒一段时间后血浆和肝脏GPx活性能恢复至正常水平，且添加BNS的效果优于亚硒酸钠和酵母硒。
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表 6 不同硒源及补硒时间对大鼠血浆和肝脏GPx活性的影响 Table 6 Effects of different selenium sources and supplementary time on GPx activity in plasma and liver of rats |
由表 7、表 8可知，以亚硒酸钠为参比，建立大鼠血浆和肝脏中GPx活性，肝脏、肾脏、肌肉中硒含量与补硒时间的回归方程，并将BNS和酵母硒回归方程的斜率与亚硒酸钠相比，得到BNS的相对生物学效价分别为112.2%、114.6%、102.0%、155.3%、143.2%，酵母硒的相对生物学效价分别为101.1%、101.7%、103.4%、149.4%、110.6%。结果提示，相比于亚硒酸钠，BNS具有更高的相对生物学效价。
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表 7 大鼠血浆和肝脏中GPx活性、组织硒含量与补硒时间之间的回归分析 Table 7 Regression analysis between plasma and liver GPx activity, tissue Se content of rats and supplementary Se time |
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表 8 BNS和酵母硒的相对生物学效价 Table 8 Relative bioavailability of BNS and Yeast-Se |
亚硒酸钠是常用的硒源饲料添加剂之一，其对小鼠的LD50为10.8 mg/kg BW(以硒计)，具有一定的毒性[7]；Wang等[8]通过急性毒性试验得出硒代蛋氨酸对小鼠的LD50为25.6 mg/kg BW(以硒计)，化学合成纳米单质硒对小鼠的LD50为92.1 mg/kg BW(以硒计)，且化学合成纳米硒在36 mg/kg BW剂量下引起小鼠10%死亡，在高剂量150 mg/kg BW时引起小鼠70%死亡。强佳丽等[9]开展的富有机硒产品急性毒性试验结果表明，其对小鼠的LD50为63.6 mg/kg BW(以硒计)，且小鼠体征表现有濒死的抽搐、轻微的呼吸困难、腹泻等症状。本试验结果显示BNS灌胃剂量达到90.46 mg/kg BW(以硒计)，小鼠死亡率为0，且LD50高于上述其他几种硒产品。因此，BNS具有更高的安全性。
3.2 缺硒对大鼠生长性能、组织硒含量以及血浆和肝脏GPx活性的影响Venardos等[10]给雄性Wistar大鼠饲喂含有0、50、240和1 000 μg/kg亚硒酸钠的饲粮5周后发现，含硒和不含硒的饲粮不会影响动物的采食量和生长速度。本试验结果表明，缺硒21 d未对大鼠生长性能造成显著影响。这可能是由于21 d的硒耗竭时间较短，大鼠体内的内源硒不能完全消耗，机体仍然可以通过代偿功能而保持正常生理功能。缺硒会对机体造成影响。GPx的活性和组织中硒含量可以作为判断机体是否缺硒的敏感指标，Yan等[11]在给SD大鼠饲喂缺硒饲粮56 d后，血浆和肝脏中的GPx的活性显著下降；Erkekoglu等[12]发现给大鼠饲喂4周的缺硒饲粮后，大鼠肝脏，肾脏和血浆中的Se浓度显着降低，血清中GPx活性显著降低，肝脏GPx1活性降低93%，肾脏GPx1活性降低80%。本试验结果显示，在给大鼠饲喂缺硒饲粮21 d后，血浆和肝脏中GPx活性极显著降低，且肝脏、肾脏和肌肉中硒含量也极显著降低，表明缺硒会显著降低硒在组织中的沉积和含硒酶的活性。
3.3 BNS对大鼠生长性能的影响纳米单质硒在饲粮中的应用能一定程度上提高动物的生长性能。夏枚生等[13]研究表明，在肉鸡饲粮中添加0.4~1.0 mg/kg的化学合成纳米单质硒时，肉鸡的生长性能显著提高，且效果优于亚硒酸钠；Hu等[14]研究表明，在饲粮中添加化学合成纳米单质硒后，肉鸡的平均日增重显著提高。本研究发现，补硒一定时间后，相比于亚硒酸钠，酵母硒和BNS能够一定程度提高大鼠的末重、显著提高平均日采食量、提高平均日增重，降低料重比，且BNS的效果要优于酵母硒。
3.4 BNS对大鼠组织硒沉积的影响诸多研究表明纳米单质硒能改变机体的硒沉积，在肉鸡上的研究表明，化学合成纳米硒在肝脏和肾脏中的沉积与亚硒酸钠相比不显著，而在肌肉中的沉积则显著高于亚硒酸钠[15]；王福香等[16]报道，添加0.30~1.20 mg/kg纳米硒组肉鸡肝脏中硒含量极显著高于对照组和添加0.15 mg/kg纳米硒组，肝脏硒含量随着纳米硒添加水平的增加呈二次曲线关系。本研究中BNS组大鼠肾脏和肌肉中硒含量(硒沉积)显著高于亚硒酸钠组，在肌肉中的沉积与上述文献报道一致，在肾脏中的沉积高于亚硒酸钠组的结果未见报道；而BNS组大鼠肝脏中硒含量(硒沉积)与亚硒酸钠组相比并未达到显著水平，造成这种差异的原因可能与动物的种类、补硒时间的长短和饲粮中硒含量相关。以上结果表明，BNS能促进大鼠组织硒沉积，尤其是在肾脏和肌肉中。
3.5 BNS对大鼠血浆和肝脏中GPx活性的影响纳米单质硒能显著提高含硒氧化酶的活性，Shi等[17]报道，饲粮中添加不同硒源能够显著提高公山羊血清抗氧化能力，其中化学合成纳米单质硒组血浆GPx、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性显著高于亚硒酸钠组。韩飞[18]报道，饲粮中添加酵母硒能极显著提高大鼠血清中GPx活性，当添加量为0.20 mg/kg时，血清中GPx活性提高20.07%。本研究结果表明，大鼠缺硒后血浆和肝脏中GPx活性极显著下降，通过补充不同的硒源，大鼠血浆和肝脏中GPx活性显著升高，最终在补硒35 d时达到对照组水平，且BNS优于亚硒酸钠。
3.6 BNS的相对生物学效价耗竭-补偿法常用来评价一种营养素的相对生物学效价。罗培林等[12]对酵母硒进行了相对生物学效价评定，相对于亚硒酸钠，以血清GPx活性以及肝脏、肾脏和肌肉硒沉积为评价指标，得到酵母硒的相对生物学效价分别为95.9%、127.5%、114.5%和101.2%，与本研究结果基本一致；韩飞[18]报道，相对于亚硒酸钠，以血清GPx活性以及血清、肾脏和肝脏硒沉积为评价指标，得到酵母硒的相对生物学效价分别为132.1%、205.7%、140.0%和107.2%，略高于本研究结果，可能与酵母硒产品不同有关。而前人对生物纳米单质硒的生物学效价的评定鲜有报道。本研究结果显示，相对于亚硒酸钠，以血浆和肝脏中GPx活性，肝脏、肾脏、肌肉中硒含量为评价指标，得到BNS的相对生物学效价分别为112.2%、114.6%、102.0%、155.3%、143.2%，说明BNS的生物利用度高于亚硒酸钠。
4 结论本试验可得出BNS的LD50＞90.46 mg/kg BW(以硒计)，大鼠缺硒后，补充BNS能够提高大鼠的采食量、抗氧化酶GPx的活性，有效提高硒在组织中沉积，且BNS的相对生物学效价优于亚硒酸钠和酵母硒。
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