2. 陕西杨凌富仕特饲料有限公司, 杨凌 712100
2. Shaanxi Yangling Firstfeed Co., Ltd., Yangling 712100, China
随着饲料行业的快速发展,大量的农作物副产品进入饲料市场。玉米深加工产业作为21世纪的“黄金产业”,有200余种深加工产品[1]。玉米皮作为玉米深加工的副产品之一,由于纤维含量高而难以被动物直接利用。米糠主要由粗纤维、木质素和粗灰分组成[2],因纤维含量较高,同样无法被动物高效利用[3]。微生物发酵技术能够通过微生物的作用提高低品质农副产品的营养价值,更好地促进动物的生长发育[4-5]。
饲用益生菌作为解决粗饲料短缺问题的途径之一受到广泛关注。现阶段微生物发酵常用的发酵菌种有枯草芽孢杆菌、乳酸菌和酵母菌等。其中,乳酸菌可以通过产生乳酸降低发酵原料的pH,达到抑制有害病原菌定植生长的目的[6-7];并释放各种酶类以及维生素、必需氨基酸,提高矿物质活性,帮助消化,减轻肠道吸收不良的状况,改善营养水平[8]。酵母菌主要改善风味,提高饲料的适口性[9],改善动物肠道健康水平,提高动物生产性能和免疫功能[10]。枯草芽孢杆菌可降解饲料中的纤维素,提高饲料利用率[11],作为好氧菌,其进入肠道后,会大量消耗胃肠道中的氧,抑制有害菌的生长[12]。黑曲霉菌可分泌纤维素酶,用于降解纤维素,可分泌淀粉酶、蛋白酶、果胶酶以及糖化酶等,还可以产生有机酸,提高其饲料营养价值[13];且因其生物特性,还可以吸附重金属及一些毒素,有效降低饲料中有毒物质的毒副作用[14-15]。
本研究旨在开发高效的复合益生菌菌剂,降解玉米皮-米糠中的粗纤维,为利用微生物菌剂开发低价值粗饲料资源提供参考。试验以乳酸菌、酵母菌、芽孢杆菌和黑曲霉菌为复合菌剂,有氧条件下发酵9 d,在发酵期内动态采集样品,进行pH、干物质、活菌数、粗蛋白质、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维以及还原糖含量的变化测定,以期评价玉米皮-米糠在整个发酵期内营养指标的动态变化过程,旨在为农业发展中农副产品等的高效利用提供思路,也为扩大动物饲料来源问题提供可行性方案。
1 材料与方法 1.1 试验材料菌种采用本实验室贮藏的乳酸菌3株,包括植物乳杆菌(L. plantarum)NBRC 15891、L. plantarum CIP 103151和短乳杆菌(L. brevis)ATCC 14869,菌株从青贮玉米、酵素和山羊皱胃中分离;酵母菌3株,包括S. sp. WW-W23、酿酒酵母(S. cerevisiae)ySR128和S. cerevisiae X55,菌株从青贮玉米、青贮剂和山羊瘤胃中分离;芽孢杆菌6株,包括枯草芽孢杆菌(B. subtilis)IAM 12 118、B. subtilis DSM 10、B. subtilis IAM 12 118、B. subtilis 168、B. cereus CCM 2 010和B. subtilis JCM 1 465,菌株从青贮玉米、山羊瘤胃、土壤中分离。黑曲霉菌1株,黑曲霉子囊菌属(Ascomycota sp.)ARIZ CVAsh3-10,菌株获赠于西北农林科技大学资源环境学院。
溶菌肉汤(LB)液体培养基:10 g蛋白胨、5 g酵母提取物、5 g氯化钠,溶于1 L蒸馏水,121 ℃高温高压灭菌。
乳酸细菌(MRS)液体培养基:10 g蛋白胨、5 g酵母提取物、20 g葡萄糖、10 g牛肉膏、5 g乙酸钠、2 g柠檬酸三铵、2 g磷酸二氢钾(KH2PO4)、0.25 g硫酸锰(MnSO4)、0.58 g硫酸镁(MgSO4)、l mL吐温80,溶于1 L蒸馏水,121 ℃高温高压灭菌。
马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)液体培养基:马铃薯去皮洗净后称取200 g切成条形或者块状,蒸馏水煮沸0.5 h以上,用纱布过滤,再加入20 g葡萄糖溶于1 L蒸馏水,121 ℃高温高压灭菌。
查氏培养基:3 g硝酸钠、1 g磷酸氢二钾(K2HPO4)、0.5 g七水合硫酸镁(MgSO4·7H2O)、0.5 g氯化钾、0.01 g硫酸亚铁、30 g蔗糖、1 000 mL蒸馏水,加热溶解,分装后121 ℃高温高压灭菌20 min。
1.2 试验设计在本课题组王德光[16]试验的基础上,筛选出2组较优组合,其中乳酸菌、芽孢杆菌、酵母菌、黑曲霉菌接种比例分别为5%、1%、5%、3%(3%组)和5%、1%、5%、5%(5%组)。3株乳酸菌、6株芽孢杆菌、3株酵母菌和1株黑曲霉菌分别按等比例混合接种,种子液接种活菌数大于108 CFU/g,发酵采用15 t的大堆进行工厂生产式发酵,发酵温度在常温条件下,接种发酵时间9 d,采样时间点为第0(未发酵原料)、1、2、3、5、7和9天的10:00。玉米皮、棉籽粕、米糠、红糖为陕西杨凌富仕特饲料有限公司提供,尿素为市购,玉米皮-米糠混合原料的配比按照玉米皮67.0%、米糠17.4%、棉籽粕15.0%、红糖0.3%、尿素按照0.3%比例混合备用,料水比设定为30%。
1.3 测定指标及方法称取5 g样品加45 mL蒸馏水在250 mL锥形瓶中充分振荡30 min,用pH计测定溶液pH。水分含量测定参照GB/T 6435—2014《饲料中水分的测定》,活菌数的测定参照GB 4789.35—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》和GB 4789.15—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验霉菌和酵母》,粗蛋白质含量的测定方法测定参照GB/T 6432—2018《饲料中粗蛋白质的测定》,中性洗涤纤维含量的测定参照GB/T 20806—2006《饲料中中性洗涤纤维的测定》,酸性洗涤纤维含量的测定参照NY/T 1459—2007《饲料中酸性洗涤纤维的测定》。还原糖含量的测定参考河南宏翔生物科技有限公司《发酵饲料中可溶性还原糖和总糖的测定》,编号:HXSW/QC 05—2012。
1.4 数据统计与分析数据统计与分析采用SPSS 20.0统计软件进行单因素方差分析和Duncan氏法多重比较。图中差异性表示为:组内不同时间点与第0天数据差异用*表示,*表示P<0.05,* *表示P<0.01,* * *表示P<0.001;组间同一时间点数据差异用#表示,#表示P<0.05,##表示P<0.01,###表示P<0.001。
2 结果与分析 2.1 原料的组分及营养水平为了评估玉米皮-米糠混合原料营养水平的实测值与配比后理论值(计算值)的一致性,分别测定了单个原料和玉米皮-米糠混合原料样品的营养水平,结果发现,按照添加比例计算的玉米皮-米糠混合原料样品的理论值为粗蛋白质含量19.72%,粗纤维含量23.25%,粗灰分含量7.27%;玉米皮-米糠混合原料样品实测值为粗蛋白质含量20.53%,粗纤维含量23.76%,粗灰分含量7.60%,各指标的理论值与实测值之间无明显差异,其中粗蛋白质的理论值低于实测值可能与添加了少量的尿素有关。
如图 1所示,在有氧发酵期间,第1天~第5天2组pH均稳定在4.6左右,第5天~第7天pH呈对数增长,3%组pH升高0.3左右,5%组pH则升高了0.5左右,第7天时2组pH达到最高,随后呈下降趋势。
如图 2所示,2组干物质含量第1天时均呈现增长趋势,但差异不显著(P>0.05),第1天~第2天干物质含量开始下降。3%组干物质含量在第3天时又有一定的上升趋势,第3天~第5天,干物质含量持续下降,纵观整个变化曲线,发现发酵时间应控制在7 d内,减少干物质含量的损失。
如表 2所示,2组的活菌数一直保持较快增长。3%组的乳酸菌的初始活菌数为3.3×105 CFU/g,酵母菌的初始活菌数为5.5×105 CFU/g,发酵开始后,活菌数一直保持对数增长,第9天乳酸菌的活菌数达到4.0×108 CFU/g,酵母菌的活菌数达到8.8×108 CFU/g。5%组的乳酸菌的初始活菌数为5.5×105 CFU/g,酵母菌的初始活菌数为5.8×105 CFU/g,发酵开始后,活菌数也一直保持对数增长,第9天乳酸菌的活菌数达到8.8×108 CFU/g,酵母菌的活菌数达到5.0×109 CFU/g。2组发酵后第9天活菌数都超过108 CFU/g。
如图 3所示,2组的粗蛋白质含量在第1天~第2天快速增长,3%组增长率为40%,5%组增长率为35%。在第2天~第3天呈下降趋势,第9天粗蛋白质含量相比第0天增长了30.0%。而5%组的粗蛋白质含量第3天后缓慢增长直到第9天,粗蛋白质含量相比第0天增长了37.8%。3%组和5%组第1天~第9天的粗蛋白质含量均显著或极显著高于第0天(P<0.05或P<0.01)。
如图 4所示,3%组的中性洗涤纤维含量在第1天~第2天保持缓慢下降趋势,在第2~第3天有略微的回升,第3天之后开始迅速下降,第7天起变化保持稳定。5%组的中性洗涤纤维变化较3%组不同,5%组的中性洗涤纤维含量随时间在持续下降,而到第7天之后中性洗涤纤维含量基本保持稳定,在第9天时有略微的上升。3%组和5%组第2天~第9天的中性洗涤纤维含量均显著或极显著低于第0天(P<0.05或P<0.01),发酵第9天,3%组和5%组中性洗涤纤维含量分别降低了30.84%和29.04%。3%组第3天的中性洗涤纤维含量极显著高于5%组(P<0.01),而第5天的中性洗涤纤维含量显著低于5%组(P<0.05)。
如图 5所示,3%组的酸性洗涤纤维含量随时间的变化保持下降趋势,在第3天~第5天时出现了短暂的平台期,第5天之后酸性洗涤纤维的含量又开始降低,第7天之后酸性洗涤纤维的含量保持稳定。5%组的酸性洗涤纤维含量第1天~第5天下降趋势较3%组缓慢,第5天~第7天迅速下降,第7天时5%组的酸性洗涤纤维含量比3%组低1.8%。3%组和5%组第3天~第9天的酸性洗涤纤维含量均显著或极显著低于第0天(P<0.05或P<0.01),发酵第9天,3%组和5%组酸性洗涤纤维含量分别降低了24.25%和30.53%。
如图 6所示,3%组前期曲线呈现S型,还原糖含量在第3天~第5天时增长较快。5%组的还原糖含量在第1天~第2天含量基本稳定,在第2天之后开始逐渐上升,发酵第9天,3%组和5%组还原糖含量分别提升了151.85%和170.37%。3%组和5%组第2天~第9天的还原糖含量均显著或极显著高于第0天(P<0.05或P<0.01)。3%组第9天的还原糖含量显著低于5%组(P<0.05)。
本试验利用前期优化筛选出的饲用复合菌剂进行玉米皮-米糠混合原料的发酵,在前期试验基础上,筛选出2组较优组合,按照黑曲霉菌的添加比例不同,设置为3%组和5%组。试验以期利用微生物发酵技术提高低价值的玉米皮和米糠的饲料品质。
乳酸菌是一类将碳水化合物发酵产生乳酸的菌种[17]。由于乳酸作用,使得发酵保持一个较低的酸性环境,从而抑制了杂菌的生长,同时提高了饲料适口性[18]。樊振等[19]研究发现,添加乳酸菌发酵青贮玉米与不加菌的青贮玉米相比,pH明显下降,且霉菌数量低。本试验结果发现,乳酸菌的添加快速降低了饲料的pH,通过动态监测发现,pH在发酵前期基本保持稳定,在第5天~第7天有明显的上升,这个可能是由于部分乳酸菌的死亡,使产生的乳酸减少,导致发酵产物的pH升高。
微生物代谢过程产生的纤维素酶,能够降解农副产品中的纤维含量,提高饲料的品质,粗蛋白质含量和粗纤维含量是评价饲料品质的重要指标。茹婷等[20]利用酵母菌J3发酵玉米秸秆,结果表明酵母菌对于降低粗纤维效果贡献不大。而兴丽等[18]研究发现,添加乳酸菌发酵全株玉米青贮可以使中性洗涤纤维含量降低1.85%。易安妮等[21]利用复合菌种发酵玉米秸秆6 d后,粗纤维的降解率为26.68%。本试验利用饲用复合菌剂发酵玉米皮-米糠混合原料,3%组的中性洗涤纤维含量在第9天降低了30.0%,而5%组降低了37.8%。说明本试验所用菌种在降解纤维方面效果良好。
本试验中,在整个发酵过程中粗蛋白质含量呈现总体的上升趋势。这与安文亭等[22]利用微生物发酵甘薯渣研究结果一致,说明通过微生物发酵可以显著提高粗蛋白质含量,主要是微生物代谢产生的菌体蛋白导致的。季彬等[23]研究表明,固态发酵后的产品粗蛋白质含量均有提高,而其提高的来源主要有2部分:一是非蛋白氮转化成蛋白质;二是非蛋白质物质的损耗。这也是本试验干物质含量在发酵后期降低的主要原因。但粗蛋白质含量在第1天~第2天的增长之后出现了下降,这可能是因为在经过2 d的发酵后玉米皮-米糠混合原料中的微生物、复合菌等开始利用部分饲料自身的粗蛋白质,导致粗蛋白质含量有所下降。而在第7天之后粗蛋白质含量上升的原因可能是因为玉米皮-米糠混合原料中的微生物开始死亡裂解,释放部分菌体蛋白致使粗蛋白质含量有所上升,这一结论也可以验证玉米皮-米糠混合原料发酵过程中pH的动态变化。饲用复合菌剂发酵玉米皮-米糠混合原料后还原糖含量较发酵之前有显著提升,2组还原糖含量分别提升151.85%和170.37%,总体含量在2.31%~3.62%之间浮动,这与李慧芬等[24]研究结果中还原性糖含量的变化相比较有所偏低,这可能与发酵时间、温度以及菌剂有关。在活菌数方面,2组中活菌数均逐渐升高,这可能与菌种之间的竞争有关。此外,在发酵玉米皮-米糠混合原料时,最佳时间为第5天~第7天,在7 d内发酵效果较好且干物质损失较少,超过7 d虽然发酵产物的粗纤维含量还会继续下降,但干物质损失严重。因此,确定最佳发酵时间为7 d。综上可得,玉米皮-米糠混合原料的发酵时间应该保持在7 d以内,可以使得效益最大化。
4 结论本试验采用动态监测的方式系统地表明复合菌剂发酵能够有效提高玉米皮-米糠混合原料的饲料品质,能够有效降低中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维的含量,提高粗蛋白质、还原糖含量和活菌数,随着发酵时间的增长,干物质含量在整个过程中有轻微损失。通过比较2组的发酵结果,5%组的发酵效果优于3%组,结合前期的试验,最终可以确定乳酸菌、芽孢杆菌、酵母菌和黑曲霉菌最佳组合比例为5%、1%、5%和5%。
[1] |
马村, 门洪文, 张栋, 等. 玉米种业发展现状、趋势与应对策略[J]. 农业工程技术(综合版), 2018(4): 22-24. |
[2] |
刘磊, 李福昌, 杨鹏程, 等. 饲料粗纤维、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维残渣中各成分的研究[J]. 动物营养学报, 2018, 30(3): 1044-1051. DOI:10.3969/j.issn.1006-267x.2018.03.029 |
[3] |
RAJOKA M I, AHMED S, HASHMI A S, et al. Production of microbial biomass protein from mixed substrates by sequential culture fermentation of Candida utilis and Brevibacterium lactofermentum[J]. Annals of Microbiology, 2012, 62(3): 1173-1179. DOI:10.1007/s13213-011-0357-8 |
[4] |
XIE P J, HUANG L X, ZHANG C H, et al. Nutrient assessment of olive leaf residues processed by solid-state fermentation as an innovative feedstuff additive[J]. Journal of Applied Microbiology, 2016, 121(1): 28-40. DOI:10.1111/jam.13131 |
[5] |
成娟丽, 林金水. 布氏乳杆菌与不同乳酸菌联用对玉米青贮发酵、干物质回收率和营养价值的影响[J]. 中国饲料, 2018(20): 20-24. |
[6] |
ANTHONY A A, ADEKUNLE C F, THOR A S. Residual antibiotics, antibiotic resistant superbugs and antibiotic resistance genes in surface water catchments:public health impact[J]. Physics and Chemistry of the Earth, 2018, 105: 177-183. DOI:10.1016/j.pce.2018.03.004 |
[7] |
DJUKIĆ-VUKOVIĆ A P, MOJOVIĆ L V, SEMEN ČENKO V V, et al. Effective valorisation of distillery stillage by integrated production of lactic acid and high quality feed[J]. Food Research International, 2015, 73: 75-80. DOI:10.1016/j.foodres.2014.07.048 |
[8] |
VINUSHA K S, DEEPIKA K, JOHNSON T S, et al. Proteomic studies on lactic acid bacteria:a review[J]. Biochemistry and Biophysics Reports, 2018, 14: 140-148. DOI:10.1016/j.bbrep.2018.04.009 |
[9] |
PUNIYA A K, SALEM A Z M, KUMAR S, et al. Role of live microbial feed supplements with reference to anaerobic fungi in ruminant productivity:A review[J]. Journal of Integrative Agriculture, 2015, 14(3): 550-560. DOI:10.1016/S2095-3119(14)60837-6 |
[10] |
赵川东, 朱廷恒, 刘茂锋, 等. 酵母源生物饲料添加剂的应用现状及展望[J]. 饲料与畜牧, 2014(6): 27-30. |
[11] |
ZOKAEIFAR H, BALCÁZAR J L, SAAD C R, et al. Effects of Bacillus subtilis on the growth performance, digestive enzymes, immune gene expression and disease resistance of white shrimp, Litopenaeus vannamei[J]. Fish & Shellfish Immunology, 2012, 33(4): 683-689. |
[12] |
ZHOU S, SONG D L, ZHOU X F, et al. Characterization of Bacillus subtilis from gastrointestinal tract of hybrid Hulong grouper (Epinephelus fuscoguttatus×E.lanceolatus) and its effects as probiotic additives[J]. Fish & Shellfish Immunology, 2019, 84: 1115-1124. |
[13] |
刘艳新, 刘占英, 倪慧娟, 等. 微生物发酵饲料的研究进展与前景展望[J]. 饲料博览, 2017(2): 15-22. DOI:10.3969/j.issn.1001-0084.2017.02.005 |
[14] |
张熙, 韩双艳. 黑曲霉发酵产酶研究进展[J]. 化学与生物工程, 2016, 33(1): 13-16. DOI:10.3969/j.issn.1672-5425.2016.01.003 |
[15] |
COUSIN F J, FOLIGNÉ B, DEUTSCH S M, et al. Assessment of the probiotic potential of a dairy product fermented by Propionibacterium freudenreichii in piglets[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2012, 60(32): 7917-7927. DOI:10.1021/jf302245m |
[16] |
王德光.饲用菌种(株)的分离鉴定及复合菌剂降解玉米皮-统糠粗纤维的效果研究[D].硕士学位论文.杨凌: 西北农林科技大学, 2017. http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-10712-1017091395.htm
|
[17] |
ABDEL-RAHMAN M A, TASHIRO Y, SONOMOTO K. Recent advances in lactic acid production by microbial fermentation processes[J]. Biotechnology Advances, 2013, 31(6): 877-902. DOI:10.1016/j.biotechadv.2013.04.002 |
[18] |
兴丽, 韩鲁佳, 刘贤, 等. 乳酸菌和纤维素酶对全株玉米青贮发酵品质和微生物菌落的影响[J]. 中国农业大学学报, 2004, 9(5): 38-41. DOI:10.3321/j.issn:1007-4333.2004.05.008 |
[19] |
樊振, 马贵军, 姚峻, 等. 不同发酵类型乳酸菌对玉米青贮发酵品质的影响[J]. 饲料研究, 2014(1): 43-45. |
[20] |
茹婷, 纪亿, 赵丽梅, 等. 益生菌发酵处理玉米秸秆效果研究[J]. 畜牧与饲料科学, 2015, 36(11): 25-26. |
[21] |
易安妮, 江珊珊, 梁恩, 等. 利用多菌种固态发酵降解玉米秸秆[J]. 东北农业科学, 2011, 36(2): 47-50. |
[22] |
安文亭, 孙展英, 刘树栋, 等. 固态发酵甘薯渣增值效果的研究[J]. 饲料研究, 2015(10): 60-64. |
[23] |
季彬, 祁宏山, 王治业, 等. 微生物促生剂发酵玉米皮生产饲料蛋白研究[J]. 中国酿造, 2017, 36(1): 107-110. |
[24] |
李慧芬, 马成. 纤维产品经微生物发酵前后的营养价值研究[J]. 中国饲料, 2017(6): 39-43. |