2. 神牛药业有限公司, 德州 253074;
3. 恩施土家族苗族自治州农业科学院, 恩施 445000
2. Shangdong Dezhou Shenniu Animal Pharmaceutical Co., Ltd., Dezhou 253074, China;
3. Enshi Tujia and Miao Autonomous Prefecture Academy of Agricultural Sciences, Enshi 445000, China
热应激是当环境温度上升时，动物机体无法通过对流、传导、蒸发和辐射等物理方式将热量散出，出现散热和产热的负平衡，进而导致机体出现温度升高、生产性能下降、代谢率降低等一系列应激反应[1]。研究表明，热应激能降低奶牛采食量，减缓食糜流通速率，提高营养物质消化率，降低产奶量，影响牛奶品质[2-3]；同时，热应激能激活下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴，抑制甲状腺素分泌，促进皮质醇和肾上腺素分泌，引起机体内分泌紊乱，降低奶牛免疫力及繁殖性能[4-5]。热休克蛋白70(heat shock protein 70, HSP70)是一种分子伴侣蛋白，能帮助胞内蛋白折叠，参与脂质类激素信号转导，调节细胞周期及细胞凋亡，维持细胞稳定等[6-7]。热应激下HSP70含量增加能降低细胞损伤，维持细胞正常功能，进而提高机体的热耐受性，减少热应激对机体造成的损害。饲粮中添加抗应激添加剂是缓解热应激、提高奶牛生产性能的常见营养调控手段。Kargar等[8]研究发现，在热应激下通过饲喂犊牛含铬牛奶提高了采食量和日增重；Soltan[9]报道，饲粮中添加有机铬能提高热应激奶牛的产奶量和生产性能；Biswas等[10]研究发现，粗蛋白质和干物质的消化率随着饲粮中铬的添加量的增加而升高；贾亚伟[11]研究报道，饲粮中添加0.8 mg/kg酵母铬显著降低高温下奶牛血清中热休克蛋白(heat shock protein，HSP)含量，并有降低血液中肌酸激酶(creatine kinase, CK)活性的趋势。以上研究结果表明铬在缓解奶牛热应激、改善动物福利方面有很大潜力，但作用机制还需进一步研究。二氢吡啶是一种绿色、高效、多功能的动物促生长剂，在反刍动物生产中有广泛的应用[12]。王超等[13]研究发现，饲粮中添加3 g/d二氢吡啶能显著提高奶牛血液总抗氧化能力(total antioxidant capacity, T-AOC)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)活性，提高牛奶品质，缓解热应激；张颖等[14]研究表明，二氢吡啶能促进四碘甲状腺原氨酸(tetraiodothyronine，T4)转化为三碘甲状腺原氨酸(triiodothyronine，T3)，提高机体代谢速率，促进畜禽生长；王学清等[15]在饲粮中添加二氢吡啶，与对照组相比，荷斯坦奶牛外周血淋巴细胞HSP70的表达显著上调，血液总抗氧化力增强。赵新茂等[16]报道，饲粮中添加3 g/d二氢吡啶能降低热应激奶牛瘤胃pH，促进瘤胃氨态氮(ammonia nitrogen, NH3-N)吸收，增加挥发性脂肪酸(volatile fatty acid, VFA)产量及乙丙比，改善瘤胃发酵模式。关于二氢吡啶对热应激奶牛营养物质消化率的影响鲜有报道，因此本试验拟在热应激条件下，通过在饲粮中添加酵母铬和二氢吡啶，探究二者对热应激奶牛营养物质消化率及血液生理生化指标的影响，为生产实际中二氢吡啶及酵母铬的科学合理应用提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料与试验动物铬含量1%的酵母铬购于浙江深友生物技术有限公司，二氢吡啶购于河北衡水和川生物技术公司。选用胎次[(1.4±0.5)胎]、泌乳期[(116±12) d]、产奶量[(21.0±4.8) kg/d]、体况相近的经产荷斯坦奶牛24头，根据胎次、泌乳期和体况一致原则分为对照组、酵母铬组、二氢吡啶组，每组8头奶牛。
1.2 试验饲粮参照NRC(2001)奶牛饲养标准及我国奶牛实际生产需要量配制基础饲粮，其组成及营养水平见表 1。以不添加酵母铬和二氢吡啶的基础饲粮作为对照组饲粮，在基础饲粮中添加酵母铬80 mg/(头·d)作为酵母铬组饲粮，在基础饲粮中添加二氢吡啶3.0 g/(头·d)作为二氢吡啶组饲粮。试验期包括6 d的预试期和48 d的正试期。在湖北省黄陂市扬子江奶牛场完成饲养试验和样品采集。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (DM basis) |
试验奶牛分栏饲养在开放型牛舍中，牛舍内装有2排排风扇，保证自由采食及饮水，饲粮采用全混合日粮(TMR)形式饲喂。先将酵母铬和二氢吡啶混合在2 kg TMR中投喂试验牛，试验牛采食完2 kg TMR后再投放剩余TMR，不单独记录每头牛采食量。每天07:00、15:00和21:40饲喂TMR，每天挤奶时间为07:00—09:30、15:00—17：00、21:40—23:20。
1.4 样品采集与处理粪样和饲粮样：每组选择3头牛，在正式试验第23~27天连续4 d进行消化试验，采用内源指示剂法测定营养物质消化率，内源指示剂为酸不溶灰分。每天早、中、晚采集3次粪样，每次收集粪样1 500 g并按2%比例加入10%硫酸，封闭保存在-20 ℃冰箱中。同时采集饲粮样，每次100 g，保存于-20 ℃冰箱中。
血样：根据测定的温湿指数(THI)记录结果，在正式试验第40天选取06:00、08:00、10:00、12:00、15:00、17:00、19:00这7个时间点先测量THI，对应THI分别为76.7、77.5、78.0、81.0、88.1、85.7、78.9(奶牛处于不同程度的热应激)，在每组选择3头奶牛进行尾静脉采血20 mL，一部分血样3 500×g离心30 min后分离血清，于-20 ℃冰箱中冷冻保存；另一部分血样离心后吸除血清，立即用于测定HSP70 mRNA表达量。
1.5 测定指标及方法 1.5.1 THI的测定在2列牛舍中部距离地面1.5 m高处分别悬挂干球和湿球温度计，每天06:00、08:00、10:00、12:00、15:00、17:00、19:00记录试验牛舍内干球和湿球温度，计算THI[THI=0.72×(Td+Tw)+40.6(Td表示干球温度，Tw表示湿球温度)][18]，取2只温度计的平均值，作好记录。整个试验期间，牛舍日平均THI均保持在72以上，最高THI达到85.7，说明试验期间奶牛处于热应激状态。
1.5.2 营养物质消化率的测定粪样及饲粮样中酸不溶灰分含量参照《饲料中酸不溶灰分的测定》(GB/T 23742—2009)[19]测定；采用GB/T 6435—2006[20]中方法测定水分含量后计算干物质(DM)含量；中性洗涤纤维(NDF)、酸性洗涤纤维(ADF)含量采用ANKOM A200i型全自动纤维素分析仪测定；粗脂肪(EE)含量采用索氏抽提法(GB/T 6433—2006[21])测定；钙(Ca)含量采用高锰酸钾滴定法(GB/T 6436—2002[22])测定；磷(P)含量采用分光光度法(GB/T 6437—2002[23])测定；粗蛋白质(CP)含量采用凯氏定氮法(GB/T 6432—1994[24])测定；总能(GE)使用氧弹式热量计(Model-6200，PARR公司)测定。各营养物质消化率的计算公式为：
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式中：Db为待测饲粮某营养物质消化率；Pb为粪中该营养物质含量(%)；Fa为饲粮中酸不溶灰分含量(%)；Fb为饲粮中该营养物质含量(%)；Pa为粪中酸不溶灰分含量(%)。
1.5.3 干物质采食量测定在连续4 d的消化试验期间测定奶牛的采食量。每天早上定量投喂每头奶牛，第2天同一时间收集每头奶牛的剩余料，称重，饲喂量与剩余量差值即奶牛当天的采食量，最后根据饲粮干物质含量计算出每头奶牛每日干物质采食量。
1.5.4 血液中HSP70 mRNA表达量测定全血离心后吸除上面血清，加入红细胞裂解液除去红细胞，采用Trizol法提取RNA，用核酸蛋白测定仪测定其吸光度(OD)值，样品OD260/280 nm在1.8~2.0可用于后续试验。用TaKaRa反转录试剂盒将RNA反转合成cDNA，并于-20 ℃保存备用。
根据GenBank上牛HSP70 mRNA的基因序列，用Primer 5.0设计引物，引物序列见表 2，引物由生工生物上海有限公司合成。采用SYBR Green实时荧光定量PCR技术对HSP70的基因表达进行定量，反应体系为25 μL：SYBR Premix 12.5 μL，上游引物1.0 μL，下游引物1.0 μL，cDNA 2.0 μL，ddH2O 8.5 μL。扩增条件为：95 ℃变性15 s，57 ℃退火1 min，共40个循环，PCR后利用熔解曲线判断扩增的正确性和特异性。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参基因，读取样品Ct值，采用ΔΔCt法计算HSP70 mRNA表达量。
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表 2 实时荧光定量PCR引物序列 Table 2 Primer sequences for real-time qPCR |
血清中T3、T4含量使用德国西门子ADVIA Centaur CP全自动电化学发光分析仪测定。使用上海蓝怡CA-400全自动生化分析仪，采用国际临床化学联合会(IFCC)法测定血清中碱性磷酸酶(ALP)活性，采用比色法测定血清中肌酸激酶(CK)活性。通过试剂盒测定血清中钠离子(Na+)、钾离子(K+)、氯离子(Cl-)浓度，试剂盒均购于南京建成生物工程研究所。根据血清中Na+、K+、Cl-浓度与其所携带电荷数乘积(mEq)的总和计算得到血清电解质平衡值，计算公式[25]如下：
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式中：c(Na+)为血清中Na+浓度；c(K+)为血清中K+浓度；c(Cl-)为血清中Cl-浓度。
1.6 数据统计与分析采用Excel 2007进行初步数据整理，结果以平均值±标准差表示，然后采用SAS 9.1.3统计软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，Duncan氏法多重比较进行营养物质消化率、血液中HSP70 mRNA表达量以及血清T3、T4含量，ALP、CK活性，Na+、K+、Cl-浓度与电解质平衡值的显著性分析，P < 0.05为差异显著。
2 结果 2.1 酵母铬和二氢吡啶对奶牛干物质采食量和营养物质消化率的影响酵母铬和二氢吡啶对热应激奶牛干物质采食量和营养物质消化率的影响如表 3所示。与对照组相比，酵母铬可显著提高热应激奶牛的干物质采食量(P < 0.05)，并可显著提高干物质、粗蛋白质以及中性洗涤纤维的消化率(P < 0.05)，对粗脂肪和酸性洗涤纤维的消化率无显著影响(P>0.05)；二氢吡啶可显著提高热应激奶牛的干物质采食量(P < 0.05)，并可显著提高粗蛋白质的消化率(P < 0.05)，对粗脂肪、酸性洗涤纤维、中性洗涤纤维和干物质的消化率无显著影响(P>0.05)。
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表 3 酵母铬和二氢吡啶对热应激奶牛干物质采食量和营养物质消化率的影响 Table 3 Effects of chromium yeast and diludin on DMI and nutrient digestibility of heat stressed dairy cows |
酵母铬和二氢吡啶对热应激奶牛血液中HSP70 mRNA表达量的影响如图 1所示。从平均值看，酵母铬有增加血液中HSP70 mRNA表达量的趋势(P=0.06)，酵母铬组在6个THI下血液中HSP70 mRNA表达量的平均值较对照组提高67.9%；在THI为81.0时，酵母铬显著降低血液中HSP70 mRNA的表达量(P < 0.05)；在THI为88.1时，酵母铬显著增加血液中HSP70 mRNA的表达量(P < 0.05)。从平均值看，二氢吡啶也有增加血液中HSP70 mRNA表达量的趋势(P=0.09)，二氢吡啶组在6个THI下HSP70 mRNA表达量的平均值较对照组提高62.5%；在THI为81.0时，二氢吡啶显著降低热血液中HSP70 mRNA表达量(P < 0.05)，在THI为85.7时，二氢吡啶显著增加血液中HSP70 mRNA表达量(P < 0.05)。
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相同THI数据柱上标不同小写字母表示差异显著(P < 0.05)，相同或无小写字母表示差异不显著(P>0.05)。下图同。 In the same THI, data columns with different small letters mean significant difference (P < 0.05), while with the same or no small letters mean no significant difference (P>0.05). The same as below. 图 1 酵母铬和二氢吡啶对热应激奶牛血液中HSP70 mRNA表达量的影响 Fig. 1 Effects of chromium yeast and diludin on mRNA expression level of HSP70 in blood of heat stressed dairy cows |
酵母铬和二氢吡啶对热应激奶牛血清中T3和T4含量的影响如表 4所示。酵母铬和二氢吡啶在不同THI下对热应激奶牛血清中T3和T4含量均无显著影响(P>0.05)。
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表 4 酵母铬和二氢吡啶对热应激奶牛血清中T3和T4含量的影响 Table 4 Effects of chromium yeast and diludin on serum T3 and T4 contents of heat stressed dairy cows |
酵母铬和二氢吡啶对热应激奶牛血清中ALP活性的影响如图 2所示。与对照组相比，酵母铬和二氢吡啶在不同THI下均使热应激奶牛血清中ALP活性有所降低，但差异不显著(P>0.05)。
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图 2 酵母铬和二氢吡啶对热应激奶牛血清中ALP活性的影响 Fig. 2 Effects of chromium yeast and diludin on serum ALP activity of heat stressed dairy cows |
酵母铬和二氢吡啶对热应激奶牛血清中CK活性的影响如图 3所示。与对照组相比，在THI为77.5、88.1时，酵母铬能显著降低血清中CK活性(P < 0.05)；在THI为77.5、85.7和88.1时，二氢吡啶能显著降低血清中CK活性(P < 0.05)。
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图 3 酵母铬和二氢吡啶对热应激奶牛血清中CK活性的影响 Fig. 3 Effects of chromium yeast and diludin on serum CK activity of heat stressed dairy cows |
酵母铬和二氢吡啶对热应激奶牛血清中K+、Na+、Cl-浓度及电解质平衡值的影响如表 5所示。与对照组相比，在THI为78.0和81.0时，酵母铬可显著增加血清中K+浓度(P < 0.05)；在THI为81.0时，二氢吡啶可显著增加血清中K+浓度(P < 0.05)。与对照组相比，在THI为78.0时，酵母铬可显著增加血清中Na+浓度(P < 0.05)；二氢吡啶在各THI下对血清中Na+浓度均没有显著影响(P>0.05)。不同THI下，酵母铬和二氢吡啶对血清中Cl-浓度均无显著影响(P>0.05)。与对照组相比，在THI为78.0时，酵母铬显著提高血清中电解质平衡值(P < 0.05)，二氢吡啶则在各THI下对血清中电解质平衡值均无显著影响(P>0.05)。
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表 5 酵母铬和二氢吡啶对热应激奶牛血清中K+、Na+、Cl-浓度及电解质平衡值的影响 Table 5 Effects of chromium yeast and diludin on serum K+, Na+, Cl- concentrations and electrolyte balance value of heat stressed dairy cows |
热应激降低奶牛采食量，进而降低产奶量，影响生产性能[26]。在本试验中，饲粮中添加80 mg/(头·d)酵母铬使热应激奶牛的干物质采食量提高1.0 kg/d，这一结果与Deka等[27]的报道相似，饲粮中添加1.5 mg/kg的无机铬使水牛干物质采食量提高1.5 kg/d。二氢吡啶也能显著提高热应激奶牛的干物质采食量，结合曹杰[28]的研究，饲粮中添加0.02%二氢吡啶能提高泌乳后期奶牛的产奶量，说明二氢吡啶和酵母铬均能提高奶牛的采食量，缓解热应激。
热应激不仅降低采食量，同时也降低干物质、粗蛋白质、中性洗涤纤维及酸性洗涤纤维消化率[29]。Emami等[30]在饲粮中添加1.0 mg/(头·d)蛋氨酸铬后发现山羊有机物和中性洗涤纤维消化率显著提高，这与本试验结果相似，本试验结果还发现酵母铬能显著提高干物质和粗蛋白质消化率。Wheelock等[26]通过配对试验发现热应激能提高血液中胰岛素含量，促进葡萄糖代谢，抑制脂质动员，而有机铬能激活胰岛素信号通路，促进其功能的发挥，推测热应激下铬的添加与胰岛素有协同作用，调节糖、脂肪和蛋白质的代谢，提高营养物质消化率。同时，二氢吡啶的添加也提高了粗蛋白质的消化率，贾斌等[31]研究表明二氢吡啶能显著增强小肠的肌电活动，减缓小肠内食糜向后移动速度，增加消化吸收时间，使营养物质消化吸收的更充分。此外，二氢吡啶还能促进体内T4向T3的转化，改善蛋白质的利用和氮沉积，增强机体对蛋白质的消化吸收能力。
3.2 酵母铬和二氢吡啶对热应激奶牛血液中HSP70 mRNA表达量的影响研究表明热应激能上调HSP表达[32]。一种可能是热应激可直接刺激细胞提高HSP70 mRNA转录水平，起到保护细胞的作用；另一种可能是细胞的代谢负担会因为热应激的发生而增加，HSP70的消耗加剧，机体通过负反馈调控机制来促进热休克转录因子(heat shock transcription factor, HSF)和热休克元件(heat shock element, HSE)的特异性结合，促进基因的转录翻译，表达出更多HSP70，维持细胞正常的功能[33]。在本试验中，相比对照组，在THI为81.0时，酵母铬和二氢吡啶均可显著降低血液中HSP70 mRNA表达量，这一结果与Li等[34]报道的饲粮中添加吡啶羧酸可降低肉鸭空肠HSP70 mRNA表达量的结果一致，说明两者对热应激导致的HSP70表达上调有缓解作用。随着THI升高，热应激程度加重，二氢吡啶和酵母铬上调HSP70 mRNA的表达。有研究表明长期热应激作用会导致机体产生过多活性氧(ROS)和活性氮(RNS)等，损伤细胞及蛋白质核酸等生物大分子，造成机体氧化应激[35]。HSP70作为一种分子伴侣，参与功能蛋白的折叠、转运及组装等过程，能加速修复氧化应激引起的细胞损伤，保证细胞的功能和生存[36]；同时，通过抑制线粒体B淋巴细胞瘤-2(B-cell leukemia/lymphoma 2，Bcl-2)相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)信号通路和细胞色素C，抑制热应激引起的细胞凋亡[37]。而酵母铬和二氢吡啶作为抗氧化剂，能通过提高HSP70 mRNA的表达缓解氧化应激。本试验结果说明酵母铬和二氢吡啶对HSP70表达的上调作用与热应激程度有关。
3.3 酵母铬和二氢吡啶对热应激奶牛血清生理生化指标的影响甲状腺功能受到机体代谢产热以及温度的调节，一般来说，环境温度越高，甲状腺激素分泌量越低。宋小珍等[38]研究发现，热应激使牛血清中T3含量下降，T4含量无显著变化。本试验结果显示，酵母铬对奶牛血清中T3和T4的含量没有产生显著影响，这与黎智峰等[39]的研究结果相似，即饲粮中有机铬对热应激奶山羊不同时间点血液中T3和T4含量及日平均含量无显著影响。本试验中二氢吡啶对热应激奶牛血清中T3、T4含量也没有产生显著影响，这与曹杰[28]的研究结果不同，这可能与二氢吡啶的添加量不同有关。
CK主要作用是在肌细胞中催化肌酸分解，供应能量。正常情况下，由于细胞膜的屏障作用CK不会逸出释放到血液中，而热应激时肌细胞受损，细胞膜通透性增加，血清中CK活性上升。何钦[40]研究发现各泌乳阶段奶牛在整个热应激过程血清中CK活性会随着热应激程度的增加而呈现出升高的趋势。在本试验中，THI为77.5和88.1时，酵母铬能显著降低血清中CK活性；在THI为77.5、85.7和88.1时，二氢吡啶能显著降低血清中CK活性。这一结果与杨游等[41]报道的在饲粮添加10 mg/kg烟酸铬能显著降低热应激奶牛血清中CK活性的结果相似。CK作为反映动物热应激状态的敏感指标，其在热应激下活性下降说明酵母铬和二氢吡啶对于保护热应激奶牛细胞内环境稳定，缓解热应激造成的伤害方面有一定的效果。ALP能促使磷酸根离子与钙离子(Ca2+)结合，减少血清中钙和磷含量，促进矿物质元素的沉积。研究表明热应激能显著提高奶牛血清中碱性磷酸酶ALP活性[42]。这与热应激奶牛采食量降低、钙和磷吸收能力下降有关。本试验数据显示，虽然没有显著差异，但酵母铬组和二氢吡啶组热应激奶牛血清中ALP活性均低于同一THI下的对照组，说明酵母铬和二氢吡啶能增强热应激奶牛对钙和磷的吸收能力，维持血钙稳定。
电解质平衡对维持奶牛内环境的稳定、机体代谢、生产性能具有极其重要的意义。热应激在一定程度上影响奶牛对水和矿物质的代谢。热应激过程中，采食量的降低会减少矿物元素的摄入量，唾液和汗腺的大量分泌流失加剧了Na+和K+的丧失，破坏电解质平衡[43]。本试验中，在THI为78.0时，酵母铬能显著升高血清中电解质平衡值，二氢吡啶则对血清中电解质平衡值无显著影响。这说明酵母铬对于缓解热应激引起的电解质代谢紊乱有一定的作用，可维持内环境的稳定。
4 结论① 酵母铬可以显著提高热应激奶牛的干物质采食量以及干物质、粗蛋白质和中性洗涤纤维的消化率；二氢吡啶可以显著提高热应激奶牛的干物质采食量和粗蛋白质的消化率。
② 酵母铬和二氢吡啶对热应激奶牛血液中HSP70表达的上调作用与热应激程度有关。当THI较高(达到85.7以上)时，酵母铬和二氢吡啶能显著升高HSP70 mRNA表达量。
③ 酵母铬和二氢吡啶对热应激奶牛血清中T3、T4含量及ALP活性无显著影响，对血清中CK活性的影响与THI有关；THI较低(为78.0)时，酵母铬能显著升高热应激奶牛血清中电解质平衡值，从而维持内环境稳定和酸碱平衡。
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