动物营养学报    2019, Vol. 32 Issue (2): 726-735    PDF    
引用本文
李倜宇, 石璐璐, 闫素梅, 史彬林. 壳聚糖对泌乳中期奶牛一氧化氮免疫调节途径的影响[J]. 动物营养学报, 2019, 32(2): 726-735.  
LI Tiyu, SHI Lulu, YAN Sumei, SHI Binlin. Effects of Chitosan on Nitric Oxide Immune Regulating Pathway in Mid-Lactating Dairy Cows[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2019, 32(2): 726-735.  
壳聚糖对泌乳中期奶牛一氧化氮免疫调节途径的影响
李倜宇 , 石璐璐 , 闫素梅 , 史彬林     
内蒙古农业大学动物科学学院, 呼和浩特 010018
收稿日期: 2019-08-05
基金项目: 国家自然科学基金项目（31672463）
作者简介: 李倜宇(1987-), 男, 内蒙古锡林郭勒人, 博士研究生, 研究方向为动物环境与营养。E-mail:litiyu2050@163.com.
通信作者: 史彬林, 教授, 博士生导师, E-mail:shibinlin@yeah.net.
摘要: 本试验利用体内试验和体外试验研究壳聚糖（CHI）对泌乳中期奶牛一氧化氮（NO）免疫调节途径的影响。体内试验：按产奶量、泌乳期、胎次和体重相近的原则，将40头泌乳中期荷斯坦奶牛随机分为5个处理，每个处理8个重复，每个重复1头牛。各处理分别在基础饲粮中添加0、500、1 000、1 500和2 000 mg/kg的CHI。试验期60 d，其中1~30 d为前期，31~60 d为后期。试验期间奶牛自由采食和饮水。体外试验：分为2个子试验，每个试验均采用2×2×2三因子设计，即2个脂多糖（LPS）添加水平（0和10 μg/mL）×2个壳寡糖（COS）添加水平（0和160 μg/mL）×2个抑制剂添加水平（添加和不添加），共8个处理，每个处理6个重复。2个子试验的抑制剂分别是诱导型一氧化氮合酶（iNOS）抑制剂1400W（添加水平1 mmol/L）和核转录因子-κB（NF-κB）抑制剂PDTC（添加水平10 mmol/L）。体内试验结果表明：在试验第60天，血清中NO含量随CHI添加水平增加呈极显著的一次线性（P < 0.01）或二次曲线（P < 0.01）升高效应，iNOS活性呈趋于显著的一次线性（0.05≤P < 0.10）或显著的二次曲线（P < 0.05）升高效应；外周血单个核细胞（PBMCs）中iNOS和NF-κB基因表达量均呈趋于显著的一次线性（0.05≤P < 0.10）或显著的二次曲线（P < 0.05）升高效应；上述指标在1 500 mg/kg添加水平表现为最高。体外试验结果表明：1）当1400W作为抑制剂，COS显著增加iNOS基因表达量（P < 0.05）；1400W极显著降低NO含量和iNOS活性（P < 0.01）。2）当PDTC作为抑制剂，PDTC显著降低NO含量（P < 0.05），极显著降低iNOS和NF-κB的基因表达量（P < 0.01）。3）在脂多糖（LPS）刺激的条件下，NO含量、iNOS活性和iNOS基因表达量均极显著增加（P < 0.01），而对NF-κB基因表达量无显著影响（P>0.05）；而添加COS又能够缓解LPS引起的NO含量、iNOS活性和iNOS基因表达量的升高。上述结果提示，COS可通过增加iNOS和NF-κB的基因表达量，升高iNOS的活性，从而增加机体内NO的产生，对奶牛免疫功能起到调节作用，而且这种作用呈现剂量依赖效应。此外，COS引起的PBMCs中NO含量的升高，是通过增加iNOS和NF-κB的基因表达量，提高iNOS活性来完成的，且COS对奶牛PBMCs中NO途径的相关指标具有双向调节作用。综上所述，CHI可通过NO分子途径发挥免疫调节功能，且添加水平为1 500 mg/kg时效果最佳。
关键词: 壳聚糖    奶牛    一氧化氮    免疫调节    
Effects of Chitosan on Nitric Oxide Immune Regulating Pathway in Mid-Lactating Dairy Cows
LI Tiyu , SHI Lulu , YAN Sumei , SHI Binlin     
College of Animal Science, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China
Corresponding author: SHI Binlin, professor, E-mail:shibinlin@yeah.net.
Abstract: In vivo and in vitro methods were performed in this experiment to study the effects of chitosan (CHI) on nitric oxide (NO) immune regulating pathway in mid-lactating dairy cows. Method in vivo:a total of forty heathy mid-lactating Holstein cows with similar milk yield, days in lactation, parturition date and body weight were randomly divided into five treatments, eight replicates per treatment. The five experimental diets contained, respectively, 0, 500, 1 000, 1 500 or 2 000 mg/kg CHI. Feeding trial lasted for 60 days, and was divided equally into two phases, namely 1 to 30 days (earlier period) and 31 to 60 days (later period). Cows had free access to diets and water during the trial. Method in vitro:experiment consisted of two sub-experiments and adopted 2×2×2 factor design, with 2 lipopolysaccharide (LPS) treatments (0 and 10 μg/mL), 2 chitosan oligosaccharide (COS) treatments (0 and 160 μg/mL) and 2 inhibitors (adding inhibitor and without inhibitor). There were 8 treatments in total, with 6 replicates per treatment. Two sub-experiments used respectively inducible nitric oxide synthase (iNOS) inhibitor 1400W (1 mmol/L) and nuclear transcription factor-κB (NF-κB) inhibitor PDTC (10 mmol/L). The in vivo method results showed as follows:with the increasing of the CHI addition level, NO content showed significant linear (P < 0.01) or quadratic (P < 0.01) increasing effects, and iNOS activity tended to be linear (0.05 ≤ P < 0.10) or significant quadratic (P < 0.05) increasing effects on day 60; the gene expressions of iNOS and NF-κB showed linear increasing trends (0.05 ≤ P < 0.10) or significant quadratic increasing effects (P < 0.05), with 1500 mg/kg being the optimum dosage in vivo. The in vitro method results showed as follows:1) when 1400W as an inhibitor, COS could significantly increase iNOS gene expression in PBMCs (P < 0.05); 1400W could significantly decrease NO content and iNOS activity (P < 0.01). 2) When PDTC as an inhibitor, PDTC could significantly decrease NO content (P < 0.05) and gene expressions of iNOS and NF-κB (P < 0.01); there were also interactions between COS and 1400W, PDTC in terms of above indicators. 3) Moreover, in LPS-stimulated conditions, LPS enhanced NO content, iNOS activity and iNOS gene expression significantly (P < 0.01), and had no significant effect on NF-κB gene expression (P>0.05). Besides, adding COS could decrease NO content, iNOS activity and iNOS gene expression in comparison with in the absence of LPS stimulation. The results suggested that CHI can dose-dependently affect immune function of dairy cows by increasing gene expression level of iNOS and NF-κB, improving the activity of iNOS, stimulating the releasing of NO from immunological cells. Furthermore, COS-induced improvement of NO contents in PBMCs is a result of up-regulation of iNOS and NF-κB gene expression, and improvement of iNOS activity. COS can dual-directionally regulate key factors of NO pathway in PBMCs. In conclusion, CHI can exert immune regulation function via NO molecular pathway. The addition level of 1 500 mg/kg is considered as the optimum level of CHI.
Key words: chitosan    dairy cow    nitric oxide    immune regulation    

一氧化氮(nitric oxide，NO)为生物体内的活性氮自由基，也是一种重要的信使分子，在调节机体免疫功能和炎症反应方面起着关键性作用。细胞内的L-精氨酸(arginine，Arg)经一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)催化，利用氧分子进行脱氨基进而产生内源性NO，其含量与机体多种信号通路的活化密切相关[1]。NOS是合成NO的关键酶，主要包括神经型(nNOS)、内皮型(eNOS)和诱导型(iNOS)3种亚型。在生理状态下iNOS表达量很低，但当机体感染病菌或产生炎症时，细胞受到病原微生物或炎症细胞因子等细胞外刺激，机体通过活化核转录因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)提高iNOS的基因转录与表达，使生物体内产生大量NO，产生一系列的促炎作用[2-3]。研究已表明，NF-κB的结合位点出现在iNOS启动子上，并作为iNOS基因的主要转录调控器广泛存在于哺乳动物细胞中[4]。

壳聚糖(chitosan，CHI)是一种天然的碱性多糖，其来源广泛，易于降解并具备可食用性，所含有的活性羟基和氨基使其具有抗菌活性、抗氧化活性和免疫调节活性等多种生物学功能[5]。CHI降解后得到的分子质量较小、易溶于水的寡糖产品—壳寡糖(chitosan oligosaccharide，COS)，亦称低聚壳聚糖，常在体外试验中被选用以代替CHI进行相关研究。已有研究表明，CHI不仅可以提高动物的生产性能，也可以作为免疫调节剂来改善动物的免疫功能[6-9]。Li等[10]研究发现，CHI能够通过上调肉仔鸡小肠iNOS的表达水平，增加肉仔鸡血清中NO含量和iNOS活性。Wu等[11]研究发现，CHI水解物能够使NF-κB进入核内参与转录，加强了其与iNOS基因的结合活性，上调了iNOS的表达水平，进而促进NO的生成。但也有研究结果与之相反，Wei等[12]研究发现，CHI能够抑制小鼠胶质神经细胞NF-κB的活化，并降低胞内iNOS基因的转录和翻译水平，减少NO的生成。Porporatto等[13]在脂多糖(LPS)存在的条件下发现CHI能够上调巨噬细胞培养液中iNOS的表达水平，并增加培养液中NO的含量。目前，关于CHI对NO免疫调节途径的影响研究主要集中在禽类和单胃动物方面，且研究结果不相一致，其在反刍动物特别是奶牛方面尚无报道。因此，本试验利用体内和体外相结合的方法，探究饲粮中添加CHI对泌乳中期奶牛NO免疫途径相关指标的影响，并进一步观察其对奶牛外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)中NF-κB和iNOS基因表达的影响，阐明NF-κB基因在该免疫途径中如何发挥调控作用，为揭示CHI参与奶牛免疫调节作用的可能途径提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 试验材料

本试验所用细菌LPS(L2008，O55 : B5)购自Sigma-Aldrich公司。试验所用CHI(脱乙酰度为85.38%；分子质量为70 000 u)与COS(脱乙酰度为87%；分子质量为3 000 u)均购自海得贝海洋生物工程有限公司。

1.2 体内试验设计与饲粮

试验在赛科星繁育生物技术股份有限公司(呼和浩特，内蒙古)进行，按照产奶量[(22.65±1.19) kg/d]、泌乳期[(186.1±30.0) d]、体重[(556.0±50.3) kg]和胎次(均为1胎)等相近的原则，选取40头泌乳中期荷斯坦奶牛随机分为5个处理，每个处理8个重复。各处理分别在基础饲粮(干物质基础)中添加0、500、1 000、1 500和2 000 mg/kg的CHI，基础饲粮组成及营养水平见表 1。

表 1 基础饲粮组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (DM basis)  

饲粮中粗蛋白质(CP)含量参照GB/T 6432—1994，采用凯氏定氮法测定；钙(Ca)含量参照GB/T 6436—2002，采用高锰酸钾滴定法测定；磷(P)含量参照GB/T 6437—2002，采用钼黄比色法测定；中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维(ADF)含量分别参照GB/T 20806—2006和NY/T 1459—2007测定。上述方法中所用的主要仪器设备为KDN-816型全自动凯氏定氮仪(上海纤检仪器有限公司)、722S型可见分光光度计(上海仪电科学仪器股份有限公司)和SLQ-6A型粗纤维测定仪(上海纤检仪器有限公司)。

试验期60 d，前后2期各30 d。奶牛采用散栏式饲养，牛舍温度为10~15 ℃，相对湿度为45%~55%。奶牛每天挤奶3次(05:00、13:00、21:00)，上料3次，清粪3次，上料和清粪均在奶牛挤奶时进行，避免环境应激。奶牛自由采食和饮水。

1.3 样品采集

于试验第30和60天早晨对奶牛(空腹)进行尾静脉无菌采血30 mL，其中20 mL血样用5 mL的肝素钠抗凝管收集，在常温条件下按照淋巴细胞分离液说明书进行PBMCs的分离与收集；另外10 mL血样在4 ℃、1 790×g的条件下离心10 min，分装至200 μL安培管中，保存至-20 ℃直到分析。

1.4 COS溶液的配制

在分析天平上称取一定量的COS粉末状固体，使其溶于超纯水中配制成800 μg/mL的COS工作液。

1.5 体外试验淋巴细胞的培养及试验设计

选用3头健康无病的泌乳中期的荷斯坦奶牛按上述方法采集血液后，混合，进行PBMCs的分离，收集的PBMCs用RPMI-1640培养基(Gibco公司，美国)洗涤2次。用台盼蓝染色法对PBMCs进行计数后，再悬于RPMI-1640培养基[100 μg/mL链霉素、100 U/mL青霉素、50 μmol/L 10%犊牛血清和25 mmol/L HEPES缓冲液]中，并调整培养基中PBMCs密度为1×106个/mL等待培养。

体外试验分为2个子试验，每个试验均采用2×2×2三因子试验设计，共8个处理，每个处理6个重复。即2个LPS水平×2个COS水平×2个抑制剂水平。LPS水平：不添加LPS和添加LPS(LPS添加水平为10 μg/mL)；COS水平：不添加COS和添加COS(COS添加水平参考本实验室前期研究结果确定为160 μg/mL[14])；抑制剂水平：不添加抑制剂和添加抑制剂(iNOS抑制剂1400W添加水平为1 mmol/L，NF-κB抑制剂PDTC添加水平为10 mmmol/L)。

具体操作过程为：将已获得的PBMCs培养基加入到24孔细胞培养板中，每孔1 mL(COS处理为0.8 mL培养基和0.2 mL COS工作液)。在37 ℃、5% CO2条件下培养24 h，之后转移至1.5 mL的无酶无菌离心管中，在4 ℃条件下，800×g离心5 min，收集上清保存于-20 ℃，收集细胞并加1 mL RNAiso Plus保存于-80 ℃以待分析。

1.6 测定指标与方法 1.6.1 NO含量和iNOS活性的测定

NO含量和iNOS活性采用酶联免疫吸附法测定，严格参照博尔迪生物科技有限公司提供的试剂盒说明书进行。iNOS的活性单位定义为：每毫升血清每分钟产生1 nmoL的NO。

1.6.2 iNOS和NF-κB基因表达量的测定

采用Trizol试剂盒(TaKaRa，大连)从PBMCs中提取总RNA，并测定其纯度与浓度。用Prime ScriPtTM RT试剂盒(No：DRR036A)将总RNA反转录为cDNA，其反应条件为：37 ℃，15 min；85 ℃，5 s。实时荧光定量PCR根据SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ试剂盒(No：RR820A)说明书进行操作，其反应程序为：预变性95 ℃，30 s，共1个循环；变性95 ℃ 5 s，退火60 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，共40个循环；延伸72 ℃ 10 min，自动生成熔解曲线。本试验中β-肌动蛋白(β-actin)为内参基因，分别检测iNOS和NF-κB基因的表达，各目的基因表达量用2-ΔΔCt法计算。所需引物均由Primer 5和Olige 6软件设计，由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列见表 2。

表 2 引物序列 Table 2 Primer sequences
1.7 数据处理与统计分析

体外试验数据采用SAS 9.0分析软件的GLM程序进行2×2×2三因素方差分析，模型中的因素包括CHI水平(0、500、1 000、1 500和2 000 mg/kg)和抑制剂处理(添加和不添加)以及它们之间的交互效应，差异显著者采用Duncan氏法进行多重比较，P < 0.05为差异显著，P < 0.01为差异极显著，0.05≤P < 0.10为差异有显著趋势。体内试验数据进行回归统计分析，评估CHI添加水平与奶牛相应指标间的线性和二次效应，P < 0.05代表回归关系显著，P < 0.01代表回归关系极显著，0.05≤P < 0.10代表回归关系有显著趋势。

2 结果与分析 2.1 CHI对奶牛血清中NO含量和iNOS活性的影响

由表 3可知，在试验第30天，NO含量和iNOS活性均未随CHI添加水平增加而产生显著变化(P>0.05)。但在试验第60天，血清中NO含量随CHI添加水平增加呈极显著的一次线性(P < 0.01)或二次曲线(P < 0.01)升高效应，血清iNOS活性呈趋于显著的一次线性(0.05≤P < 0.10)或显著的二次曲线(P < 0.05)升高效应，且NO含量和iNOS活性均在1 500 mg/kg CHI处理表现为最高。这表明上述指标与CHI的添加水平存在二次剂量依赖关系。

表 3 CHI对奶牛血清中NO含量和iNOS活性的影响 Table 3 Effects of chitosan on NO content and iNOS activity in serum of dairy cows
表 4 CHI对奶牛PBMCs中iNOS和NF-κB基因表达量的影响 Table 4 Effects of CHI on expressions of iNOS and NF-κB genes in PBMCs of dairy cows
2.2 CHI对奶牛PBMCs中iNOS和NF-κB基因表达量的影响

由表 4可知，在试验第30天，各处理间iNOS和NF-κB的基因表达量差异均不显著(P>0.05)。而在试验第60天，随着CHI添加水平的增加，iNOS和NF-κB基因表达量均表现为趋于显著的一次线性(0.05≤P < 0.10)或显著的二次曲线(P < 0.05)增加效应，iNOS和NF-κB基因表达量均在1 500 mg/kg CHI处理出现最高值，而在2 000 mg/kg CHI处理其表达水平有不同程度的下调。这表明上述指标与CHI的添加水平存在二次剂量依赖关系。

2.3 COS对1400W存在下LPS刺激的PBMCs中NO途径相关指标的影响

由表 5可知，COS的主效应显著增加了NO含量(P < 0.05)，极显著上调了iNOS和NF-κB的基因表达量(P < 0.01)；LPS的主效应极显著升高了NO含量、iNOS活性、iNOS和NF-κB基因表达量(P < 0.01)；1400W的主效应极显著降低了NO含量和iNOS活性(P < 0.01)。

表 5 COS对1400W存在下LPS刺激的PBMCs中NO途径相关指标影响 Table 5 Effects of COS on NO pathway related indexes in PBMCs treated by LPS in the presence of 1400W

COS与LPS的互作效应对NO含量、iNOS活性和NF-κB基因表达量有极显著的影响(P < 0.01)，对iNOS基因表达量有显著影响(P < 0.05)。与只添加LPS处理相比，添加COS后NO含量和iNOS活性显著降低(P < 0.05)。而对于iNOS基因表达量而言，二者均不添加时，其值显著低于其他处理(P < 0.05)，而其他处理之间无显著性差异(P>0.05)。对于NF-κB表达量而言，二者均添加时，其值显著高于其他处理(P < 0.05)，而其他处理之间差异不显著(P>0.05)。

COS与1400W的互作效应对iNOS活性和NF-κB基因表达量有极显著的影响(P < 0.01)。无论是否添加COS，添加1400W后，iNOS活性和NF-κB基因表达量显著低于其他各组(P < 0.05)。在添加1400W的条件下，添加COS对iNOS活性和NF-κB基因表达量有升高的趋势。LPS与1400W对各指标均无显著的互作效应(P>0.05)。

COS、LPS和1400W三者的互作效应对NO含量有显著影响(P < 0.05)，而对NF-κB基因表达量、iNOS活性及其基因表达量有趋于显著的影响(0.05≤P < 0.10)。对NO含量而言，LPS+1400W处理最高，其次为COS+LPS处理，显著高于其他各处理(P < 0.05)，1400W处理较低；对iNOS活性而言，LPS处理显著高于其他各处理(P < 0.05)；对NF-κB基因表达量而言，COS+LPS+1400W处理最高，其次为COS+LPS处理，LPS+1400W和1400W处理表现为最低；对iNOS基因表达量而言，1400W处理最低。

2.4 COS对PDTC存在下LPS刺激的PBMCs中NO途径相关指标的影响

由表 6可知，COS的主效应对iNOS和NF-κB的基因表达量分别有趋于显著(0.05≤P < 0.10)和显著(P < 0.05)的上调作用；LPS的主效应极显著升高了NO含量和iNOS活性(P < 0.01)，显著或趋于显著上调了iNOS和NF-κB的基因表达量(P < 0.05或0.05≤P < 0.10)；PDTC的主效应极显著下调了iNOS和NF-κB的基因表达量(P < 0.01)，显著或趋于显著降低了NO含量和iNOS活性(P < 0.05或0.05≤P < 0.10)。

表 6 COS对PDTC存在下LPS刺激的PBMCs中NO途径相关指标影响 Table 6 Effects of COS on NO pathway related indexes in PBMCs treated by LPS in the presence of PDTC

COS和LPS的互作效应对NO含量、iNOS活性和NF-κB的基因表达量有极显著的影响(P < 0.01)，对iNOS的基因表达量有趋于显著的影响(0.05≤P < 0.10)。与只用LPS刺激的处理相比，添加COS能够显著降低NO含量和iNOS活性。而对于NF-κB的基因表达量，添加COS的处理显著高于其他处理(P < 0.05)。

COS和PDTC的互作效应对NF-κB的基因表达量有极显著影响(P < 0.01)。在PDTC存在的条件下，添加COS显著升高了NF-κB的基因表达量(P < 0.05)。

LPS和PDTC的互作效应对NF-κB的基因表达量有极显著的影响(P < 0.01)，对iNOS活性有显著的影响(P < 0.05)，并对NO含量有趋于显著的影响(0.05≤P < 0.10)。在添加LPS时，添加PDTC使上述指标均显著降低(P < 0.05)。

COS、LPS和PDTC三者的互作效应对iNOS活性和NF-κB的基因表达量有显著影响(P < 0.05)。对NO含量而言，添加LPS处理显著高于其他处理(P < 0.05)。对iNOS活性而言，添加LPS处理显著高于其他处理(P < 0.05)，添加PDTC处理和均不添加处理显著低于其他各处理(P < 0.05)。对iNOS的基因表达量而言，添加LPS和COS处理显著高于其他处理(P < 0.05)。对NF-κB的基因表达量而言，COS和COS+LPS处理显著高于其他各处理(P < 0.05)，PDTC和LPS+PDTC处理显著低于其他各处理(P < 0.05)。

3 讨论 3.1 CHI对奶牛NO免疫调节途径相关指标的影响及其分子机制

NO在动物体内参与细胞免疫信号传导途径和多种生物化学反应，在抵御病原体中起着至关重要的作用，是生物体细胞内及细胞间一种重要的信号分子，主要由L-Arg与氧分子经iNOS催化后反应产生[1]。机体在炎症或者疾病的状态下，iNOS催化免疫细胞产生大量的NO，其能够穿过细胞膜进行扩散，通过亚硝基化和氧化损伤等多种生物学功能来抵御或消灭入侵的细菌、真菌、病毒和寄生虫等病原体[14]。Speth等[15]研究发现，CHI能够显著提高小鼠的免疫功能，并增加其腹腔巨噬细胞iNOS活性和NO含量。Porporatto等[13]研究表明，用0.05%~0.10% CHI处理大鼠的巨噬细胞可以显著增加iNOS的活性和NO的含量，并检测到iNOS的基因表达量也有所上调。在本试验中，饲粮中添加CHI可显著提高试验后期奶牛血液中NO含量和iNOS活性，并升高淋巴细胞中iNOS的基因表达量，这与上述报道结果相一致。CHI提高NO含量的原因可能是由于巨噬细胞表面的甘露糖受体可以被CHI分子链上的N-乙酰-D-葡糖胺残基特异性地结合，进而激活巨噬细胞，发挥其对动物免疫功能的调节作用[16]。

CHI能够通过激活细胞表面Toll样受体4(TLR4)进而促进抑制蛋白-κB(I-κB)的水解，使NF-κB入核转录，从而影响NO的分泌[17]。Ozcan等[18]研究发现，巨噬细胞在受到刺激后，参与iNOS基因表达的NF-κB结合位点被激活，进而诱导了胞内iNOS基因的转录和表达。此外，Jeong等[19]研究指出，CHI能够通过活化NF-κB信号转导通路诱导肿瘤坏死因子-α(TNF-α)分泌，进而提高巨噬细胞产生NO的能力。在本试验中，NF-κB的基因表达量随CHI添加水平的增加显著上调，呈二次剂量依赖效应。值得注意的是，NF-κB基因的表达量在2 000 mg/kg的CHI处理中略有下降，这可能与NF-κB的负反馈调节机制有关。NF-κB的负反馈调节是一个复杂而精密的过程，与机体多种细胞因子的浓度、细胞状态和相关基因的表达均相关，因此，NF-κB信号通路调节机体免疫功能的机制仍需进一步研究探讨。

3.2 COS对抑制剂存在下LPS刺激的PBMCs免疫活性的影响

在NO分子途径中，NO过量释放会导致动物体多种疾病。因此，研究iNOS及NO途径其他相关调节因子抑制剂具有重要的应用价值。本试验选取具备高效选择性抑制剂，即iNOS抑制剂1400W或NF-κB抑制剂PDTC，进一步研究CHI调节动物免疫功能的分子机制。试验结果表明，1400W能够抑制iNOS的活性并降低NO的生成，但是对iNOS和NF-κB基因表达的影响不显著，这表明1400W只能够抑制iNOS的活性，并不能够影响iNOS基因的转录过程，也表明PBMCs中主要是由iNOS调控和催化NO产生。LPS在体外试验中常被用作诱导剂来模拟机体的炎症和应激状态，在本试验中，PBMCs在LPS的刺激下分泌大量NO，然而在添加COS后，由LPS刺激产生的NO含量减少。这表明CHI对PBMCs中NO的分泌发挥着双向调节的作用，它不仅能够激活静息状态的巨噬细胞产生NO，还能对激活状态下的巨噬细胞分泌的NO起到抑制作用。

此外，本研究结果显示，PDTC不仅能够下调NF-κB基因表达，还显著降低了iNOS基因表达量、iNOS活性和NO含量，这表明iNOS的转录水平可以由NF-κB调控。Ganster等[4]认为iNOS启动子上的确存有NF-κB的结合位点。结合前人研究结果推测，CHI可能是通过上调NF-κB与iNOS基因的表达量，并且提高iNOS活性，来提高机体的NO含量。类似的试验发现，CHI能够提高巨噬细胞培养液中NO的含量，而NF-κB抑制剂能够降低NO的生成[13, 20]。Jung等[21]研究结果也指出，抑制NF-κB信号通路可以抑制巨噬细胞的活化，进而减少免疫相关因子的产生。本试验结果和上述结果相类似，这也进一步表明了NF-κB信号通路调控的NO免疫调节途径是CHI影响奶牛免疫功能的部分分子机制。

综上所述，本试验结果表明CHI能够通过NO免疫调节途径调节机体的免疫功能。此外，机体在正常生理状态下，添加CHI能改善其免疫功能，但当机体受到病原体感染或发生炎症时，CHI能起到缓解炎症反应的作用。

4 结论

① 由体内和体外试验综合来看，CHI可通过NO分子途径调节奶牛免疫功能，即CHI可以通过促进NF-κB的基因表达，来增加iNOS的基因表达量，提高iNOS活性，进而提高NO含量，来调节奶牛的免疫功能，其中CHI适宜添加水平为1 500 mg/kg。

② 体外试验的研究结果显示，CHI显著抑制了由LPS诱导的PBMCs中NO分子途径相关指标的升高，表明CHI对NO分子途径的调节具有双向作用，即CHI不仅能够提高奶牛正常状态下机体的免疫功能，也能缓解或消除奶牛机体的炎症反应。

参考文献
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