2. 西南科技大学生命科学与工程学院, 绵阳 621010;
3. 四川铁骑力士集团冯光德实验室, 绵阳 610000
2. College of Life Science and Engineering, Southwest University of Science and Technology, Mianyang 621010, China;
3. Feng Guang De Laboratory of Tols Tie Qi Li Shi Group, Mianyang 610000, China
随着现代畜牧业的蓬勃发展，为了提高母猪利用率和降低成本，早期断奶技术被广泛应用于生猪产业中。一方面，仔猪早期断奶可提高母猪生产力，同时减少疾病由母体向仔猪传播[1-3]；另一方面，因仔猪消化能力和免疫能力差，早期断奶会导致仔猪“断奶应激综合征”[4-6]。因此，如何提高母猪生产效率和缓解仔猪早期断奶应激，是一个值得研究的问题。国内外研究表明，使用人工乳饲喂超早期断奶仔猪，仔猪生长速度更快，并且肠道发育更加良好。Hodge[7]研究人工乳对2日龄仔猪生长性能的影响，结果表明，仔猪10~30日龄时生长速度可达571 g/d。Zheng等[8]研究精氨酸对4日龄仔猪肠道健康的影响，结果表明，人工乳中添加1.0%的精氨酸可显著提高低出生重仔猪的空肠绒毛高度和咬合蛋白-1(claudin-1)的mRNA表达量。Reale[9]研究人工乳对7日龄断奶仔猪生长性能的影响，结果表明，仔猪28日龄时的体重增加了24%。Dunshea等[10]研究人工乳对10日龄断奶仔猪生长性能的影响，结果表明，仔猪21日龄时生长速度增加了40%。Kim等[11]研究人工乳对11日龄断奶仔猪生长性能的影响，结果表明，断奶后14 d内仔猪生长速度达380 g/d。Heo等[12]研究人工乳对14日龄断奶仔猪生长性能的影响，结果表明，断奶后7 d内仔猪生长速度达470 g/d。这些研究表明，人工乳能提高超早期断奶仔猪的生长速度，促进仔猪肠道发育，缓解仔猪断奶应激。因此，本试验以21日龄断奶仔猪为对照，比较研究饲喂人工乳对14日龄断奶仔猪肠道形态和黏膜屏障的影响，以期挖掘断奶仔猪的生长潜力，探索缓解仔猪断奶应激的方法。
1 材料与方法 1.1 试验饲粮与试验设计人工乳参考田一航等[13]和Zheng等[8]配制(表 1)，教槽料参考NRC(2012)配制成粉状料(表 2)。
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表 1 人工乳组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of artificial milk (air-dry basis) |
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表 2 教槽料组成及营养水平(风干基础) Table 2 Composition and nutrient levels of creep feed (air-dry basis) |
试验选取14窝共112头平均体重为(4.79±0.56) kg的14日龄“长×大”二元杂交仔猪，随机分为2组，分别为21日龄断奶组和14日龄断奶组，每组7个重复，每个重复8头仔猪。21日龄断奶组仔猪14~21日龄时由原圈母猪饲喂母乳，14日龄断奶组仔猪断奶后饲喂人工乳至21日龄，2组均于22日龄时开始饲喂相同的教槽料，试验期14 d。
1.2 饲养管理试验在铁骑力士灵兴猪场进行，所有仔猪采用群养。试验前对圈舍进行全面消毒，猪舍温度控制在28~30 ℃，相对湿度控制在60%左右，14日龄断奶组仔猪14~21日龄时每天饲喂6次人工乳(08:00、11:00、14:00、17:00、20:00、23:00)，21日龄断奶组仔猪14~21日龄时采食母乳，2组于22~28日龄时均饲喂相同的教槽料，每天饲喂4次(08:00、12:00、16:00、20:00)，以料槽内有少量余料为准，保证每头仔猪充分自由采食。
1.3 样品采集于28日龄时，每个重复挑选1只接近重复平均体重的仔猪屠宰，迅速分离肠段，取空肠和回肠黏膜组织，用液氮速冻后转入-80 ℃冰箱保存备用。
1.4 测定指标及方法 1.4.1 生长性能和腹泻率于21和28日龄08:00空腹称重，计算平均日增重(average daily gain，ADG)、平均日采食量(average daily feed intake，ADFI)和料重比(feed to gain ratio，F/G)。
每天早晚2次观察仔猪粪便情况，记录每个重复腹泻仔猪头次。腹泻评分参考Jiang等[14]的方法，当腹泻评分为2或以上时认为仔猪发生腹泻，腹泻评分标准见表 3。腹泻率计算公式如下：
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表 3 腹泻评分标准 Table 3 Standard of diarrhea score |
将固定好的空肠和回肠黏膜组织用石蜡包埋后切片(3~4 μm)，采用苏木精-伊红(HE)染色，中性树脂封片，光学显微镜下观察。Image-pro plus 6.0 (Media Cybernetics, Inc., Rockville, MD, USA)软件拍照并对空肠、回肠的绒毛高度和隐窝深度作定量分析。
1.4.3 肠道黏膜相关基因表达实时定量PCR法测定空肠和回肠黏膜细胞因子[白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-18(IL-18)、NLR家族Pyrin域蛋白3(NLRP3)]以及紧密连接蛋白[闭锁蛋白(occludin)、咬合蛋白-2(claudin-2)、紧密连接蛋白-1(ZO-1)、紧密连接蛋白-2(ZO-2)]的mRNA相对表达量。总RNA的提取按照试剂盒(Trizol Reagent，TaKaRa，日本)操作说明进行，RNA质量检测使用核酸蛋白检测仪(Beckman DU-800，CA，美国)于260 nm检测，A260/A280表示RNA的纯度，该比值在1.8~2.0说明RNA纯度较好。cDNA的合成按照逆转录试剂盒(Prime ScriptTM Regent Kit，TaKaRa，日本)操作说明进行，反应结束后于-20 ℃保存待用。利用美国国家生物技术信息中心(NCBI)搜索基因序列，运用Primer 5进行引物设计，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。用实时定量PCR仪(ABI7900HT Real-Time PCR System，ABI，美国)进行测定，反应荧光染料为SYBR Green I (TaKaRa，日本)。反应体系为10.0 μL：5.0 μL SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ(2×)、0.5 μL上游引物、0.5 μL下游引物、3.0 μL双蒸水和1.0 μL cDNA模板。选择β-肌动蛋白(β-actin)作为空肠和回肠黏膜的内参基因，使用2-ΔΔCt方法计算目的基因的相对表达量。引物序列及参数见表 4。
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表 4 实时定量PCR引物序列及参数 Table 4 Sequences and parameters of primers for real-time qPCR |
检测空肠黏膜中总抗氧化能力(total-antioxidant capacity，T-AOC)，总超氧化物歧化酶(total-superoxide dismutase，T-SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidases，GSH-Px)、过氧化氢酶(catalase，CAT)活性及丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量，所用试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，各指标均按试剂盒说明书进行检测。
1.5 数据统计与分析所有数据使用Excel 2010初步整理，使用SPSS 20.0统计软件对试验数据进行独立样本t分析，以P < 0.01为差异极显著，P < 0.05为差异显著，结果以平均值和均值标准误(SEM)表示。
2 结果 2.1 饲喂人工乳对14日龄断奶仔猪生长性能和腹泻率的影响由表 5可知，2组仔猪的14和28日龄体重无显著差异(P＞0.05)；与21日龄断奶相比，14日龄断奶极显著降低仔猪15~21日龄时的ADG(P＜0.01)，显著提高22~28日龄时的ADFI(P < 0.05)，显著降低21日龄体重和腹泻率(P < 0.05)。
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表 5 饲喂人工乳对14日龄断奶仔猪生长性能和腹泻率的影响 Table 5 Effects of feeding artificial milk on growth performance and diarrhea rate of piglets weaning at 14 days of age |
由表 6可知，与21日龄断奶相比，14日龄断奶极显著降低仔猪的空肠隐窝深度(P＜0.01)，极显著提高空肠绒毛高度/隐窝深度(P＜0.01)；2组仔猪的回肠绒毛高度、隐窝深度、绒毛高度/隐窝深度均无显著差异(P＞0.05)。
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表 6 饲喂人工乳对14日龄断奶仔猪肠道组织形态的影响 Table 6 Effects of feeding artificial milk on intestinal morphology of piglets weaning at 14 days of age |
由表 7可知，与21日龄断奶相比，14日龄断奶对仔猪空肠和回肠黏膜紧密连接蛋白的mRNA相对表达量无显著差异(P＞0.05)。
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表 7 饲喂人工乳对14日龄断奶仔猪肠道黏膜紧密连接蛋白mRNA相对表达量的影响 Table 7 Effects of feeding artificial milk on mRNA relative expression levels of tight junction proteins of intestinal mucosa of piglets weaning at 14 days of age |
由表 8可知，与21日龄断奶相比，14日龄断奶极显著提高仔猪回肠NLRP3的mRNA相对表达量(P＜0.01)，对其他细胞因子的mRNA相对表达量均无显著影响(P＞0.05)。
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表 8 饲喂人工乳对14日龄断奶仔猪肠道黏膜细胞因子mRNA相对表达量的影响 Table 8 Effects of feeding artificial milk on mRNA relative expression levels of cytokines of intestinal mucosa of piglets weaning at 14 days of age |
由表 9可知，与21日龄断奶相比，14日龄断奶显著降低仔猪的空肠黏膜CAT活性(P＜0.05)，对空肠黏膜其他抗氧化指标均无显著影响(P＞0.05)。
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表 9 饲喂人工乳对14日龄断奶仔猪空肠黏膜抗氧化指标的影响 Table 9 Effects of feeding artificial milk on antioxidant indexes of jejunal mucosa of piglets weaning at 14 days of age |
研究表明，仔猪的生长性能随着断奶日龄的提前而下降。周芬等[15]研究断奶日龄(23、28日龄)对仔猪生长性能的影响，结果表明，仔猪的体重、ADG和ADFI随着断奶日龄的提前显著下降。郑心力等[16]比较了不同断奶日龄(21、28、35、42日龄)对临高仔猪断奶后生长性能的影响，结果表明，断奶日龄越早，仔猪的生长性能越低。本试验结果与前人研究结果一致，与21日龄断奶相比，14日龄断奶并饲喂人工乳极显著降低仔猪15~21日龄时的ADG，且28日龄体重下降了7.62%，这可能与断奶日龄越早，仔猪对饲粮及采食方式的适应能力越弱有关[17]。但是，与21日龄断奶相比，14日龄断奶并饲喂人工乳显著降低仔猪的腹泻率，这可能与饲喂人工乳促进仔猪的肠道发育有关。De Vos等[18]研究人工乳对仔猪肠道形态和消化能力的影响，结果表明，饲喂人工乳显著提高仔猪的肠道容量及消化酶活性，改善肠道形态。另有研究发现，仔猪肠道绒毛高度和隐窝深度在断奶后第14天可恢复到断奶前水平[19-20]。本试验研究发现，与21日龄断奶相比，14日龄断奶并饲喂人工乳极显著降低仔猪28日龄时的空肠隐窝深度，极显著提高空肠绒毛高度/隐窝深度，说明14日龄断奶并饲喂人工乳改善了仔猪的肠道健康。
3.2 饲喂人工乳对14日龄断奶仔猪肠道屏障功能及抗氧化能力的影响肠道机械屏障主要由肠上皮细胞通过紧密连接蛋白等细胞连接形成，紧密连接蛋白主要由跨膜蛋白复合物的claudin、occludin和ZO-1、ZO-2组成[21]。张影超等[22]研究发现，仔猪断奶后肠道ZO-1和occludin的mRNA相对表达量显著降低，腹泻率增加。Weiler等[23]研究发现，应激条件下，仔猪肠道ZO-1和occludin的mRNA相对表达量显著降低。本研究结果显示，与21日龄断奶相比，14日龄断奶对仔猪28日龄时空肠和回肠紧密连接蛋白的mRNA相对表达量无显著影响，说明人工乳饲喂早期断奶仔猪在一定程度上维持了肠道屏障功能，缓解了早期断奶对肠道的损伤。但是，与21日龄断奶相比，14日龄断奶显著提高仔猪的回肠黏膜炎症水平，降低仔猪空肠黏膜抗氧化能力。
断奶应激造成肠道屏障损伤，毒素、病原体等有害物质进入，可能激活肠道黏膜中固有层淋巴组织和肠系膜淋巴结，产生免疫应答，分泌细胞炎症因子[24]。NLRP3被激活后能加工和分泌成熟的IL-1β和IL-18，IL-1β具有强烈的促炎效应[25]。本研究发现，与21日龄断奶相比，14日龄断奶显著提高仔猪28日龄时回肠NLRP3的mRNA相对表达量，但IL-1β和IL-18的mRNA相对表达量差异并不显著，说明14日龄断奶可能加重了仔猪28日龄时的回肠炎症，具体作用机制有待进一步研究。
动物体内通过维持氧化与抗氧化之间的相对稳定，以保证动物正常生长。研究证实，早期断奶会导致仔猪体内自由基产生过量，引起脂质过氧化及蛋白质和DNA损伤，免疫力降低，导致生长发育迟缓，生长性能降低，饲料转化率降低[22-28]。徐健雄[29]研究发现，21日龄断奶仔猪的血清抗氧化能力高于14日龄断奶仔猪，仔猪血清抗氧化能力随着日龄增加而增加。本试验结果与以上结果一致，与21日龄断奶相比，14日龄断奶显著降低28日龄时仔猪的空肠黏膜CAT活性，表明14日龄断奶降低仔猪28日龄时的空肠黏膜抗氧化能力。
4 结论与21日龄断奶相比，人工乳饲喂14日龄断奶仔猪降低仔猪的28日龄体重、空肠抗氧化能力和屏障功能，但对28日龄时仔猪的肠道形态有改善作用，并降低其腹泻率。
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