玉米秸秆的粗蛋白质含量只有4%~5%^[1]，并且秸秆中的木质素与纤维素、半纤维素间形成坚固的酯键结构^[2]。为了改善玉米秸秆作为粗饲料方面的不足，许多研究者将目光转向微生物发酵技术来生产高品质的发酵粗饲料^[3-5]。拟康宁木霉(Trichoderma koningiopsis)是一种高效降解纤维素的菌种^[6-7]，其纤维素分解能力强，但其分解木质素的能力较低。康宁木霉具有固氮功能，同时能在生长繁殖过程中产生有机酸、氨基酸、多糖、激素等。生物固氮是固氮微生物特有的一种生理功能，这种功能是在固氮酶的催化作用下进行的，固氮酶是一种能够将分子氮还原成氨的酶。拟康宁木霉同样属于木霉菌属^[8]，拟康宁木霉也有可能具有相同的固氮机制。黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)是白腐真菌的一种，其具有超强的木质素降解能力^[9-11]，同时也能降解纤维素，用2种菌共同发酵玉米秸秆，不但可以使玉米秸秆中的木质素含量减少，还可以将原本与木质素交织在一起的那部分纤维素释放出来并降解，从而提高玉米秸秆的营养价值。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是一类兼性厌氧性真菌，它可以利用秸秆中的糖类物质合成菌体蛋白^[12]，以及少量的维生素和生长因子。孙旸等^[13]利用酵母和乳酸菌混合发酵玉米秸秆，发酵后的玉米秸秆粗蛋白质含量达到15.471%。本试验在拟康宁木霉和黄孢原毛平革菌降解木质纤维素的基础上，再次接种酿酒酵母进行二次发酵，以期获得木质纤维素含量较低、粗蛋白质含量较高的优质粗饲料。

1 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 菌种

黄孢原毛平革菌购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，拟康宁木霉和酿酒酵母由黑龙江省寒区饲料资源高效利用与营养调控重点实验室提供。

1.1.2 玉米秸秆

玉米秸秆购自黑龙江省安达市农户，自然风干的玉米秸秆使用小型粉碎机进行粉碎，粒径过60目筛后备用。

1.1.3 培养基

黄孢原毛平革菌液体种子培养基^[14]：马铃薯提取液1 L，葡萄糖20 g，KH₂PO₄ 3 g，MgSO₄·7H₂O 1.5 g，维生素B₁微量。121 ℃灭菌15 min。

拟康宁木霉液体种子培养基^[14]：马铃薯提取液1 L，葡萄糖10 g，蔗糖10 g，MgSO₄·7H₂O 2 g，KH₂PO₄ 1 g，蛋白胨1.5 g，酵母浸出物1.5 g，维生素B₁微量。121 ℃灭菌15 min。

YPD酵母菌液体种子培养基：蛋白胨2%，葡萄糖2%，酵母浸出物1%，水95%。121 ℃灭菌15 min。

Mandels营养液：(NH₄)₂SO₄ 3 g，KH₂PO₄ 3 g，MgSO₄·7H₂O 2 g，NaNO₃ 0.3 g，FeCl₃ 0.5 g，加入1 000 mL水。

固态发酵培养基：玉米秸秆粉8 g，麦麸2 g，加入Mandels营养液5 mL，并将含水量调节至50%~60%，装于250 mL锥形瓶中。121 ℃灭菌15 min。

1.2 试验方法 1.2.1 菌种培养^[14]

菌种活化：将保存的菌种接种到马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上，在28 ℃条件下培养5 d，并转接活化2次，放于4 ℃保存备用。

液体菌种培养：将PDA培养基上的菌种分别接种到与菌种相对应的液体种子培养基中，黄孢原毛平革菌和拟康宁木霉于28 ℃、150 r/min条件下振荡培养7 d。酿酒酵母于30 ℃、200 r/min条件下振荡培养15 h。

1.2.2 固态发酵培养

拟康宁木霉与黄孢原毛平革菌的发酵参数按前期优化的最优木质纤维素降解率条件进行，拟康宁木霉与黄孢原毛平革菌菌种比例为1 : 4，以25%的接种量接种到固体培养基中，混匀后于28 ℃下发酵。

1.2.3 还原糖含量测定

从拟康宁木霉与黄孢原毛平革菌混合发酵玉米秸秆的第1天开始，每天测定发酵底物的还原糖含量，连续测定10 d。还原糖含量采用3, 5-二硝基水杨酸法^[15]测定，

1.2.4 接种酿酒酵母参数优化 1.2.4.1 单因素接种酵母菌试验设计

为了提高酿酒酵母菌体蛋白的产量，通过测定玉米秸秆发酵过程中还原糖含量的变化，于固态发酵培养基还原糖含量较高时接入酿酒酵母。根据还原糖的含量，以酵母菌接入的时间点、接种量以及与拟康宁木霉和黄孢原毛平革菌共同发酵的时间作为单因素，研究其对发酵玉米秸秆中粗蛋白质含量的影响，每组试验设3个平行重复。粗蛋白质含量采用凯氏定氮法(GB/T 6432—2018)测定。

第1组试验：分别在拟康宁木霉和黄孢原毛平革菌发酵的第6、7、8、9和10天时接入酵母菌，接种量为预设的中间值6%，共同发酵时间为预设的中间值3 d，其他条件不变，发酵结束后测定其粗蛋白质含量，测定出相对最佳接入时间。

第2组试验：在第1组最优试验结果的基础上，于固态发酵培养基上分别接种2%、4%、6%、8%和10%的酵母菌，共同发酵时间为预设的中间值3 d，其他条件不变，发酵结束后测定其粗蛋白质含量，测定出相对最优接种量。

第3组试验：在第1、2组最优试验结果的基础上，分别共同发酵1、2、3、4、5 d，其他条件不变，发酵结束后测定其粗蛋白质含量，测定出3种菌株最佳共同发酵时间。

1.2.4.2 接种酵母菌最优参数研究

在单因素试验的基础上，采用Design Expert 8.0.6软件，根据Box-Benhnken试验设计原理，选取酵母菌接入时间、接种量和共同发酵时间3个因素，建立粗蛋白质含量与各因素之间的数学模型，通过计算来优化最佳的发酵条件，从而确定酵母菌产生菌体蛋白的最佳发酵参数。

1.3 统计分析

试验数据使用Excel 2007软件整理，然后采用SPSS 16.0软件的one-way ANOVA进行方差分析，采用Duncan氏法进行多重比较，以P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异极显著。

2 结果与分析 2.1 固态发酵培养基还原糖含量测定结果与分析

根据还原糖含量标准曲线，分别测定发酵开始后第1天到第10天的还原糖含量变化，结果见图 1。从固态发酵进行的第2~6天，还原糖含量迅速上升，于第7天达到最大值106.6 mg/g。之后从第8~10天，还原糖含量呈下降趋势。

2.2 单因素接种酿酒酵母试验结果 2.2.1 接种时间对玉米秸秆粗蛋白质含量的影响

由图 2可知，当酿酒酵母于第7天接种到固态发酵培养基中时，粗蛋白质含量最高为10.49%，显著高于其他接种时间的粗蛋白质含量(P < 0.05)。随着接种时间的不断延长，粗蛋白质含量呈下降趋势。因此，最佳接种时间是第7天。

2.2.2 接种量对玉米秸秆粗蛋白质含量的影响

由图 3可知，接种量为干物质质量的2%~8%时，固态发酵培养基中的粗蛋白质含量随接种量升高而升高，6%、8%和10%接种量时的粗蛋白质含量均显著高于2%和4%接种量时的粗蛋白质含量(P < 0.05)。当接种量为8%时，粗蛋白质含量最高为11.01%，当接种量过高(10%)时，菌体生长过快会影响其后期生长，因此，最佳接种量为8%。

2.2.3 3种菌共同发酵时间对玉米秸秆中粗蛋白质含量的影响

由图 4可知，24~72 h随着共同发酵时间的延长，玉米秸秆中粗蛋白质含量呈上升趋势，72 h后粗蛋白质含量趋于平缓。其中共同发酵72、96和120 h的粗蛋白质含量差异不显著(P>0.05)，但共同发酵72 h时粗蛋白质含量显著高于发酵24和48 h的粗蛋白质含量(P < 0.05)。

2.3 响应面法优化接种酿酒酵母发酵条件 2.3.1 响应面试验设计及结果分析

结合单因素接种酿酒酵母试验结果，选取其中对结果影响较大的因素，以粗蛋白质含量为响应值，每个因素取3个水平，进行响应面分析和试验，进一步优化各因素的参数。因素水平编码表见表 1。经软件Design Expert 8.0.6设计响应面分析试验，结果见表 2。

根据表 2试验结果，采用Design Expert 8.0.6软件对结果进行分析。由表 3可知，B、C、A²、B²、C²对粗蛋白质含量的影响极显著(P < 0.01)，A对粗蛋白质含量的影响显著(P < 0.05)，说明这些是酿酒酵母产生菌体蛋白过程中的重要因素。失拟项不显著(P>0.05)，说明试验数据中无异常点，模型合适。

用Design Expert 8.0.6软件分析模型的可信度，结果见表 4。

根据粗蛋白质含量响应面系数的回归分析，得到模型的拟合方程为：Y=13.15+0.6A+0.85B+1.5C+0.08AB+0.09AC-0.23BC-1.48A²-1.33B²-2.09C²。从表 3和表 4可以看出，回归模型极显著(P < 0.01)，失拟项不显著(P=0.890 9)，表明回归方程拟合度良好。回归方程的复相关系数为0.965 1，表明96.51%的粗蛋白质含量变化可由此模型解释，与实际情况拟合良好。校正相关系数为0.920 2，粗蛋白质含量变异系数为5.38%，信噪比为13.417，说明模型可信度较高。

2.3.2 粗蛋白质含量响应面结果分析

当共同发酵时间处于最佳水平时，接种时间和接种量的交互作用见图 5。随着接种时间的延长，玉米秸秆粗蛋白质含量呈先升高后降低的趋势，当接种量超过8%后，粗蛋白质含量曲线趋于平缓。当接种量处于最佳水平时，接种时间和共同发酵时间的交互作用见图 6。随着接种时间的延长和共同发酵时间的延长，粗蛋白质含量呈先升高后降低的趋势，接种时间为第6天到第7天，共同发酵时间由48 h到72 h时，粗蛋白质含量提升较快。在共同发酵时间固定的情况下，粗蛋白质含量变化不大，说明接种时间对粗蛋白质含量的影响小于共同发酵时间对粗蛋白质含量的影响。当接种时间处于最佳水平时，接种量和共同发酵时间的交互作用见图 7。随着接种量和共同发酵时间的增加，粗蛋白质含量呈先升高而后逐渐平缓的趋势，在共同发酵时间固定的情况下，粗蛋白质含量变化不大，说明接种量对粗蛋白质含量的影响小于共同发酵时间对粗蛋白质含量的影响。

运用Design Expert 8.0.6软件优化所得到的粗蛋白质含量最优参数为：接种时间为第7.22天，接种量为8.59%，共同发酵时间为80.37 h。在此条件下，粗蛋白质含量的预测值为13.60%。

2.3.3 模型的验证

为了验证模型的有效性，对模型优化的最优条件进行验证。考虑到试验的可行性与便捷性，选择参数为：接种时间为第7天，接种量为8.5%，共同发酵时间为80 h。进行固态发酵试验，验证试验设3个重复，粗蛋白质含量平均值为13.23%。可见该模型能较好地预测混合真菌提高发酵玉米秸秆粗蛋白质含量的情况。

3 讨论

本试验中还原性糖含量先增加后下降，其主要原因是纤维素被拟康宁木霉和黄孢原毛平革菌分解，产生大量的还原糖，当还原糖达到一定含量后，会反馈抑制纤维素酶的活性，使纤维素的降解速度减慢。据报道，当还原糖含量下降至2 mg/mL时才表现去阻遏作用。与此同时，由于培养基中菌体数量的不断增多，使拟康宁木霉和黄孢原毛平革菌对还原糖的需求量逐渐高于其转化量，因此在发酵后期还原糖含量呈下降趋势。随着接种时间延长粗蛋白质含量先增加后下降，其主要原因是随着接种时间的延长，培养基中的营养物质和拟康宁木霉与黄孢原毛平革菌降解纤维素所产生的还原糖含量降低，影响了酿酒酵母的生长。本试验中二次接种酿酒酵母可以增加发酵玉米秸秆中粗蛋白质的含量，同时消耗掉发酵前期积累过多的发酵产物，因此该方法不仅可以改善玉米秸秆粗蛋白质含量不足的缺点并且对玉米秸秆纤维素的降解也具有一定的促进作用。惠文森等^[16]用酵母菌对玉米秸秆进行发酵，发酵15 d后粗蛋白质含量达到6.61%。马敏^[17]利用康氏木霉、酵母菌和木质层孔菌混合发酵玉米秸秆，发酵30 d后，玉米秸秆粗蛋白质含量提高到11.26%。杨森等^[18]用黑曲霉、里氏木霉、产朊假丝酵母和干酪乳杆菌进行优化组合发酵甜高粱茎秆残渣，发现选用4种复合菌株，再添加1%尿素发酵8 d，甜高粱茎秆残渣的粗蛋白质含量由2.27%提升至7.14%。由此可以看出，相较于单一酵母菌发酵玉米秸秆，混合真菌发酵产物的粗蛋白质含量更高。而与同类型混合菌种发酵秸秆相比，本试验的发酵方式粗蛋白质产量更高。主要原因是在接入酿酒酵母的前期发酵过程中，黄孢原毛平革菌通过分解玉米秸秆中的木质素，使原本被木质素缠绕的这部分纤维素得以降解，从而产生了更多的还原糖，由于康宁木霉具有固氮作用，而康宁木霉与拟康宁木霉同属于木霉菌属，拟康宁木霉也可能具有相同机制，更利于酿酒酵母的生长。并且拟康宁木霉和黄孢原毛平革菌靠分泌分解纤维素的酶系来实现降解功能，但在降解过程中产生的纤维二糖会与分解长链纤维的外切葡萄糖酶活性中心结合，从而产生竞争性反馈抑制作用，当发酵过程中的玉米秸秆还原糖含量较高时，纤维素会因为该反馈抑制作用无法被有效的降解^[19]，在此时接种酵母菌，不但可以消耗掉过多的还原糖使其成为合成菌体蛋白的充足能源，还可以解除对外切葡萄糖酶的抑制作用，恢复纤维素的降解并继续生成还原糖。经二次接种酿酒酵母共同发酵80 h后的玉米秸秆，其纤维素的降解率可达到30%以上，粗蛋白质含量可由原来的5.00%提升至13.23%。其粗蛋白质含量升高有3种可能，其一为拟康宁木霉拥有与康宁木霉相同的固氮作用；其二为接种的菌中所含的菌体蛋白所导致的整体粗蛋白质含量升高；其三为3种菌的扩繁后所导致的整体粗蛋白质含量增加。

4 结论

混合真菌发酵玉米秸秆过程中，其最优发酵参数为：拟康宁木霉和黄孢原毛平革菌发酵玉米秸秆第7天时二次接种酿酒酵母，酿酒酵母接种量为8.5%，与拟康宁木霉和黄孢原毛平革菌再共同发酵80 h后，玉米秸秆的粗蛋白质含量可达到13.23%。相对于玉米秸秆干物质，发酵后玉米秸秆粗蛋白质含量增加。