2. 河南科技学院动物科技学院, 新乡 453003
2. College of Animal Science and Veterinary Medicine, Henan Institute of Science and Technology, Xinxiang 453003, China
脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)又称呕吐毒素，是一种高毒性的次级代谢产物，属于真菌毒素，主要由禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)和黄色镰刀菌(Fusarium culmorum)产生[1-2]，其化学名为3α, 7α, 15-三羟基草镰孢菌-9-烯-8-酮，属B族单端孢霉烯族化合物[3-4]，结构为四环倍半萜，分子式为C15H20O6，相对分子相对量为296.32[5]。DON的分子结构式如图 1所示。
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图 1 DON的分子结构式 Fig. 1 Molecular structure of DON |
全球范围内的小麦、大麦和玉米等粮谷类农作物均受到DON污染[6]。它易引起动物拒食，可表现出免疫毒性、器官毒性、抑制蛋白质合成以及致畸性，且与免疫抑制、克山病、食管癌等疾病也有密切联系[7-9]。因此，DON污染饲料不仅带来动物健康的问题，而且能通过其在食品中的积累严重威胁人的健康[10]。鉴于其严重的毒性影响，欧盟委员会(EC)公布的人类对DON的每日最大可耐受摄入量为1 μg/kg BW，欧盟(EU)设置了未加工谷物和食品中DON含量最大值分别为1 250和750 ng/g，中国规定玉米、小麦及其制品中DON含量最大值为1 000 ng/g[11]。
目前，有多种理化分析方法可用于检测食品和饲料中DON污染，主要包括薄层色谱(TLC)、高效液相色谱(HPLC)、气相色谱(GC)、质谱(MS)、气相色谱-质谱联用(GC-MS)、高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS)等方法[12-14]。这些方法具有高精度和高灵敏度，但需要更多的时间和成本来达到可接受的分析精度，并且具有仪器设备昂贵、样品前处理复杂、需要熟练的技术人员、不适合筛选大量样品等缺点。相反，免疫分析方法，如传统的酶联免疫吸附测定(ELISA)[15]、化学发光酶免疫分析(CLEIA)[16]、荧光偏振免疫分析(FPIA)[17]、时间分辨荧光免疫分析(TRFIA)[18]、胶体金免疫层析法(GICA)[19]等，因具有简单、特异、低成本和能执行高通量筛选等优点，已被广泛应用于DON的检测。此外，有些ELISA快速检测技术也受到了越来越多的关注，它是一种已被消费者和检疫人员接受的替代或补充检测方法[20]，如表面等离子体共振(SPR)免疫分析[21]、银染色-胶体金(GICA)[22]、纳米-ELISA[23]和免疫传感器等。由于真菌毒素污染的普遍性和大量的样品需要分析，ELISA试剂盒被认为是检测真菌毒素的一种合适的筛选工具。本试验拟组装并调试一种新的DON间接竞争酶联免疫吸附测定(icELISA)试剂盒，对其进行各项性能测定，并用HPLC法验证其正确性，为研制具有灵敏度高、特异性强、定量好、能筛选大量DON污染样品的ELISA试剂盒奠定基础。
1 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 试剂DON(纯度≥98%)、3-乙酰基-脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3-Ac-DON，96%)、15-乙酰基-脱氧雪腐镰刀菌烯醇(15-Ac-DON，96%)、雪腐镰刀菌烯醇(NIV，97%)、镰刀菌酮-X(fusarenon-X，95%)、T-2毒素(98%)、玉米赤霉醇(ZER，97%)、黄曲霉毒素B1(AFB1，98%)等标准品均为Sigma-Aldrich公司产品，牛血清白蛋白(BSA，96%)、鸡卵清蛋白(OVA，98%)、N, N'-羰基二咪唑(CDI，98%)、1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC，98%)、弗氏完全佐剂(FCA)、弗氏不完全佐剂(FIA)、单克隆抗体同种型鉴定试剂盒(mAb isotyping kit)均为Pierce公司产品，聚乙二醇1500(PEG-1500)为Roche公司产品，RPMI-1640细胞培养基，次黄嘌呤-氨基喋呤-胸腺嘧啶核苷(HAT)(50×)培养基、次黄嘌呤-胸腺嘧啶核苷(HT)(50×)培养基和8-杂氮鸟嘌呤(8-AG)培养基、透析袋(8 000~14 000 u)、秋水仙素、酚红(phenol red)为北京索莱宝公司产品，辣根过氧化物酶标记羊抗鼠免疫球蛋白G(GaM IgG-HRP)为华美生物技术公司产品，96孔可拆卸酶标板、24孔细胞培养板、96孔细胞培养板为Iwaki公司产品，3，3，5，5-四甲基联苯胺(TMB)、非那西丁、过氧化脲为Sigma公司产品，胎牛血清(FBS)为Gibco公司产品。除另有说明外，所有溶剂和试剂均为分析级或更高级别。雌性BALB/c小鼠(6~8周龄)由北京无特定病原体(SPF)级生物技术公司提供，在本实验室动物房严格控制条件下饲养。
1.1.2 溶液磷酸盐缓冲液(PBS)、碳酸盐缓冲液(CBS)、冲洗液(PBST，即PBS中加入0.05%吐温-20)、封闭液(SPBST，即PBST中加入5%山羊血清)、样品稀释液、底物显色液、终止液(即2 mol/L H2SO4)、葡萄糖氯化钠钾注射液(GNK)、完全培养基、HAT培养基、HT培养基等均为实验室自制。
DON梯度标准液：准确称取DON 5 mg，加入乙腈5 mL使其溶解，配制成浓度为1 mg/mL的母液。根据试验所需DON浓度，用PBS进行稀释配制成DON终浓度分别为0、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0、64.0、128.0 μg/L的9个标准液。
1.1.3 仪器Galaxy S型CO2细胞培养箱，Biotech公司产品；Multiskan MK3酶标仪(用于450 nm处吸光度的测定)，美国Thermo公司产品；MIC 00949型倒置显微镜，购于Nikon公司；DK-8D水浴锅，中国上海益恒仪器有限公司产品；BS124S电子天平，德国Sartorius集团产品；LDZX-30 KB型蒸汽灭菌器，由中国上海市申安医疗器械厂提供；Milli-Q净化系统(用于超纯水的制备，美国Millipore公司产品；A11 basic分析用研磨机，德国IKA公司产品；Legend Micro 17微型离心机；美国Thermo公司产品；玻璃微纤维滤纸，英国Whatman公司产品；HPLC Aglient 1260 DAD检测器(用于确认icELISA试剂盒的可靠性)，美国Agilent Technologies公司产品。
1.2 试验方法 1.2.1 抗原和抗DON单克隆抗体(mAb)的制备根据DON的分子结构，参考Maragos等[5]的方法并加以改进，采用羰基二咪唑(CDI)法合成人工抗原DON-BSA。首先进行化学修饰，用DON与CDI反应引入活性基团羰基(—C=O—)合成半抗原。再将引入的羰基与载体蛋白BSA的氨基(—NH2)以单酰胺键(—CONH—)的形式实现偶联合成完全抗原。通过紫外和红外光谱鉴定人工抗原是否偶联成功。包被原DON-OVA的合成参考Li等[24]的方法并加以改进，先用马来酸酐对DON分子衍生化，引入活性基团羧基(—COOH)合成半抗原，再采用EDC法将半抗原与OVA偶联合成包被原DON-OVA。
应用经典的杂交瘤技术[25]制备抗DON mAb。获得DON mAb杂交瘤细胞株后，采纳体内诱生腹水法[26]大量生产抗DON mAb，并对收集后的腹水采用辛酸/硫酸铵沉淀法纯化。然后储存在-20 ℃直到用于组装DON icELISA试剂盒。
1.2.2 DON icELISA试剂盒的研制 1.2.2.1 包被原DON-OVA、抗DON mAb最佳工作浓度和酶标二抗最佳稀释度的确定采用方阵滴定法[27]确定DON-OVA、抗DON mAb的最佳工作浓度，并对酶标二抗最佳稀释度等进行优化选择，以确定最适反应条件。
1.2.2.2 试剂盒标准曲线的绘制与拟合根据icELISA试剂盒所测抑制效价，以不同浓度DON标准液对抗DON mAb的抑制率[加不同浓度DON标准液与不加DON标准液时的吸光度比值(B/B0)]为纵坐标，以标准液中DON浓度的对数为横坐标，绘制S型曲线并在曲线上得出线性回归方程，计算试剂盒理论上的检测范围和半抑制浓度(IC50)。
1.2.2.3 试剂盒条件的调整icELISA试剂盒优化条件对检测技术的完善至关重要。icELISA试剂盒的组成和参数见表 1。
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表 1 icELISA试剂盒的组成和参数 Table 1 Composition and parameters of icELISA kit |
选取有代表性的样品如小麦、玉米、猪料、鸡料等20份饲料进行粉碎。然后，每种样品准确称取5 g(精确至0.01 g)，分别添加到含有20%甲醇的25 mL超纯水中，再加2 g聚乙二醇，超声提取10 min，混合均匀，静置2 h，取其上清以4 000 r/min离心10 min。最后，将上清液用玻璃微纤维滤纸过滤至滤液澄清，此为待检样品提取液。在用作试剂盒分析前，用样品稀释液稀释即可。
1.2.2.5 试剂盒的操作1) 加标准品或样品：在标准品孔加入不同浓度的DON标准液(50 μL/孔)、样品孔加入样品提取液(25 μL/孔)，并标记标准品孔和样品孔。随后加入工作浓度的抗DON mAb(25 μL/孔)，设阴性和空白对照，然后在37 ℃恒温培养箱温育15 min，洗板。
2) 加酶标二抗：将GaM IgG-HRP稀释至优化工作浓度(1 : 2 500)后加入(50 μL/孔)，37 ℃恒温培养箱温育25 min，洗板。
3) 显色：加入底物显色液(50 μL/孔)，室温下避光静置5 min。
4) 终止：加入终止液(50 μL/孔)。
5) 酶标仪读数：在450 nm处时测量吸光度，计算抑制率。
1.2.3 DON icELISA试剂盒的性能测定 1.2.3.1 灵敏度测定按照Hayashi等[28]和刘智宏等[29]竞争ELISA灵敏度为(B/B0)%＝83.3%的方法，根据标准曲线回归方程计算试剂盒的灵敏度，确定其检测限。
1.2.3.2 准确度与精密度测定采用添加回收试验，通过回收率和相对标准偏差(RSD)来测定试剂盒的准确度与精密度。在小麦、玉米、猪料、鸡料4个样品中添加3个浓度的DON标准液，使4个样品中DON浓度分别为100、500、1 000 ng/mL，并室温搅拌2 h。然后用DON icELISA试剂盒进行检测，每个样品做3次重复。根据结果计算回收率和RSD：
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通过DON icELISA试剂盒与其他相关真菌毒素之间的交叉反应进行特异性评价，并计算交叉反应率(CR)：
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通过DON icELISA试剂盒在存放期间B0(不加DON标准液时的吸光度)和B/B0(%，加5 ng/mL DON标准液与不加DON标准液时的吸光度比值)的变化进行稳定性评价。
1.2.3.5 基质效应性测定为了分析样品基质对DON icELISA试剂盒敏感性的影响，将DON标准液分别溶于小麦、玉米、猪料、鸡料4个样品中，然后用样品稀释液稀释，按照试剂盒的方法操作绘制曲线进行基质效应性分析。
1.2.4 HPLC法对DON icELISA试剂盒的确认分别采用自主组装的DON icELISA试剂盒和HPLC法对20份饲料样品进行初筛，比较检测结果，判断该试剂盒与HPLC法检测结果的相关性。采用国家标准GB 5009.111—2016[30]中HPLC法对样品中DON进行检测。色谱条件：C18液相色谱柱(150 mm×4.6 mm×5 μm)；流动相为甲醇-水(20 : 80，体积比)，流速为0.8 mL/min，柱温为35 ℃，进样量为50 μL，检测波长为218 nm。
2 结果与分析 2.1 DON icELISA试剂盒的研制 2.1.1 包被原DON-OVA、抗DON mAb最佳工作浓度以及酶标二抗最佳稀释度的确定方阵滴定检测优化后，确定包被原DON-OVA的最佳工作浓度为1 μg/mL，抗DON mAb的最佳工作浓度为1 : 32 000，酶标二抗的最佳稀释度为1 : 2 500。
2.1.2 DON icELISA试剂盒标准曲线的绘制与拟合优化条件下DON icELISA试剂盒的标准曲线如图 2所示。通过对标准曲线进行分析，得到回归方程y=-35.661x+85.429，相关系数(R2)=0.980 9，IC50=9.84 ng/mL，检测范围为1.50~130.31 ng/mL。
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图 2 DON icELISA试剂盒的标准曲线 Fig. 2 Standard curve of DON icELISA kit |
当B/B0＝83.3%时，代入回归方程，求得所对应的DON浓度为1.147 ng/mL，即灵敏度为1.147 ng/mL，但考虑到实际检测工作的需要和用户操作方面的误差，将DON icELISA试剂盒的检测限确定为1.50 ng/mL。
2.2.2 准确度与精密度测定由表 2可知，对小麦、玉米、猪料、鸡料4个样品进行添加回收试验，回收率在77.1%~113.2%、RSD在4.2%~12.6%，符合国家标准中对准确度和精密度的要求，表明试剂盒可以用于实际样品的检测。
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表 2 DON icELISA试剂盒对不同样品的DON回收率 Table 2 Recoveries of DON in different samples by icELISA kit (n=3) |
由表 3可知，DON icELISA试剂盒与其他相关真菌毒素的交叉反应是可以忽略不计的，除与3-AC-DON的交叉反应率为5.3%外，与其他真菌毒素交叉反应率低于0.2%，说明该试剂盒的特异性较高。
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表 3 DON icELISA试剂盒与其他相关真菌毒素的交叉反应 Table 3 Cross-reactivity of DON icELISA kit with other related mycotoxins |
由图 3可知，DON icELISA试剂盒在存放期间，B0和B/B0显示出可接受的降低，说明该试剂盒具有很好的稳定性，有效使用寿命至少为12个月。
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图 3 DON icELISA试剂盒的稳定性 Fig. 3 Stability of DON icELISA kit |
由图 4可知，小麦、玉米、猪料、鸡料4个样品提取液倍比稀释绘制的曲线接近DON标准曲线，所测标准曲线的IC50分别为8.81、11.64、13.06、7.59 ng/mL，表明基质干扰可以忽略不计。因此，DON icELISA试剂盒可在不同基质下操作检测。
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图 4 不同样品基质对DON icELISA试剂盒的影响 Fig. 4 Effects of different sample matrix on DON icELISA kit |
由表 4可知，用自主组装DON icELISA试剂盒和HPLC法分别对20份饲料样品进行初筛，其中HPLC法共筛出13份阳性样品，DON icELISA试剂盒共筛出12份阳性样品，未筛出的样品经HPLC法检测毒素含量为45 ng/g，已低于DON icELISA试剂盒的检测范围。因此，二者符合率为92.3%，说明DON icELISA试剂盒在其检测范围内与HPLC法检测结果一致性良好。
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表 4 2种方法对20份饲料样品的检测结果比较 Table 4 Comparison of measured results of 20 feed samples detected by two different methods |
由于DON分子结构的特殊性，分别在C3、C7和C15位上有羟基及C8位上有酮基基团，理论上有4个位点可以引入桥结构，但由于C8位上酮基的影响，C7位上的羟基不活拨，一般较难发生衍生反应，因此，只有C3、C8和C15位上的羟基能作为活性位点。在多数报道制备DON抗体的文献中，大多对DON抗原合成进行位点选择，选择性利用其中一个羟基衍生后偶联蛋白。如Casale等[31]通过活化C8位上的酮基后制备人工抗原免疫小鼠获得的抗体特异性不好，而通过活化C3位上的羟基制备人工抗原免疫小鼠后，得到1株稳定分泌抗DON mAb的杂交瘤细胞株，并建立了免疫学检测方法。有些文献，如Li等[24]报道采用先封闭C7和C15位上的羟基，再利用C3位上的羟基衍生的方法也得到了较好的人工抗原，但这些方法制备过程较为复杂，操作繁琐。因此，在完全抗原偶联中，尝试采取多种方法来制备，分别免疫动物比较结果，从而筛选出最佳的完全抗原。本研究通过对比试验比较了多种偶联方法，试验结果表明，参照Maragos等[5]的CDI法并加以改进的方法效果最好，DON分子上的2个羟基可能都会发生反应。所以，本试验采取CDI法成功将DON分子C3和C15位上的羟基与载体蛋白BSA上的氨基共价偶联得到免疫原DON-BSA，而无封闭任何位点上的羟基，直接引入咪唑基实现与载体蛋白BSA的偶联。此方法合成的人工抗原与之前文献Lee等[32]报道合成的人工抗原没有明显的差异，免疫小鼠效果较好，但步骤简单利于操作，因此可以降低以后的应用成本。同时，我们利用EDC法合成了包被原，用马来酸酐直接对DON衍生，不需要封闭而得到了较好的检测抗DON抗体的包被原。然后，通过用人工抗原免疫小鼠，利用小鼠多抗进行ELISA检测，观察到既有较高的效价，DON分子又能对小鼠多抗产生抑制进行鉴定，结果证明人工抗原合成成功。
3.2 DON icELISA试剂盒性能的测定本试验用实验室自制高亲和力抗DON mAb组装icELISA试剂盒，其性能测定包括灵敏度、准确度和精密度、特异性、稳定性和基质效应性等方面。灵敏度测定可以按照Hayashi等[28]和刘智宏等[29]竞争ELISA灵敏度为(B/B0)%＝83.3%的方法计算，也可根据公式检测限(%)＝[(平均值-2×标准差)/平均值]×100计算。本试验采用(B/B0)%＝83.3%的方法确定灵敏度为1.147 ng/mL，检测限为1.50 ng/mL，检测范围为1.50~130.31 ng/mL。我国卫生部建立的DON ELISA法的最低检出量为5 ng/mL，检测范围为5~1 000 ng/mL，被批准为国家推荐标准检测方法。因此，本实验室组装的DON icELISA试剂盒检测范围和灵敏度均能满足国内对食品及饲料中DON限量标准的检测要求。准确度和精密度通过样品添加回收率、RSD来衡量，一般要求回收率在70%~140%。本试验中，DON icELISA试剂盒对DON的回收率为76.3%~113.2%、RSD为3.9%~13.2%，符合国家标准中对准确度和精密度的要求，表明该试剂盒可以用于实际样品的检测。抗体是ELISA试剂盒检测方法的基础，可能会导致结果假阳性或假阴性，而HPLC法检测准确，常用做验证方法。利用本实验室组装的DON icELISA试剂盒与HPLC法对20份饲料样品中DON进行初筛，2种方法检测结果的符合率为92.3%，因此该试剂盒可以用于食品及饲料中DON的检测。
3.3 生物毒素样品的前期处理对样品进行前期处理可使HPLC法和ELISA法检测结果更加准确。样品经提取后对其进行DON检测，其中ELISA法的样品前处理较为简单，经提取后直接过滤即可用于检测，而HPLC法的样品前处理需过免疫亲和柱。有试验将ELISA法与HPLC法相比，提取后的样品直接过滤后进行ELISA法检测的回收率较高，在75%以上，RSD在4.7%~10.6%；而过柱后经HPLC法和ELISA法检测，在加标浓度较高的情况下两者回收率相当，分别为49.8%和49.7%，RSD分别为1.8%和5.6%[33]。这说明采用ELISA法检测样品毒素简化了样品预处理和纯化过程，其结果准确可靠，检测步骤简单，非常适用于大量样品的快速初筛；并且，ELISA法干扰小，特异性强，同时酶促反应时间短，缩短了整个检测的时间。
4 结论本试验在优化包被原、单抗工作浓度以及酶标二抗稀释度的基础上，利用自主研制的抗DON mAb建立检测了DON的icELISA试剂盒，该试剂盒具备与HPLC法同样的检测能力，对DON检测具有准确可靠、方便快捷、高通量大等特点，可以广泛应用于食品及饲料中DON的检测。
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