动物营养学报    2020, Vol. 32 Issue (1): 382-389    PDF    
冰水环境应激后及恢复期犬生理常数、血清急性期反应物及氧化还原指标的变化
贺绍君 , 宋凯 , 吴明明 , 殷启润 , 熊永洁 , 李静     
安徽科技学院动物科学学院, 滁州 233100
摘要: 为研究冰水环境应激后及恢复期犬生理常数、血清急性期反应物及氧化还原指标的变化,本试验选取健康中华田园犬8条,分别在冰水环境应激前、冰水环境应激结束时(置于冰水0.5 h后)以及冰水环境应激结束后恢复0.5、1.0、3.0、7.0 h时测定体温、心率、呼吸频率,并于颈静脉采血2 mL,测定血清中急性期应激反应物和氧化还原物质的活性或含量。结果显示:与冰水环境应激前相比,体温、心率及血清热休克蛋白70、皮质醇含量与过氧化氢酶活性在冰水环境应激结束时显著降低(P < 0.05),血清尿酸、总羰基、丙二醛含量则显著升高(P < 0.05);心率及血清维生素E、总羰基、丙二醛含量在冰水环境应激结束后0.5 h时恢复至冰水环境应激前水平(P ≥ 0.05);体温及血清皮质醇、巯基、尿酸含量和铜蓝蛋白活性在冰水环境应激结束后1.0 h时恢复至冰水环境应激前水平(P ≥ 0.05);血清维生素C含量在冰水环境应激结束后3.0 h时恢复至冰水环境应激前水平(P ≥ 0.05)。与冰水刺激结束时相比,犬恢复7.0 h时,其体温、心率及血清皮质醇、维生素E含量显著升高(P < 0.05),而呼吸频率及血清超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性与热休克蛋白70、尿酸、总羰基、丙二醛含量显著降低(P < 0.05)。由此得出,冰水环境应激可显著改变犬的生理常数、血清应激标志物含量和氧化还原状态,恢复期部分指标仍异常,提示临床上应积极采取保暖、补充抗氧化剂等措施缓解冰水环境应激的危害。
关键词:     冰水环境    生理常数    急性期反应物    氧化还原    
Changes of Physiological Constants, Serum Acute Phase Response Biomarkers and Redox Indexes of Canines after Ice Water Environment Stress and Subsequent Recovery
HE Shaojun , SONG Kai , WU Mingming , YIN Qirun , XIONG Yongjie , LI Jing     
College of Animal Science, Anhui Science and Technology University, Chuzhou 233100, China
Abstract: This study was conducted to investigate the changes of physiological constants, serum acute phase response biomarkers and redox indicators of canines after ice water environment stress and subsequent recovery. Eight healthy Chinese rural dogs were selected. The body temperature, heart rate and respiratory rate were measured and 2 mL blood was taken from the jugular vein before ice water environment stress, at the end of ice water environment stress (after 0.5 h in ice water) and recovery 0.5, 1.0, 3.0, and 7.0 h after the ice water environment stress, respectively. Serum was separated and the activities or contents of acute phase reaction biomarkers and redox substances in serum were determined. The results showed as follows:compared with before ice water environment stress, the body temperature, heart rate and serum heat shock protein 70 (HSP70), cortisol contents and catalase activity were significantly decreased at the end of ice water environment stress (P < 0.05), while the serum uric acid, carbonyl and malondialdehyde contents were significantly increased (P < 0.05). The heart rate, serum vitamin E, total carbonyl and malondialdehyde contents returned to the level of before ice water environment stress after 0.5 h of ice water environment stress (P ≥ 0.05). The body temperature, serum cortisol, sulfhydryl, uric acid contents and ceruloplasmin activity recovered to the level of before ice water environment stress after 1.0 h of ice water environment stress (P ≥ 0.05), while the serum vitamin C content returned to before ice water environment stress level after 3.0 h of ice water environment stress (P ≥ 0.05). Compared with the end of ice water environment stress, the body temperature, heart rate, serum cortisol and vitamin E contents increased significantly (P < 0.05), while the respiratory rate, serum total superoxide dismutase, catalase activities and HSP70, uric acid, total carbonyl, malondialdehyde contents decreased significantly when recovery 7.0 h after the ice water environment stress (P < 0.05). In conclusion, ice water environment stress can significantly change the physiological constants, serum stress biomarker contents and redox status of canines. Some indicators are still abnormal during the recovery period, which suggested that the clinical measures should be taken to keep warm and supplement antioxidants for controlling the hazards of ice water environment stress.
Key words: canines    ice water environment    physiological constants    acute-phase response biomarkers    redox    

作为一种环境应激因素,低温对人类和动物产生了严重的影响。犬由于冰上活动如救援、捕捞、娱乐等意外因素坠入冰水环境的现象时有发生。遭受冰水环境应激后,犬体内营养物质代谢紊乱、工作效率下降、免疫功能降低,甚至造成死亡[1]。研究冰水环境下其生理常数、血清急性期反应物及氧化还原指标的变化,对于及时监测冰水环境应激对犬的影响,确定犬应激发生危害的机制有重要意义。同时,可根据相关指标的变化情况,采取针对性缓解措施。研究表明,冰水环境能降低血液在血管中的循环效率,降低机体代谢效率和体温,同时引起血液中白细胞数量、皮质醇含量升高[2-3]。李云章等[4]报道,犬在遭受冰水环境的强烈刺激时其心脏功能发生显著改变,引起或者加剧其他疾病的病程。李静辉等[5]研究发现,小鼠冷应激(4 ℃)时血浆总抗氧化能力(T-AOC)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性上升。而Venditti等[6]报道,冷应激大鼠血清中蛋白质羰基化水平显著升高,表明冷应激对机体的氧化还原平衡有显著影响。犬特别是一些工作犬在执行任务时易受到冰水环境的应激,生理状态受到显著影响,体内物质代谢发生紊乱,影响体内的氧化还原物质的合成与代谢。发生冰水环境应激后,机体会积极动员体内潜能抵抗外来应激环境的变化,恢复体内动态平衡[7]。目前关于犬在冰水环境应激后及恢复期,其血清急性期反应物变化及抗氧化状态仍不清楚。本试验以中华田园犬为试验对象,研究冰水环境应激后及恢复期犬生理常数、血清急性期反应物和氧化还原指标的变化规律,探索临床上评价机体冰水环境应激的危害及恢复情况的重要代表性指标,并为通过调节机体生理和氧化还原状态减轻冰水环境对犬的危害提供理论参考。

1 材料与方法 1.1 试验动物及处理

选择体温、心率、呼吸频率均正常且年龄1.5~2.5岁、体重[(5.67±0.88) kg]相近的中华田园犬8条(4+4♀),单笼饲养,自由采食和饮水。饲喂全犬种通用型犬粮(营养标准:粗蛋白质含量≥28%;粗纤维含量≤4.5%;粗灰分含量≤9%;粗脂肪含量≥16%;钙含量≥1.1%;总磷含量≥0.9%)。

试验犬适应性饲养1周。正式试验开始后将试验犬置于人工冰水槽中0.5 h,保持脊柱与水平面平行。冰水环境应激结束后,迅速用干毛巾将犬身上的水擦干,置于温控试验台(30~40 ℃)上。分别在冰水环境应激前、冰水环境应激结束时及冰水环境应激结束后恢复0.5、1.0、3.0、7.0 h时进行体温、心率、呼吸频率测定,并于颈静脉采血2 mL,制备血清,待测。

1.2 指标测定

试验犬体温采用普通水银体温计进行测量,将体温计插入肛门4 cm左右,3 min取出读数;心率采用听诊器进行测量,在犬左侧第5肋间、胸壁下1/3的中央水平线上听取心音并计数;呼吸频率的测定是犬在自然状态下,根据胸廓和腹壁的起伏进行计数。为减少误差,安排2名实验员分别对上述3项指标同时进行测量,计算平均值。

血清急性期反应物及氧化还原物质含量或活性均采用试剂盒测定,测定步骤按照试剂盒说明书进行。其中,C-反应蛋白(CRP)、维生素C、维生素E、巯基(-SH)、总羰基、丙二醛(MDA)含量与铜蓝蛋白、总超氧化物歧化酶(T-SOD)、过氧化氢酶(CAT)、GSH-Px活性以及T-AOC测定所用试剂盒均购自南京建成生物工程研究所,尿酸(UA)含量测定所用试剂盒购自深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司,热休克蛋白70(HSP70)、皮质醇、8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)含量测定所用酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒均购自南京奥青生物技术有限公司。

1.3 数据处理与分析

试验数据以平均值±标准差表示。采用PASW Statistics 18.0软件对各时间点数据进行单因素重复测量方差分析,并采用LSD法进行多重比较。P < 0.05表示差异显著,P≥0.05表示差异不显著。

2 结果与分析 2.1 犬生理常数变化情况

表 1可以看出,与冰水环境应激前相比,冰水环境刺激结束时犬体温与心率均显著下降(P < 0.05);恢复0.5 h时犬体温仍显著下降(P < 0.05),但心率已无显著差异(P≥0.05);恢复1.0~7.0 h时犬呼吸频率出现显著降低(P < 0.05),但体温与心率无显著变化(P≥0.05)。

表 1 冰水环境应激对犬生理常数的影响 Table 1 Effects of ice water environment stress on physiological constants of canines
2.2 血清急性期反应物含量或活性变化情况

表 2可以看出,与冰水环境应激前相比,冰水环境应激结束时犬血清皮质醇和HSP70含量显著降低(P < 0.05);恢复0.5 h时血清铜蓝蛋白活性和皮质醇含量显著降低(P < 0.05);恢复7.0 h时血清HSP70含量显著降低(P < 0.05)。与冰水环境应激结束时相比,恢复7.0 h时血清皮质醇含量显著升高(P < 0.05)。血清CRP含量在整个试验期间未发生显著变化(P≥0.05)。

表 2 冰水环境应激对犬血清急性期反应物含量或活性的影响 Table 2 Effects of ice water environment stress on serum acute phase reaction biomarker contents/activities of canines
2.3 血清T-AOC及抗氧化酶活性变化情况

表 3可以看出,与冰水环境应激前相比,冰水环境应激结束时以及恢复0.5、1.0、3.0、7.0 h时犬血清CAT活性显著降低(P < 0.05),而血清T-AOC、T-SOD活性无显著变化(P≥0.05);恢复1.0、3.0、7.0 h时血清GSH-Px活性显著下降(P < 0.05)。与冰水环境应激结束时相比,恢复7.0 h时血清T-SOD和CAT活性显著降低(P < 0.05)。

表 3 冰水环境应激对犬血清T-AOC及抗氧化酶活性的影响 Table 3 Effects of ice water environment stress on serum T-AOC and antioxidant enzyme activities of canines  
2.4 血清抗氧化物质含量变化情况

表 4可以看出,与冰水环境应激前相比,冰水环境应激结束时以及恢复0.5 h时血清尿酸含量显著升高(P < 0.05);恢复0.5、1.0 h时血清维生素C含量显著增加(P < 0.05);恢复0.5、3.0 h时血清-SH含量显著增加(P < 0.05)。血清维生素E含量在试验过程中发生波动性变化,但冰水环境应激结束时以及各恢复时间点与冰水环境应激前相比差异均不显著(P≥0.05)。

表 4 冰水环境应激对犬血清抗氧化物质含量的影响 Table 4 Effects of ice water environment stress on serum antioxidant substance contents of canines
2.5 血清蛋白质、脂肪、DNA氧化损伤标志物含量变化情况

表 5可以看出,与冰水环境应激前相比,冰水环境应激结束时血清总羰基和MDA含量显著升高(P < 0.05);恢复1.0 h时血清总羰基含量显著降低(P < 0.05),而血清MDA含量显著升高(P < 0.05)。与冰水环境应激结束时相比,恢复7.0 h时血清总羰基和MDA含量均显著降低(P < 0.05)。血清8-OHdG含量各时间点间均无显著差异(P≥0.05)。

表 5 冰水环境应激对犬血清中蛋白质、脂肪、DNA氧化损伤标志物含量的影响 Table 5 Effects of ice water environment stress on serum contents of oxidation biomarkers of protein, lipid and DNA of canines
3 讨论 3.1 冰水环境应激对犬生理常数的影响

体温是判断机体产热和散热平衡的重要指标。Truxton等[3]的研究表明,通过改变机体所处外界温度可引起体温(直肠温度)按照0.11 ℃/min的速度上升或者下降。本试验结果表明,处在冰水环境下0.5 h时犬体温(直肠温度)降至35 ℃以下,表明冰水环境下机体产热量显著小于散热量,出现能量负平衡状态。本试验结果表明体温的下降程度可以作为冰水环境应激程度的重要指标;同时提示,冰水环境应激时,应迅速采取保温和升温措施,促使体温尽快恢复正常,以免体温过低对动物机体的危害。Ohashi等[8]研究发现,在冷应激环境下动物的心率显著增加。本研究表明,冰水环境应激结束时,犬心率显著降低,推测犬在冰水环境中持续0.5 h时心脏的代偿效应消失,进入失代偿期,提示在冰水环境应激后要监测心脏功能,及时使用增强心脏功能的药物,防止心力衰竭,造成突然死亡。恢复期的结果表明,犬体温、心率分别在恢复1.0、0.5 h时恢复至冰水环境应激前水平,表明及时脱离冰水环境对体温和心率的恢复有显著作用。呼吸是维持机体有氧代谢的重要条件。本研究表明,在冰水环境应激结束时犬呼吸频率无显著变化,这与Choo等[9]的研究报道一致;但在恢复1.0 h后,犬呼吸频率减少,可能是由于冰水环境应激导致机体内代谢物质发生改变,进而反馈性抑制呼吸而引起。结合体温、心率指标的变化,提示冰水环境应激恢复前期需要体温、心率的监护和治疗,而后期需要加强呼吸功能的维护。

3.2 冰水环境应激对犬血清急性期反应物含量或活性的影响

机体受到应激原刺激后数小时或数日内,血清中急性期反应物含量或活性会发生显著变化。皮质醇是重要的糖皮质激素,是机体遭受外界环境应激时分泌的重要的应激相关激素。犬在冷应激环境下血清皮质激素含量的变化报道不一。小型犬在受到冷刺激0.5 h时,其血清皮质醇含量显著升高[1]。Nelson等[10]研究表明,犬在-10 ℃低温下,其血清中17-羟皮质类固醇含量的变化并无显著规律。而Palazzolo等[11]研究表明,犬在冷应激环境下其血清皮质醇含量未发生显著变化。本试验研究表明,与冰水环境应激前相比,冰水环境应激结束时血清皮质醇含量未发生显著变化,而在恢复期血清皮质醇含量逐渐升高,且变异系数大,与Nelson等[10]报道结果类似。上述结果表明,机体在受到冰水环境应激因素影响时,血清皮质醇含量可作为冰水环境应激程度的重要指征之一。HSP70是在多种环境应激下机体产生的一种保护性蛋白。Kapakiin等[12]研究表明,轻度的冷应激或应激时间较短时,血清中HSP70含量显著升高,当应激程度严重或者应激时间较长,血清HSP70含量不发生显著改变或者降低。本试验结果表明,经冰水环境应激后犬血清HSP70含量显著降低,表明冰水环境应激对犬机体的刺激程度较大,抑制了机体HSP70的生成。本试验结果还发现,在恢复期,随着时间的延长,犬血清HSP70含量先升高后降低,发生了显著的波动,表明热休克蛋白的产生与冰水环境应激恢复的时间密切相关,可作为冰水环境应激恢复情况的重要标志之一。CRP是机体对外界应激产生的重要保护性反应蛋白之一。有关机体冷应激时血清CRP含量变化的研究较少。Hejazi等[13]研究显示电刺激应激时大鼠的血压升高,同时血清中CRP含量显著升高。本试验结果表明,冰水环境应激对犬血清CRP含量无显著影响。与CRP和HSP70相比,铜蓝蛋白是一种相对低反应的急性期反蛋白质。本试验结果表明,与冰水环境应激前相比,恢复0.5 h时血清铜蓝蛋白活性显著降低,这与Akhalaya等[14]的报道一致。其原因与铜蓝蛋白具有很强的抗氧化功能有关,即随着冰水环境应激时间的延长,机体体内的超氧阴离子增多,会引起消耗过多的铜蓝蛋白活性中心,导致其活性在恢复0.5 h时降至最低;而随着恢复时间的延长,铜蓝蛋白活性缓慢恢复至正常水平,表明其可与HSP70含量来协同评价冰水环境应激的程度及恢复情况。

3.3 冰水环境应激对犬血清T-AOC和抗氧化酶活性的影响

T-AOC可反映机体酶性和非酶性抗氧化物的综合能力。Dugué等[15]研究表明,在发生冬泳冷应激时血浆T-AOC显著升高。李静辉等[5]研究表明,小鼠冷应激(4 ℃)4和8 h后,血清T-AOC略有升高。Sutkowy等[16]则认为低温环境对人的血清T-AOC及超氧化物歧化酶(SOD)、CAT活性并无显著影响。本试验较高表明,犬血清T-AOC在试验过程中未发生显著变化。冰水环境下动物机体代谢过程紊乱,氧自由基的产生量增加,机体为调动自身能力抵抗外来不良环境刺激,动员机体内氧化还原能力,其增加的抗氧化能力用于清除自由基,导致T-AOC净结果没有发生改变。机体内GSH-Px、SOD、CAT构成酶促抗氧化体系。Lubkowska等[17]的研究表明,冷刺激(冷冻治疗)对血清CAT活性无显著影响,血清T-SOD和GSH-Px活性升高。机体内T-SOD通过催化超氧阴离子发生歧化反应清除自由基。李静辉等[5]发现小鼠冷应激(4 ℃)4和8 h后,血清GSH-Px活性显著上升,而SOD活性显著下降。Ren等[18]研究表明,冷应激时鹌鹑脾脏中SOD活性降低,而GSH-Px活性增加。本试验结果表明,冰水环境应激对血清T-SOD活性无显著影响,恢复7.0 h时血清T-SOD活性降低,表明机体在应激发生时动员贮备或合成T-SOD及时补充消耗的T-SOD,而在恢复7.0 h时机体T-SOD过度消耗,表现其活性显著下降。犬冰水环境应激恢复1.0 h时,体温和心率恢复正常,但GSH-Px、CAT活性仍显著降低,一方面表明这2种酶在消除由冰水环境引起的氧化应激中扮演了重要了角色,另一方面也表明冰水环境应激对这2种酶活性的影响需要较长的时间才能恢复。上述结果还提示,为防止由于冰水环境应激造成的抗氧化酶如CAT活性的降低,恢复期应给予适量的抗氧化剂以提高机体的抗氧化能力,同时节约机体自身的抗氧化物质,增强抗氧化酶的活性,防止氧自由基对机体蛋白质、DNA和脂质的损伤。

3.4 冰水环境应激对犬血清氧化还原物质含量的影响

机体的氧化还原平衡需要机体内多种氧化还原物质的参与。维生素C通过提供2个电子发挥直接清除自由基作用;同时,它还可使被氧化的维生素E和-SH恢复成原型,发挥间接抗氧化作用。Siems等[19]研究表明急性冷应激状态下血浆中维生素C、尿素的含量降低,而Yang等[20]研究表明冷应激后血清中维生素C含量升高,表明冷应激时间的长短与血清中抗氧化能力的变化密切相关。Akhalaya等[14]研究表明,冷应激后血清非蛋白-SH含量显著升高。本试验结果表明,冰水环境应激引起犬血清维生素C含量升高,表明机体为缓解冰水环境的危害启动自身维生素C贮备发挥抗氧化作用。但随冰水环境应激的去除,血清中维生素C含量逐渐恢复至正常水平,表明冰水环境应激解除后机体的维生素C合成、分解和贮备恢复正常。冰水环境应激恢复过程中血清维生素E、-SH的含量波动性变化的机理目前尚无相关报道,推测其与机体2种抗氧化物质的周期性释放有关。血液中高水平的尿素可与羟基自由基、过氧化氢发生氧化反应,发挥抗氧化作用,保护细胞免受脂质过氧化和细胞溶解的攻击。这种抗氧化作用与血清中尿酸的含量密切相关,轻微水平的高尿酸血症即可使尿酸由抗氧化剂向促氧化剂转变。本试验结果表明冰水环境应激显著增加犬血清尿酸含量,而在恢复期血清尿酸含量又迅速降低。这一过程中尿素主要是发挥抗氧化作用还是促氧化作用需要进一步研究。

3.5 冰水环境对犬血清蛋白质、脂肪、DNA氧化损伤标志物含量的影响

机体自身抗氧化系统受到体内产生的过量自由基影响时发生氧化应激,进而导致蛋白质羰基化、脂质和DNA氧化损伤。Venditti等[6]的研究表明,冷应激大鼠血清中蛋白质羰基化水平显著升高。本试验表明,冰水环境应激结束时,血清中总羰基含量显著升高,表明机体受到冰水环境应激生成的自由基过剩,引起机体蛋白质羰基化程度增加,但恢复0.5 h后犬血清总羰基含量有明显的逆转作用,表明冰水环境应激对蛋白质羰基化影响显著,血清总羰基含量可作为冰水环境应激程度及恢复情况的重要指标之一。MDA是脂质过氧化及细胞膜过氧化程度的重要指标。Zhang等[21]研究表明,冷应激引起家禽血清MDA含量显著升高。本试验表明,冰水环境应激引起犬血清MDA含量显著升高,且恢复1.0 h血清MDA含量最高,表明冰水环境应激引起的犬脂质过氧化作用在冰水环境应激结束后的早期恢复阶段持续进行。结合血清抗氧化酶活性和抗氧化物质含量的结果可以发现,机体在恢复期呈现了显著的氧化损伤和抗氧化损伤反应。羟自由基和超氧阴离子损伤DNA后主要产生8-OHdG。王一璇等[22]研究表明,冷应激时大鼠血清中8-OHdG含量显著上升。本试验结果表明,冰水环境应激对犬血清8-OHdG含量无显著影响,与王一璇等[22]的研究结果不一致,可能与试验动物种类和冷应激的程度和持续时间不同有关。

4 结论

冰水环境能显著改变犬部分生理常数、急性期反应物及氧化还原指标含量或活性。与冰水环境应激前相比,犬恢复7.0 h后,其体温、心率及血清皮质酮、维生素E含量与铜蓝蛋白活性恢复正常,而呼吸频率及血清GSH-Px、CAT活性与HSP70、尿酸、MDA含量显著降低。临床上可根据犬三大生理常数,血清皮质醇、总羰基和MDA等物质的含量以及GSH-Px、CAT活性的动态变化,评价冰水环境对机体的危害及机体在冰水环境应激后的恢复状况,同时提示犬受到冰水环境应激时应通过加强升温、保暖措施,及时给予适量抗氧化剂调节机体氧化还原平衡,最终减轻冰水环境应激对动物造成的危害。

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