2. 江苏省农业种质资源保护与利用平台, 南京 210014;
3. 泰兴瑞泰化工有限公司, 泰州 225453
2. Jiangsu Germplasm Resources Protection and Utilization Platform, Nanjing 210014, China;
3. Taixing Ruitai Chemical Co., Ltd., Taizhou 225453, China
仔猪在保育期面临多种应激，导致肠道屏障功能发生紊乱，出现肠黏膜受损、肠免疫系统失调等问题，易引起仔猪腹泻、生长性能下降。生产实践中广泛通过添加抗生素来降低腹泻和促进生长。由抗生素滥用造成的细菌耐受性以及药物残留引起的食品安全问题日益突出，我国农业农村部已规定2020年在饲料端全面禁止抗生素用于动物保健。因此，使用绿色安全高效的饲料添加剂来替代抗生素成为畜牧业的研究热点。地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)隶属于芽孢杆菌属，其能厌氧繁殖，更易于在肠道内萌发生长，成为了近年来益生菌菌株研发的热点。地衣芽孢杆菌能够分泌多种消化酶、营养物质和抗菌物质，而这些物质在提高畜禽生长性能、改善肠道形态、增强免疫能力等方面[1-2]具有良好的应用效果。Yang等[3]发现，地衣芽孢杆菌能够提高肉鸡的末体重和日增重，提高肠黏膜的抗氧化能力和免疫能力，降低死亡率。Lan等[4]、Zong等[5]研究表明，地衣芽孢杆菌能显著改善断奶仔猪肠道对养分的消化率，减少肠道病原菌，提高其肠绒毛高度和绒隐比，改善肠道形态，提高免疫能力。目前地衣芽孢杆菌在生产上的使用都是预防性添加在饲粮中，地衣芽孢杆菌是否能缓解急性应激鲜有报道。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分之一，进入体内可导致大量自由基产生，常作为模拟应激的经典模型[6-7]。鉴于此，本试验以腹腔注射LPS构建仔猪免疫应激模型，研究地衣芽孢杆菌对应激仔猪肠道形态、抗氧化和免疫力的影响，探讨地衣芽孢杆菌对应激仔猪肠道损伤能的缓解作用，为地衣芽孢杆菌在养猪生产中的应用提供理论参考。
1 材料与方法 1.1 试验材料地衣芽孢杆菌(1.0×1010 CFU/g)，由美国辉瑞动物保健品有限公司提供。LPS购自Sigma公司，大肠杆菌血清型055 : B5，使用时用0.9%生理盐水稀释成浓度为500 μg/mL的LPS溶液。
1.2 基础饲粮与试验设计基础饲粮参照NRC(2012)猪的营养需要配制。基础饲粮组成及营养水平见表 1。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) |
试验选取35日龄、平均体重为(10.0±0.5) kg的苏山猪90头，按照平均分配原则随机分成3个组，每组3个重复，每个重复10头仔猪。其中，对照组和LPS组仔猪均饲喂基础饲粮；BL+LPS组仔猪饲喂添加500 mg/kg地衣芽孢杆菌的基础饲粮。饲养试验于江苏省农业科院六合基地猪场进行。预试期3 d，正试期21 d，试验期间猪只自由采食及饮水。于正试期第21天08:00空腹称重，在LPS组和BL+LPS组的每个重复中取2头仔猪腹膜注射150 μg/kg BW的LPS，同时在对照组的每个重复中取2头仔猪腹膜注射相应剂量的灭菌生理盐水，注射24 h后仔猪屠宰取样。
1.3 样品的采集与制备在饲养试验开始前和结束时(未注射LPS前)称量各组仔猪体重，统计正试期内采食量，计算各组的平均日增重、平均日采食量和料重比。
仔猪屠宰前分别采集10 mL非抗凝血和10 mL抗凝血，静置后在低温离心机中4 000 r/min离心15 min分别取血浆与血清，于-20 ℃保存；屠宰后分离十二指肠、空肠、回肠，将内容物挤出，分别取十二指肠(距幽门约5 cm)、空肠(中间)、回肠(距回肠末端约20 cm)1.5 cm左右的肠段放入4%甲醛溶液中固定；另取小肠各段10 cm左右，用手术剪将肠段纵向剪开，然后用载玻片刮取黏膜，装于冻存管于液氮中保存。
1.4 指标检测及其方法 1.4.1 应激因子指标血浆和小肠黏膜中二胺氧化酶(DAO)、一氧化氮合成酶(NOS)活性和一氧化氮(NO)含量采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒检测，主要仪器为EON多功能酶标仪(美国伯腾仪器有限公司)。
1.4.2 肠道形态和肠道上皮细胞中淋巴细胞和杯状细胞数量的测定切片制作步骤：肠道组织修整→脱水→透明→浸蜡→包埋→切片。苏木精-伊红(HE)染色步骤：二甲苯脱蜡→脱二甲苯→染色→脱水→透明→封片。每个样品做3张不连续的切片，用Olympus显微镜观察，Shineso显微图像分析系统(杭州迅数)进行拍照分析，每张切片测定5根完整绒毛的绒毛高度和隐窝深度，并计算绒隐比(绒隐比=绒毛高度/隐窝深度)。
HE染色切片和糖原及多糖高碘酸-Schiff液(PAS)染色切片对肠道上皮细胞中淋巴细胞和杯状细胞进行观察计数。用Olympus显微镜观察，Shineso显微图像分析系统进行拍照。每个样品取2张切片，每张切片取5个放大400倍的视野，进行上皮细胞中淋巴细胞和杯状细胞计数，结果用每100个上皮细胞中淋巴细胞或杯状细胞的个数来表示[8]。
1.4.3 肠黏膜抗氧化指标取肠黏膜样品约0.3 g，按照1 : 9的质量体积比加入4 ℃生理盐水，冰浴匀浆，匀浆液于4 ℃、4 000 r/min离心10 min取上清液待测。所检测指标包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性以及总抗氧化能力(T-AOC)，以上指标均采用试剂盒(南京建成生物工程研究所产品)测定。
1.4.4 免疫因子含量取回肠黏膜组织匀浆上清液，检测细胞免疫因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)含量；取血清，采用试剂盒测定免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)含量，试剂盒购自南京建成生物工程研究所。
1.5 数据统计与分析试验数据先用Excel 2010初步处理后，采用SPSS 20.0统计软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，并采用Duncan氏法进行多重比较，P < 0.05表示差异显著。试验数据用“平均值±标准差”表示。
2 结果与分析 2.1 地衣芽胞杆菌对仔猪生长性能的影响由表 2可知，与对照组相比，饲粮中添加地衣芽胞杆菌能够在一定程度上提高仔猪的平均日增重、平均日采食量，降低料重比，但差异均不显著(P＞0.05)，其中，平均日采食量、平均日增重比对照组分别提高2.76%、4.72%。
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表 2 地衣芽胞杆菌对仔猪生长性能的影响 Table 2 Effects of Bacillus licheniformis on growth performance of piglets |
由表 2可知，与对照组相比，LPS应激显著降低了仔猪十二指肠DAO、空肠NOS活性及空肠NO含量(P < 0.05)，显著提高了血浆NO含量和NOS活性(P < 0.05)；与LPS组相比，饲粮中添加地衣芽孢杆菌显著提高了回肠DAO和NOS活性(P < 0.05)，减缓了LPS应激引起的空肠NO含量下降(P>0.05)。
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表 2 地衣芽孢杆菌对LPS应激仔猪DAO、NOS活性和NO含量的影响 Table 2 Effects of Bacillus licheniformis on DAO and NOS activities, and NO content of LPS-stressed piglets |
由表 3可知，与对照组相比，LPS应激显著降低了空肠的绒毛高度、绒隐比和回肠的绒隐比(P < 0.05)；与LPS组相比，饲粮中添加地衣芽孢杆菌减缓了LPS应激引起的空肠绒毛高度和绒隐比的下降(P>0.05)。
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表 3 地衣芽孢杆菌对LPS应激仔猪肠道形态的影响 Table 3 Effects of Bacillus licheniformis on intestinal morphology of LPS-stressed piglets |
由表 4可以看出，与对照组相比，LPS应激显著降低了空肠上皮细胞中淋巴细胞、空肠和回肠上皮细胞中杯状细胞数量(P < 0.05)；与LPS组相比，饲粮中添加地衣芽孢杆菌对仔猪肠道上皮细胞中淋巴细胞和杯状细胞数量无显著影响(P>0.05)。
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表 4 地衣芽孢杆菌对LPS应激仔猪肠道上皮细胞中淋巴细胞和杯状细胞数量的影响 Table 4 Effects of Bacillus licheniformis on lymphocyte and goblet cell counts in intestinal epithelial cells of LPS-stressed piglets |
由表 5可知，LPS组仔猪十二指肠、空肠、回肠黏膜GSH-Px活性和十二指肠、回肠黏膜SOD活性显著低于对照组(P < 0.05)；与LPS组相比，BL+LPS组仔猪空肠黏膜GSH-Px活性显著提高(P < 0.05)，十二指肠黏膜MDA含量显著降低(P < 0.05)，饲粮中添加地衣芽孢杆菌减缓了LPS应激引起的十二指肠、回肠黏膜GSH-Px活性和十二指肠黏膜SOD活性的下降(P>0.05)；与对照组相比，BL+LPS组十二指肠、空肠黏膜MDA含量显著降低(P < 0.05)。
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表 5 地衣芽孢杆菌对LPS应激仔猪肠黏膜抗氧化指标的影响 Table 5 Effects of Bacillus licheniformis on intestinal mucosal antioxidant indices of LPS-stressed piglets |
由表 6可知，与对照组相比，LPS应激显著降低了血清IgG含量，显著提高了回肠黏膜IL-6和IL-1β含量(P < 0.05)；与LPS组相比，饲粮中添加地衣芽孢杆菌显著提高了血清IgG含量(P < 0.05)，减缓了LPS应激引起的回肠黏膜IL-1β含量的上升(P>0.05)。
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表 6 地衣芽孢杆菌对LPS应激仔猪免疫指标的影响 Table 6 Effects of Bacillus licheniformis on immune indices of LPS-stressed piglets |
肠黏膜细胞受损或脱落时，DAO和NOS会释放入肠细胞间隙淋巴管和血管，或随坏死脱落的肠黏膜细胞进入肠腔内，导致血液中DAO和NOS活性升高，而肠黏膜DAO和NOS活性则与之呈负相关。LPS应激会导致肠黏膜组织出现损伤，引起肠黏膜中DAO活性下降，血浆中DAO的活性上升，从而引起畜禽出现炎症现象[9]。Li等[10]报道，芽孢杆菌可改善炎症引起的肠黏膜DAO活性的降低，减轻LPS注射引起的肠黏膜损伤。Lei等[11]研究表明，在蛋鸡饲粮中添加地衣芽孢杆菌能够显著降低血浆中DAO活性，减少应激反应，上调生长激素表达水平，改善肠道健康。Zhang等[12]结果表明，给日本对虾口服地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌可显著提高其肠道NOS等免疫酶的活性，提高其非特异性免疫能力。本试验中，LPS应激显著降低了仔猪十二指肠、空肠、回肠DAO和回肠NOS活性，提高了血浆中NO含量和NOS活性，表明注射LPS对仔猪产生应激效应，引起仔猪肠黏膜屏障损伤；地衣芽孢杆菌可显著改善LPS引起的回肠中DAO和NOS活性的下降，具有提高空肠DAO活性，降低血浆NOS活性和NO含量的趋势，表明地衣芽孢杆菌对LPS应激引起的肠黏膜损伤有改善作用。芽孢杆菌可促进黏蛋白2(MUC2)分泌细胞发育及分泌[13]，提高闭锁小带蛋白-1(ZO-1)、闭锁蛋白(OCLN)等紧密蛋白基因的表达量[14]。因此，地衣芽孢杆菌可能通过维护肠道上皮细胞紧密连接结构，调节黏膜屏障渗透性，从而减轻LPS应激对肠黏膜屏障的侵害。
3.2 地衣芽孢杆菌对LPS应激仔猪肠道形态及肠道上皮细胞中淋巴细胞和杯状细胞数量的影响仔猪肠黏膜形态结构的完整性是其有效利用饲料养分、保持健康生长的基础，而绒毛高度、隐窝深度及绒隐比是反映肠黏膜形态结构完整性的重要指标，绒毛高度和绒隐比的增加、隐窝深度的降低都有利于畜禽对营养物质消化吸收。通常情况下，绒毛高度与肠上皮细胞数量呈正相关性，隐窝深度可反映肠上皮细胞的生成率，即隐窝深度越浅，细胞增殖速率越高；而绒隐比则能反映小肠的功能状态，比值上升表明消化吸收功能增强、生长发育加快，比值下降则消化吸收功能下降、黏膜受损[15-17]。研究表明，LPS应激会影响畜禽肠道的发育模式，导致肠黏膜屏障功能损伤，引起肠道绒毛高度、隐窝深度、绒隐比等指标发生改变，进而影响畜禽的消化吸收和生长发育。Zong等[5]发现，饲喂仔猪地衣芽孢杆菌后，与对照组相比，其肠道中绒毛高度和绒隐比显著提高。本试验中，LPS应激使得仔猪空肠绒毛高度、绒隐比和回肠绒隐比显著降低，导致仔猪肠道形态结构出现损伤；而预防性添加地衣芽孢杆菌，可能通过提高肠道益生菌数量，分泌细菌酶[18]，一定程度上提高了因LPS应激导致的肠道绒毛高度和绒隐比的下降，进而达到对肠黏膜形态结构和功能的改善。本试验中，LPS应激导致肠上皮细胞中淋巴细胞和杯状细胞的数量显著下降，表明肠黏膜受到了损伤，从免疫指标上看，地衣芽孢杆菌对LPS应激引起的肠黏膜损伤无明显改善作用，这可能与地衣芽孢杆菌的添加量、饲养环境、LPS攻毒效果等因素有关。
3.3 地衣芽孢杆菌对LPS应激仔猪肠黏膜抗氧化能力的影响当畜禽肠黏膜抗氧化能力下降时，氧化应激会引起肠细胞免疫能力下降和凋亡，诱导肠道细胞旁渗透途径的通透性升高，降低氧化还原敏感型细胞膜骨架蛋白的表达水平，从而引起炎症反应，导致肠黏膜屏障功能出现紊乱[19-21]。研究表明，LPS会增加畜禽的氧化应激，并降低其相关抗氧化酶的活性，加速脂质过氧化物的沉积，降低畜禽的抗氧化能力；LPS应激会诱导肠黏膜结构和功能破坏，抑制紧密连接蛋白的表达和相关抗氧化酶的分泌，引起肠道通透性上升，从而引发炎症反应[22-23]。Li等[10]发现，芽孢杆菌可改善LPS应激引起的肉鸡肠道MDA含量的上升，提高肠道GSH-Px的活性和紧密连接蛋白的表达量。本试验结果显示，LPS应激降低了仔猪肠黏膜的抗氧化能力；而地衣芽孢杆菌可显著改善因LPS应激引起的抗氧化酶活性的下降，提高肠道黏膜中GSH-Px活性，降低MDA含量，并在一定程度上改善SOD活性。张甜甜等[24]在研究芽孢杆菌肽聚糖时发现，肽聚糖能优先占位定植竞争β-伴大豆球蛋白(β-conglycinin)与肠细胞结合位点，从而缓解β-伴大豆球蛋白引起的氧化应激。芽孢杆菌能够促进肠道上皮细胞的发育，诱导其分泌相应抗氧化酶，提高畜禽肠道抗氧化酶活性和自由基清除能力，从而提高肠黏膜抗氧化能力[25]。因此，地衣芽孢杆菌可能一方面通过肽聚糖等营养因子占位定植以阻止病原体对上皮细胞的应激反应，另一方面通过分泌抗氧化酶，间接缓解炎症反应，防御氧化损伤。
3.4 地衣芽孢杆菌对LPS应激仔猪免疫指标的影响免疫球蛋白是机体免疫系统中关键的免疫活性分子之一，是体液免疫的主要反应物质，其主要由浆细胞产生，具有识别和清除特异性抗原的作用，可反映体液免疫状态[26]。细胞因子和趋化因子是机体免疫反应和炎性应答过程的重要调节介质。当组织损伤或发生感染时，趋化因子单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)可将单核细胞、记忆T淋巴细胞以及树突细胞募集至炎症反应部位[27]。Han等[28]研究表明，LPS应激可诱导促炎介质及促炎症细胞因子如NO、TNF-α、IL-6、IL-1β等的产生。Giri等[29]发现，地衣芽孢杆菌能够有效提高嗜水气单胞菌攻毒后草鱼的免疫球蛋白含量，降低促炎细胞因子TNF-α和IL-1β的表达量，提高白细胞介素-10(IL-10)、转化生长因子-β(TGF-β)等抗炎因子的表达量。Zhen等[30]研究表明，肠炎沙门氏菌攻毒肉鸡后，显著降低了γ-干扰素(IFN-γ)、IgG、IgA等免疫因子的表达量，且分泌免疫蛋白的淋巴细胞数量显著降低；饲喂芽孢杆菌可有效改善攻毒所引起的促炎性因子表达量上调，提高IFN-γ、IgG、IgA等免疫因子的表达量，缓解炎症反应。本试验中，LPS应激显著降低了仔猪血清IgG含量，提高了回肠黏膜IL-6和IL-1β含量，表明LPS应激引发仔猪产生炎症反应，导致仔猪肠黏膜免疫屏障受损；与LPS组相比，饲粮中添加地衣芽孢杆菌显著提高了LPS应激仔猪血清IgG含量，并使回肠黏膜IL-1β含量有所降低，原因可能是地衣芽孢杆菌一方面通过促进肠黏膜下树突状细胞(DCs)的增殖分化[31]，提高IgG的分泌量，另一方面可能与芽孢杆菌细胞壁的主要成分肽聚糖有关，肽聚糖可显著抑制RAW-264.7细胞下游核因子-κB(NF-κB)途径，降低IL-1β和TNF-α mRNA的表达与释放[32]，抑制炎症反应的发生。
4 结论LPS应激导致仔猪肠黏膜损伤，在饲粮中添加地衣芽孢杆菌可提高LPS应激仔猪肠黏膜的抗氧化能力和免疫力，一定程度上促进肠道形态的修复，减缓LPS应激导致的肠道损伤。
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