畸形耳是一种颅面部畸形，表现为外耳、外耳道、中耳及其他结构的异常。其中，外耳的异常较为常见。畸形耳主要是在胚胎发育早期由环境、遗传及环境和遗传共同作用所导致的第一、二鳃弓发育异常的一种颅面部畸形，但具体的发病机制尚不清楚。先天性畸形耳主要表现为外耳发育不全，依据耳朵大小分为巨耳、小耳和无耳。研究者依据先天性畸形耳的严重程度将其分为5级^[1]，其中，一级是指完全没有外耳，二级是指耳廓发育不全，三级是指小耳重度发育不全，四级则是指小耳中度发育不全，五级是指小耳中度异位发育不全。

畸形耳会对动物产生很多不利的影响，如动物体型矮小、行动不便，甚至不能存活。荣昌猪是重庆荣昌县一种地方品种猪，是我国不可多得的猪种资源之一，正常个体表现为躯体全白、眼睛周围有些许的黑色皮肤和毛发，因此该品种又叫“眼睛猪”或“熊猫猪”，纯白荣昌猪个体听力减弱或丧失，在动物生产过程中造成许多的不方便，如容易压死仔猪、转群困难等问题^[2]。潘博等^[3]研究发现，在二花脸×沙子岭F2近交群体全同胞个体仔猪中，患有双侧外耳缺失的仔猪身材比正常的矮小，站立不稳、平衡感差，呼吸更加急促，眼神呆滞，精神状态明显不好，几乎不主动吃奶，进行人工喂养也不能正常进食，难以维持日常基本体能消耗，出生后2周内便死亡。Wei等^[4]在大白猪和梅山猪杂交产生的F2后代研究中发现，F2后代耳朵面积比正常的小，体型也略小。郭小令等^[5]研究发现，皮特兰和汉普夏杂交的后代与皮特兰杂交，其杂交后代耳朵表现为垂耳、半垂耳和直立耳。患有畸形耳个体极有可能会伴发其他一些畸形，如牙齿^[6]、心脏^[7]等畸形。伴发其他畸形的畸形耳个体比单纯性畸形耳的个体出生体重更低，胚胎期发育受限，死亡率更高^[8]。

耳朵发育受维甲酸(retinoie acid，RA)和Hox家族基因(Hoxa、Hoxb、Hoxc和Hoxd)的双重调控。RA是维生素A的衍生物，是胚胎正常发育所必需的营养物质之一，对细胞的生长、分化和器官形成等起着不可或缺的作用^[9-11]。Hox基因是一类调控胚胎发育和细胞分化的主要基因，一旦某个基因表达发生异常，胚胎发育就会出现异常，甚至死亡^[12-14]。因此，了解RA和Hox基因对耳朵发育的影响，有助于进一步阐明畸形耳的形成机制。

1 耳朵的发育

耳朵由外耳、中耳和内耳组成。耳朵最初是由神经嵴细胞(neural crest cell，NCC)分化发育而来。NCC是一种多潜能、暂时性细胞群，它在胚胎发育过程中可分化成心神经嵴细胞、颅神经嵴细胞(cranial neural crest cell，CNCC)、迷走神经嵴细胞、体神经嵴细胞、骶神经嵴5个主要的细胞群^[15]。其中，CNCC又可进一步分化为前脑、中脑和后脑细胞。后脑的细胞群分化成多个菱脑原节(rhombomere’r，共分r1~r8 8个节段)，CNCC最终充满整个鳃弓^[16]。在正常情况下，来自r1和r2的细胞群分化成第一鳃弓^[17]，r4的细胞群分化成第二鳃弓^[18]，r6和r7的细胞群分化成第三鳃弓^[17]，r8的细胞群分化为第四鳃弓^[19]。

颅颌面组织大部分是由CNCC构成^[20]，其发育受CNCC的迁移时间、位置以及一些重要的信号分子调控影响较大^[21]。有研究发现，小鼠耳廓发育时期，CNCC不具有迁移性可能是引起小鼠小耳畸形的原因之一^[22]。CNCC能否在适当的时间迁移到正确的位置，对颅颌面结构能否正常发育至关重要。此外，CNCC迁移发生异常是各种颌面部畸形发生的重要原因之一^[23]。胚胎发育学表明，第一、二鳃弓可以分化发育为外耳和中耳，菱脑表面细胞发育形成内耳。耳朵能否正常形成依赖于CNCC能否在正确的时间到达正确的区域，只有当CNCC在正确的时间到达正确区域的前提下，才有可能形成正常的耳朵。Hox家族基因和RA都能影响CNCC的迁移分化。在胚胎发育过程中，Hox家族基因沿前后轴进行精确的时空表达并调控CNCC的分化^[24]，当Hox家族基因发生突变时，CNCC迁移的路径、时间或区域就会发生异常，从而导致耳朵的发育出现畸形^[25-27]。Hox家族基因的启动转录需要RA的参与^[28]，并且不同的Hox家族基因在启动转录时所需的RA的浓度是不同的^[29-31]。

2 RA对耳朵发育的影响

维生素A是动物体内不可缺少的微量营养元素之一，动物本身不能合成，主要来源于植物中的类胡萝卜素和动物中的视黄酯，其缺乏或过量都会对动物健康产生不利的影响。RA是维生素A的主要衍生物，其合成代谢过程依次是在小肠、肝脏和靶细胞中^[32]。动物摄取食物后，食物中丰富的类胡萝卜素和视黄酯会被动物小肠黏膜上皮细胞吸收，并水解为视黄醇。此后，视黄醇在一些蛋白质和酶的作用下，转化为视黄酯。视黄酯通过血液循环转运到肝脏并被肝细胞吸收，水解成视黄醇，然后是与视黄醇结合蛋白(retinol-binding protein，RBP)结合并分泌到血流中，与血液中的物质形成复合物，被靶细胞吸收。最后，在一些酶的作用下，转化为RA。RA在胚胎发育的过程中发挥了不可替代的作用，是胚胎发育的重要调节因子，也是许多组织和器官发育和成熟的调节因子^[33-35]。RA作为重要的调节剂，通过激活多个基因的转录来调节发育，而RA功能的正常发挥依赖于RA受体的表达和RA的适当浓度。因此，妊娠期合理摄入RA对于确保胚胎的健康发育尤为重要。

RA是耳朵发育过程中重要的物质之一，其缺乏或过量都对耳朵的正常发育有不利影响，从而引起耳朵发育不正常。Maden等^[36]研究发现，RA能提供NCC正常生长发育所需要的营养物质，其剂量过多或过少和到达NCC的时间出现异常，神经突将不能延伸至外围。妊娠期间，过量摄入维生素A会对胚胎造成致畸作用，称为RA胚胎病^[37]。缺乏维生素A会导致各种器官的异常，如眼睛、耳朵、神经系统、肢体、肺、心脏、泌尿生殖系统等，甚至导致胚胎死亡，称为维生素A缺乏症^[37-38]。细胞色素P450家族26s(cytochrome P450 family 26s，CYP26s)是参与RA分解代谢的酶，又称RA分解酶^[39]，是细胞色素P450家族的成员之一。CYP26s有4种异构体，分别为CYP26A1、B1、C1、D1^[40]，均可将RA降解^[41-43]。妊娠期间，CYP26A1不表达的胎鼠会在妊娠中期死亡，且有多个器官的缺陷与RA信号表达过量所导致的器官缺陷相一致^[44]。在出生后存活下来的小鼠中，CYP26B1不表达的小鼠由于呼吸系统缺陷而死亡^[45]。Molotkova等^[46]研究发现，RA对胎龄为7.5~9.5 d的老鼠胚胎后部神经外胚层分化发育起重要作用，RA补充不当会导致CNCC的迁移发生异常而引发不同程度的外耳畸形^[47-48]。维甲酸受体(retinoic acid receptors，RARs)和类视黄醇X受体(retinoid X receptors，RXRs)均为核内受体，都包含由不同基因编码的α、β、γ 3个亚类。RARs和RXRs结合，形成配体活化的转录因子复合物二聚体RARs/RXRs，RA可以通过结合此复合物二聚体、调节靶基因的转录来发挥作用，受体的变异或缺失将会导致内耳发育畸形^[49]。表 1列举了RA与动物畸形耳的相关研究。由表 1可知，RA的浓度过多或过少及未在正确时间暴露RA都会导致畸形耳，同时有些还会伴发其他器官的畸形。从上述研究可以知道，RA的饲喂时间和浓度对胚胎发育至关重要，在正确的时间饲喂适宜浓度的RA，才能使组织器官正常的发育。

3 Hox家族基因对耳朵发育的影响

Hox家族基因属于转录因子家族^[57-58]，此家族基因也属于同源盒基因，在染色体上成簇排列且在进化上高度保守。在哺乳动物中分为A、B、C和D 4个子家族，沿染色体3′→5′方向分布，按此方向依次命名，最先表达的基因命名为1。Hox家族基因表达具有时间和空间特性(称为时空共线性)，与鳃弓发育有关的基因主要是那些表达靠前的Hox基因。

Hox基因是控制耳朵发育的重要基因之一，一旦其表达发生异常，耳朵将不能正常发育。Hoxa1基因是最早表达的基因之一^[59]。在畸形耳的候选基因中，Hoxa1被认为是最重要的候选基因之一^[60-61]。胚胎发育时期，Hoxa1突变造成颅神经节和耳朵的镫骨骨骼的缺陷^[26]，在内耳前体发育中未检测到Hoxa1表达，胚胎由于Hoxa1基因的异常表达不能正常发育，造成内耳形成模式所必需的后脑信号破坏^[62]。在动物模型中，Hoxa1突变纯合子小鼠的外耳、中耳和内耳均有缺陷，并且出生不久后死亡^[26]。此外，小鼠由于双突变(Hoxa1/Hoxb1)表现为无耳畸形^[63]。有研究发现，Hoxa1突变小鼠表型与常染色体隐性遗传家庭中鉴定出Hoxa1基因突变表型极为类似^[64]。Hoxa2是参与第二鳃弓发育的基因之一，是Hox基因中唯一参与第二鳃弓发育的基因。Kaur等^[65]研究发现，Hoxb和Hoxa7基因表达出现异常，小鼠出现小耳畸形现象，还伴有其他畸形，如开放眼裂畸形和腭裂畸形等。Alasti等^[66]研究发现，Hoxa2发生Q186K的突变会导致伊朗人家族出现畸形耳的表型。人类先天性小耳畸形^[66-67]及小鼠耳部畸形^[68]与Hoxa2基因表达异常有关。敲除小鼠Hoxb6和Hoxa7基因时，不仅表现出小耳畸形，还伴有其他畸形如腭裂畸形及开放眼裂畸形^[65]。

4 RA和Hox基因对耳畸形的影响机制

RA诱导了Hox基因的“时、空”协同表达。Hox基因的正常表达、胚胎的正常发育以及耳朵的正常发育依赖于RA的适宜浓度和到达的正确时间点。在二花脸×沙子岭F2近交群体中研究发现，有些仔猪患有先天性畸形耳，转录组测序(RNA-Seq)和定量PCR(Q-PCR)试验结果表明，Hoxa1野生型和突变型个体胚胎期的外耳发育过程中，CYP26A1和细胞视黄酸结合蛋白1(cellular retinoic acid binding protein 1，CRABP1)都发生了差异表达，Hoxa1突变型胚胎中CYP26A1的表达量升高，而CRABP1的表达量降低^[69]。CYP26A1是维生素A代谢通路中的关键酶，它可以催化活性RA为氧化型RA，从而使得胞内活性RA浓度降低。CRABP1是活性RA结合蛋白，活性RA跨膜并进入核内调节靶基因的转录需要与CRABP1蛋白结合才能发挥作用。开放阅读框架(open reading frame，ORF)分析表明，因果突变点g.50111251>TC导致Hoxa1蛋白的翻译提前终止，使Hoxa1蛋白缺少了Hox结构域，改变了Hoxa1蛋白的生物学功能，从而导致猪的耳廓和外耳道出现不同程度的畸形^[69]。

Pasqualetti等^[47]报道，给怀孕7.5~9.5 d的Hoxa1^-/-小鼠饲喂低剂量(5 mg/kg BW)的外源RA，不会出现致畸风险，能修复因Hoxa1基因突变导致的内耳缺陷，这说明RA具有补偿Hoxa1缺陷基因功能的作用，并且这种修复作用只在配种后的第8.00~8.75天(耳泡发育早期)有效，但其具体的修复机制还不清楚。Romand等^[70]研究发现，RA受体特殊地表达在内耳发育的不同时期和不同部位，在内耳的发育中发挥不同的作用。听泡中央部位的感觉上皮RA信号的传导主要受RARα和3种RXRs受体的影响，而软骨性耳囊成形过程中转导信号主要是RARγ和RXRα。进一步研究发现，RARγ/RXRα基因无效突变将会导致严重的内耳畸形，主要表现在为胚胎发育到一定时期，内淋巴管缺损，听泡比正常的小，半规管不再发育。这说明RA通过结合RARγ/RXRα受体发挥其作用，进而调节内耳软骨性耳囊发育。Lamantia等^[71]研究发现，在听泡发育的早期，RA是上皮和间质之间相互作用的多种途径之一；Mccaffery等^[72]研究发现，RA是菱脑神经组织和听泡外胚层之间的相互作用多种因子之一。由此推断出这2条信号在内耳软骨性耳囊发育早期发挥主要作用。

Hox基因对RA反应存在共线性，即在同一个基因簇中，Hox基因表达的时间和表达区域依次沿3′→5′方向作出不同的反应(位于3′末端的基因最先表达，对RA的敏感性最高)，对RA的反应时间也沿3′→5′方向延迟而且反应程度依次降低(各基因沿3′→5′方向表达，对RA的敏感性依次降低)^[73]。依据Hox基因这一特性，Langston等^[74]提出如下3种模型：1)有一共同的调节元件存在于Hox家族基因的3′远端并受RA的诱导，对RA诱导敏感性随各基因与该元件距离的增加逐渐减低；2)Hox家族基因的每一个基因上都存在对RA敏感的调控元件，沿3′→5′方向对RA的敏感性逐渐降低；3)3′端的Hox基因最先表达，并受RA的诱导，下游的Hox基因表达受该Hox蛋白直接或间接调节，但这与Hox基因在特定胚胎节段的表达特性不一致。维甲酸反应元件(retinoic acid response elements，RAREs)存在于一些Hox基因(如Hoxa1和Hoxb1)的调节区，揭示Hox基因可能是RAR的直接靶基因。有研究者提出这样的观点：由于Hoxb1基因有RAREs存在且有其特有的表达模式，又定位于Hox家族基因的3′端，推断出由特定RAR-RXR异二聚体诱导的3′端Hox基因的表达，可能是RA进一步诱导5′端Hox基因表达的前提。有研究发现，RAREs不仅存在于Hoxb1基因调控区的5′端调控区，在3′端调控区也发现有RAREs的存在。在不同细胞内，RAREs对RA的应答能力各有不同，推测Hoxb1基因的表达是由RA在不同细胞内可以通过至少3种不同的信号途径诱导：1)在视黄醇诱导蛋白的参与下，通过5′RAREs介导对RA的应答；2)通过3′RAREs介导RAR-RXR异二聚体启动Hoxb1基因，此过程有视黄醇活化蛋白的参与；3)自身活化(RA触发的Hoxb1基因的表达后，机体通过某种正回馈机制维持)。

5 小结

RA和Hox基因参与由CNCC分化发育而来的耳的发育过程，RA浓度的异常或Hox基因表达异常都会导致畸形耳。RA在特定的时间和位置，通过激活在胚胎的不同位置的基因的表达，进一步来调控胚胎发育。不同基因的激活由不同的RA浓度和RA表达的时间等来决定，RA正是通过这种严格控制来调控胚胎的发育过程。RA激活或抑制下游靶基因的转录是通过与核受体蛋白结合发挥作用，而Hox基因是RA的靶基因之一。Hox基因表达在时间和空间上具有特异性，在特定的时间或位置不能正常表达，其作用不能正常发挥，胚胎不能正常发育。究竟是单一RA浓度的异常、Hox基因表达异常或两者互相影响导致耳朵发育异常，还有待进一步去探讨。