动物营养学报    2020, Vol. 32 Issue (3): 1293-1304    PDF    
引用本文
程龙, 王连生, 徐奇友. 饲料蛋氨酸水平对松浦镜鲤生长性能、肌肉品质及肌肉合成通路相关基因表达的影响[J]. 动物营养学报, 2020, 32(3): 1293-1304.  
CHENG Long, WANG Liansheng, XU Qiyou. Effects of Dietary Methionine Level on Growth Performance, Muscle Quality and Muscle Synthesis Pathway Related Gene Expression of Songpu Mirror Carp[J]. Chinese Journal of Animal Nutrition, 2020, 32(3): 1293-1304.  
饲料蛋氨酸水平对松浦镜鲤生长性能、肌肉品质及肌肉合成通路相关基因表达的影响
程龙1,2 , 王连生2 , 徐奇友3     
1. 上海海洋大学水产与生命学院, 上海 201306;
2. 中国水产科学研究院黑龙江水产研究所, 哈尔滨 150070;
3. 湖州师范学院生命科学学院, 浙江省水生生物资源养护与开发技术研究重点实验室, 湖州 313000
收稿日期: 2019-09-23
基金项目: 国家自然科学基金（31972800）；国家大宗淡水鱼产业技术体系（CARS-46）
作者简介: 程龙(1992-), 男, 山东济宁人, 硕士研究生, 研究方向为水生动物营养。E-mail:cheng_long93@163.com.
通信作者: 徐奇友, 研究员, 博士生导师, E-mail:xuqiyou@sina.com.
摘要: 本试验旨在研究饲料蛋氨酸（Met）水平对松浦镜鲤生长性能、肌肉品质及肌肉合成通路相关基因表达的影响。选取540尾初始体质量为（24.42±0.19）g的松浦镜鲤幼鱼，随机分为6组，每组3个重复，每个重复30尾鱼。各组分别饲喂Met水平分别为0.56%（对照）、0.66%、0.75%、0.83%、0.92%和1.01%的等氮等能饲料。试验期8周。结果表明：1）0.83%、0.92%和1.01%组的增重率、特定生长率、蛋白质效率及肥满度均显著高于对照组（P < 0.05），饲料系数显著低于对照组（P < 0.05）。2）0.83%、0.92%和1.01%组的肌肉水分含量显著低于对照组（P < 0.05），0.83%、0.92%和1.01%组的肌肉粗蛋白质含量显著高于对照组（P < 0.05），0.92%和1.01%组的肌肉超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）活性均显著低于对照组（P < 0.05）。3）0.83%和0.92%组的快肌和慢肌胰岛素样生长因子-Ⅰ（IGF-Ⅰ）基因表达量显著高于对照组（P < 0.05），0.83%、0.92%和1.01%组的快肌和慢肌雷帕霉素靶蛋白（mTOR）基因表达量显著高于对照组（P < 0.05），0.66%、0.75%、0.83%、0.92%和1.01%组的慢肌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶11（STK11）基因表达量均显著高于对照组（P < 0.05），0.92%和1.01%组的快肌磷脂酰肌醇-3激酶调节亚基3（PIK3R3）基因表达量显著高于对照组（P < 0.05），0.66%、0.75%、0.83%、0.92%和1.01%组的快肌和慢肌肌球蛋白重链（MHC）基因表达量均显著高于对照组（P < 0.05），0.83%、0.92%和1.01%组快肌和慢肌核因子E2相关因子2（Nrf2）基因表达量均显著高于对照组（P < 0.05）。由此可见，饲料添加Met可以促进鲤鱼生长，提高鲤鱼肌肉品质并促进肌肉合成相关基因的表达。当饲料半胱氨酸水平为0.64%时，以特定生长率和蛋白质效率为评价指标，通过折线模型分析得到松浦镜鲤幼鱼Met需要量为0.90%。
关键词: 蛋氨酸    松浦镜鲤    肌肉    品质    合成通路    基因表达    
Effects of Dietary Methionine Level on Growth Performance, Muscle Quality and Muscle Synthesis Pathway Related Gene Expression of Songpu Mirror Carp
CHENG Long1,2 , WANG Liansheng2 , XU Qiyou3     
1. College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China;
2. Heilongjiang River Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Harbin 150070, China;
3. Zhejiang Provincial Key Laboratory of Aquatic Bioresource Conservation and Development Technology, College of Life Sciences, Huzhou Normal University, Huzhou 313000, China
Corresponding author: XU Qiyou, professor, E-mail: xuqiyou@sina.com.
Abstract: This experiment was conducted to study the effects of dietary methionine (Met) level on growth performance, muscle quality and muscle synthesis pathway related gene expression of Songpu mirror carp. A total of 540 juvenile Songpu mirror carp with the initial body weight of (24.42±0.19) g were randomly divided into 6 groups with 3 replicates per group and 30 fish per replicate. Fish in 6 groups were fed the isonitrogenous and isoenergetic diets with the Met levels of 0.56% (control), 0.66%, 0.75%, 0.83%, 0.92% and 1.01%, respectively. The experiment lasted for 8 weeks. The results showed as follows:1) the weight gain rate, specific growth rate, protein efficiency ratio and condition factor of 0.83%, 0.92% and 1.01% groups were significantly higher than those of the control group (P < 0.05), and the feed conversion ratio was significantly lower than that of the control group (P < 0.05). 2) The muscle moisture content of 0.83%, 0.92% and 1.01% groups was significantly lower than that of the control group (P < 0.05), the muscle crude protein content of 0.83%, 0.92% and 1.01% groups was significantly higher than that of the control group (P < 0.05), and the activities of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and glutathione peroxidase (GPx) in muscle of 0.92% and 1.01% groups were significantly lower than those of the control group (P < 0.05). 3) The gene expression of insulin-like growth factor (IGF-Ⅰ) in fast-twitch muscle and slow-twitch muscle of 0.83% and 0.92% groups was significantly higher than that of the control group (P < 0.05), the gene expression of mammalian target of rapamycin (mTOR) in fast-twitch muscle and slow-twitch muscle of 0.83%, 0.92% and 1.01% groups was significantly higher than that of the control group (P < 0.05), the gene expression of serine/threonine protein kinase 11 (STK11) in slow-twitch muscle of 0.66%, 0.75%, 0.83%, 0.92% and 1.01% groups was significantly higher than that of the control group (P < 0.05), the gene expression of phosphoinositide-3-kinase regulatory subunit 3 (PIK3R3) in fast-twitch muscle of 0.92% and 1.01% groups was significantly higher than that of the control group (P < 0.05), the gene expression of myosin heavy chain (MHC) in fast-twitch muscle and slow-twitch muscle of 0.66%, 0.75%, 0.83%, 0.92% and 1.01% groups was significantly higher than that of the control group (P < 0.05), and the gene expression of nuclear factor E2-related factor 2 (Nrf2) in fast-twitch muscle and slow-twitch muscle of 0.83%, 0.92% and 1.01% groups was significantly higher than that of the control group (P < 0.05). In conclusion, the addition of Met in diet can improve the growth and muscle quality of carp, and promote expression of muscle synthesis pathway related gene. When dietary cystine level is 0.64%, based on specific growth rate and protein efficiency ratio, using the broken-line model analysis indicate that the Met requirement of juvenile Songpu mirror carp is 0.90%.
Key words: methionine    Songpu mirror carp    muscle    quality    synthesis pathway    gene expression    

饲料氨基酸平衡是影响肌肉生长的关键因素[1-2]，蛋氨酸(Met)作为鱼类生长的必需氨基酸，是蛋白质合成的重要组分[3]，目前Met对鲤鱼肌肉生长机理的研究尚不深入，因此研究Met对鲤鱼肌肉品质及肌肉合成相关基因表达的影响具有重要意义。肌肉生长一般为肌纤维的增生和肥大的共同结果，在大多数脊椎动物中，肌肉的增生一般出生后很快就会结束[4]，但在鱼类物种的大部分生命周期中一直维持着肌肉的增生和肥大，直到达到成年鱼类时的体积[5]。Met作为鱼类的必需氨基酸，对鱼体正常的生长及新陈代谢都具有重要作用[6]。研究表明，Met是参与蛋白质合成的重要组分，以S-腺苷甲硫氨酸的形式作为多种化合物甲基化的供体，在机体众多代谢过程中具有重要地位，同时Met也是合成胱氨酸、胆碱等物质的前体[3]。饲料Met缺乏会严重降低鱼类的摄食量及增重率，使鱼类生长受阻，而在饲料中补充Met可以显著改善鱼类生长性能，其中胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)作为鱼类的重要生长因子在一定程度上受饲料Met水平的影响。研究发现，外源性补充Met可提高虹鳟(Oncorhynchus mykiss)[7]、斑点叉尾(Ictalurus punctatus)[8]及建鲤(Cyprinus carpio var. Jian)[9]等鱼类IGF-Ⅰ的基因表达量，但Met对鲤鱼IGF-Ⅰ所主导的肌肉合成通路的研究并不够深入。因此，本试验旨在探究不同水平Met对松浦镜鲤肌肉成分与品质以及IGF-Ⅰ所主导的肌肉合成通路的影响，为进一步探索Met在鱼类肌肉合成中的作用、改善肌肉品质提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 试验饲料

Met添加形式为DL-Met(纯度≥99%)，购自Evonik Industries AG公司。根据鲤鱼营养需要[10]以及NRC(2011)[11]要求，以进口蒸汽鱼粉、豆粕、菜籽粕和棉籽粕为蛋白质源，以豆油、鱼油、大豆磷脂为脂肪源，配制成低Met基础饲料，并于基础饲料中分别添加0.1%、0.2%、0.3%、0.4%和0.5%的Met。将饲料原料粉碎后过80目筛，称重后将各原料逐级混合均匀，加入一定量的水，充分混匀后经小型制粒机加工成粒径为3 mm的颗粒饲料，常温风干后于-20 ℃冰箱保存备用。试验饲料组成及营养水平见表 1，试验饲料氨基酸组成分析见表 2，其中实测饲料Met水平分别为0.56%、0.66%、0.75%、0.83%、0.92%和1.01%。粗蛋白质含量采用半自动微量凯氏定氮法(GB/T 6432—2018)测定；粗脂肪含量采用索氏抽提法(GB/T 6433—2006)测定；粗灰分含量采用马弗炉灼烧法(GB/T 6438—2007)测定；干物质含量通过饲料水分含量计算得出，水分含量采用直接干燥法(GB/T 6435—2014)测定。

表 1 试验饲料组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (DM basis)  
表 2 试验饲料氨基酸组成分析(干物质基础) Table 2 Analysis of amino acid composition of experimental diets (DM basis)  
1.2 试验设计及饲养管理

试验采用循环水养殖系统，该系统桶容积为500 L，养殖试验前彻底清理鱼缸并消毒。试验鱼购自黑龙江水产研究所呼兰试验站，试验前用4%食盐水进行鱼体消毒，驯化2周后，挑取540尾初始体质量为(24.42±0.19) g、规格相近的镜鲤幼鱼，随机分为6组，每组3个重复，每个重复30尾鱼。各组分别饲喂Met水平为0.56%(对照)、0.66%、0.75%、0.83%、0.92%和1.01%的等氮等能饲料。试验期8周。

试验期间光照均匀，试验用水为曝气控温后的自来水，每天换水20%并定期清洗鱼缸，保持水质良好，水温(23±0.5) ℃，溶氧浓度＞5.0 mg/L，氨氮浓度＜1.0 mg/L。试验期间，按鱼体重的4%投喂相应饲料，每天09:00、13:00和17:00各投喂1次。

1.3 样品采集和测定 1.3.1 样品采集

养殖试验结束后，清点每缸试验鱼的数量并称重。每缸随机取3尾鱼，用100 mg/L MS-222麻醉，称量体重和体长，置于冰盘上解剖，将鱼体沿鳃盖后缘至背鳍第1鳍条处的侧线以上部位去皮，取下肌肉。将慢肌与快肌分离，其中快肌呈乳白或浅黄色，慢肌呈深红色[12]，分别取下一部分放于液氮中，采样后置于-80 ℃保存，用于RNA提取及分子检测。将另外部分快肌分割成数块0.5 cm宽的小块，分别用于检测肌肉pH、滴水损失、蒸煮损失及抗氧化酶活性，剩余肌肉用于检测水分、粗蛋白质、粗脂肪及粗灰分含量。

1.3.2 生长性能
1.3.3 肌肉品质指标

肌肉pH测定：每缸分别取3尾鱼同侧新鲜背肌，立即用肌肉pH直测仪(德国麦特斯pH-Star)测定pH，记为pH0 min；测定后装入密封袋中，4 ℃保存24 h，再次测定pH，记为pH24 h。

肌肉滴水损失测定：每缸分别取3尾鱼同侧新鲜背肌，吸水纸吸干背肌上的水分和血渍，称重；放于离心管中(离心管底部垫有适量吸水纸)，于4 ℃、4 000 r/min离心20 min，取出肉样，吸水纸吸干肌肉表面的水分，称重。

肌肉蒸煮损失测定：每缸分别取3尾鱼同侧新鲜背肌，吸水纸吸干背肌上的水分和血渍，称重，装入密封袋中；70 ℃隔水蒸煮15 min，取出肉样冷却，吸水纸吸干肌肉表面的水分，称重。

1.3.4 肌肉抗氧化酶活性

将待测的肌肉样品在4 ℃下解冻，称重后按1 : 9的质量体积比加入预冷的0.86%的生理盐水，然后采用FJ-200高速分散均质机(300~23 000 r/min)匀浆，匀浆液经4 000 r/min离心10 min，取上清，采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒检测超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)活性。

1.3.5 肌肉合成通路相关基因表达

总RNA提取及反转录：取出备用的鲤鱼快肌及慢肌组织，用液氮研磨成粉末，按照Trizol试剂盒说明书的方法提取肌肉组织中的总RNA并溶解在焦碳酸二乙酯(DEPC)水中，采用Thermo ScientificTM NanoDrop 8000超微量紫外可见光分光光度计检测总RNA浓度及纯度，并使用1%琼脂糖凝胶电泳以确认样品28S和18S rRNA条带的完整性。将检测合格的RNA按照TaKaRa RR047A试剂盒说明书进行反转录为cDNA第1链。

引物的设计与合成。肌肉合成通路相关基因包括：IGF-Ⅰ、磷脂酰肌醇-3激酶调节亚基3(PIK3R3)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶11(STK11)、雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、肌球蛋白重链(MHC)及核因子E2相关因子2(Nrf2)。利用NCBI网址及Primier 5.0软件进行引物设计(表 3)，以β-肌动蛋白(β-actin)为内参基因，通过这些基因的扩增用来显示在该基因鲤鱼快肌、慢肌之间的表达差异。

表 3 荧光定量引物序列 Table 3 Fluorescence quantitative primer sequences

实时荧光定量PCR：运用Applied Biosystems公司7500实时荧光定量PCR操作系统，根据TaKaRa RR420A试剂盒说明书进行实时荧光定量PCR，检测鲤鱼快肌、慢肌中各待测基因的表达量。荧光定量结果采用2-ΔΔCt方法处理数据。

1.4 统计分析方法

试验数据使用SPSS 19.0统计软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，并采用Duncan氏法进行多重比较，以P < 0.05为差异显著性标准，试验结果采用“平均值±标准差”表示。Met需要量以特定生长率、蛋白质效率为指标进行折线模型回归分析；Met与肌肉合成通路相关基因的相关性进行二次回归分析。

2 结果 2.1 饲料Met水平对松浦镜鲤生长性能的影响

如表 4所示，0.83%、0.92%和1.01%组的增重率、特定生长率及蛋白质效率均显著高于其他各组(P < 0.05)，0.75%组显著高于对照组和0.66%组(P < 0.05)，0.83%、0.92%和1.01%组之间无显著差异(P>0.05)；0.83%、0.92%和1.01%组的肥满度均显著高于对照组(P < 0.05)，0.83%、0.92%和1.01%组之间无显著差异(P>0.05)；0.83%、0.92%和1.01%组的饲料系数均显著低于其他各组(P < 0.05)，0.92%和1.01%组显著低于0.83%组(P < 0.05)。

表 4 饲料Met水平对松浦镜鲤生长性能的影响 Table 4 Effects of dietary Met level on growth performance of Songpu mirror carp

如图 1和图 2所示，当饲料Met水平低于0.90%时，松浦镜鲤特定生长率和蛋白质效率随饲料Met水平的增加均呈现升高趋势；当饲料Met水平高于0.90%时，特定生长率和蛋白质效率随饲料Met水平的增加均呈现降低趋势；当饲料Met水平为0.90%时，特定生长率和蛋白质效率均有最大值，分别为2.94%与2.45%。

图 1 松浦镜鲤特定生长率与饲料Met水平的折线关系 Fig. 1 Break-line relationship between specific growth rate and dietary Met level of Songpu mirror carp
图 2 松浦镜鲤蛋白质效率与饲料Met水平的折线关系 Fig. 2 Break-line relationship between protein efficiency ratio and dietary Met level of Songpu mirror carp
2.2 饲料Met水平对松浦镜鲤肌肉营养成分的影响

如表 5所示，0.83%、0.92%和1.01%组的肌肉水分含量显著低于对照组(P < 0.05)，0.83%、0.92%和1.01%组的肌肉粗蛋白质含量显著高于对照组(P < 0.05)，各组之间肌肉粗脂肪和粗灰分含量差异不显著(P>0.05)。

表 5 饲料Met水平对松浦镜鲤肌肉营养成分的影响 Table 5 Effects of dietary Met level on muscle nutritional composition of Songpu mirror carp  
2.3 饲料Met水平对松浦镜鲤肌肉品质的影响

如表 6所示，各组肌肉pH都为弱酸性，且对照组的肌肉pH最低，并且对照组的肌肉pH24 h < 6.00，0.83%和1.01%组的肌肉pH0 min显著高于对照组(P < 0.05)，1.01%组的肌肉pH24 h显著高于对照组(P < 0.05)，其他各组之间无显著差异(P> 0.05)。各组之间肌肉蒸煮损失及滴水损失均无显著差异(P>0.05)。

表 6 饲料Met水平对松浦镜鲤肌肉品质的影响 Table 6 Effects of dietary Met level on muscle quality of Songpu mirror carp

如表 7所示，0.92%和1.01%组的肌肉SOD、CAT和GPx活性均显著低于对照组及0.66%、0.75%组(P < 0.05)，0.92%和1.01%组之间无显著差异(P>0.05)。

表 7 饲料Met水平对松浦镜鲤肌肉抗氧化指标的影响 Table 7 Effects of dietary Met level on muscle antioxidant indices of Songpu mirror carp U/mg prot
2.4 饲料Met水平对松浦镜鲤肌肉合成及品质相关基因表达的影响 2.4.1 饲料Met水平对松浦镜鲤肌肉合成通路相关基因表达的影响

如图 3、图 4所示，随饲料Met水平的增加，快肌与慢肌IGF-Ⅰ基因表达量呈现先升高后降低趋势；0.83%、0.92%和1.01%组快肌IGF-Ⅰ基因表达量显著高于对照组(P < 0.05)，0.75%、0.83%和0.92%组慢肌IGF-Ⅰ基因表达量显著高于对照组(P < 0.05)。随饲料Met水平的增加，快肌和慢肌mTOR和STK11基因表达量都呈现先升高后降低的趋势，其中快肌STK11和慢肌mTOR、STK11基因表达量均在0.83%组最高；0.75%、0.83%、0.92%和1.01%组快肌mTOR基因表达量以及0.83%、0.92%和1.01%组慢肌mTOR基因表达量均显著高于对照组(P < 0.05)；各组之间快肌STK11基因表达量差异不显著(P>0.05)，0.66%、0.75%、0.83%、0.92%和1.01%组慢肌STK11基因表达量均显著高于对照组(P < 0.05)，且0.66%、0.75%、0.83%、0.92%和1.01%组之间无显著差异(P>0.05)。随饲料Met水平的增加，快肌和慢肌PIK3R3基因表达量呈现升高趋势，0.92%和1.01%组快肌PIK3R3基因表达量显著高于其他组(P < 0.05)，各组之间慢肌PIK3R3基因表达量差异不显著(P>0.05)。快肌IGF-Ⅰ、mTOR、STK11和PIK3R3基因表达量与饲料Met水平相关性分别为：y=-3.262 4x2+7.253 2x-2.087 2 (R2=0.945 2)，y=-24.72x2+46.261x-17.733 (R2=0.782 9)；y=-3.851 1x2+6.422 6x-1.435 1 (R2=0.779 5)；y=2.193 8x2-2.542 5x+1.731 7 (R2=0.935 5)。慢肌IGF-Ⅰ、mTOR、STK11和PIK3R3基因表达量与饲料Met水平相关性分别为：y=-4.416 3x2+7.359x-1.749 4 (R2=0.927 6)；y=-19.822x2+35.971x-12.82 (R2=0.960 6)；y=-5.345 2x2+9.046 8x-2.327 8 (R2=0.832 1)；y=-0.055 4x2+0.810 9x+0.544 8 (R2=0.946 6)。

数据柱形标注不同小写字母表示差异显著(P < 0.05)。下图同。 Value columns with different small letters mean significant difference (P < 0.05). The same as below. 图 3 饲料Met水平对松浦镜鲤快肌合成通路相关基因表达量的影响 Fig. 3 Effects of dietary Met level on expressions of fast-twitch muscle synthesis pathway related genes of Songpu mirror carp
图 4 饲料Met水平对松浦镜鲤慢肌合成通路相关基因表达量的影响 Fig. 4 Effects of dietary Met level on expressions slow-twitch muscle synthesis pathway related genes of Songpu mirror carp
2.4.2 Met水平对松浦镜鲤肌肉合成标志基因表达的影响

如图 5所示，随饲料Met水平的增加，快肌和慢肌MHC基因表达量呈升高趋势；除0.75%与0.83%组间之外，其余各组之间快肌MHC基因表达量均差异显著(P < 0.05)；0.66%、0.75%、0.83%、0.92%和1.01%组慢肌MHC基因表达量均显著高于对照组(P < 0.05)，且0.66%、0.75%、0.83%、0.92%和1.01%组之间无显著差异(P>0.05)。快肌与慢肌MHC基因表达量与饲料Met水平相关性分别为：y=7.140 9x2+5.899 4x-4.581 8 (R2=0.974 7)；y=-13.506x2+24.587x-8.471 8 (R2=0.976 8)。

图 5 饲料Met水平对松浦镜鲤肌肉MHC基因表达量的影响 Fig. 5 Effects of dietary Met level on expression of muscle MHC gene of Songpu mirror carp
2.4.3 饲料Met水平对松浦镜鲤肌肉抗氧化基因表达的影响

如图 6所示，随饲料Met水平的增加，肌肉Nrf2基因表达量大致呈现逐渐增加的趋势；0.83%、0.92%和1.01%组快肌和慢肌Nrf2基因表达量均显著高于对照组(P < 0.05)，0.92%和1.01%组慢肌Nrf2表达量显著高于其他各组(P < 0.05)。快肌与慢肌Nrf2基因表达量与饲料Met水平相关性分别为：y=-0.108 7x2+1.116 8x+0.409 2 (R2=0.906 0)；y=0.712 2x2+1.300 9x+0.093 5 (R2=0.890 1)。

图 6 饲料Met水平对松浦镜鲤肌肉Nrf2基因表达量的影响 Fig. 6 Effects of dietary Met level on expression muscle Nrf2 gene of Songpu mirror carp
3 讨论 3.1 饲料Met水平对松浦镜鲤生长性能的影响

蛋白质作为构成鱼体的主要有机物，也是水生动物饲料中重要的营养成分，鱼类对蛋白质的需求实际上是对必需氨基酸的需求，饲料中必需氨基酸的平衡性对鱼类的生长具有重要作用[3, 6]。Met是参与鱼类生长的必需氨基酸，研究发现在低鱼粉饲料中添加外源Met可显著提高鱼类的生长性能：Yang等[13]研究表明，低鱼粉饲料中添加外源Met可显著提高草鱼(Ctenopharyngodon idella)增重率和蛋白质保留率；Sardar等[14]在以豆粕为主要蛋白质源的南亚野鲮(Labeo rohita H.)饲料中添加DL-Met，结果表明添加0.7%的Met可显著改善饲料中豆粕的利用效率，使南亚野鲮体重增加显著，特定生长率及蛋白质效率显著提高，类似的结果在细鳞巨脂鲤(Piaractus mesopotamicus)[15]中也有发现。本试验结果中，饲料添加Met也可以提高松浦镜鲤增重率、特定生长率及蛋白质效率，进一步验证了外源Met对鱼类生长显著的促进作用。

在对鲤鱼饲料Met适宜添加量的研究中，Schwarz等[16]以终末体重为评价指标得出鲤鱼饲料含0.42%半胱氨酸条件下，其Met适宜需要量为0.86%。Tang等[17]采用二次回归分析对建鲤增重率进行分析，得出在饲料半胱氨酸水平为0.3%的条件下，幼年建鲤适宜Met水平为1.2%。本研究结果表明，在饲料半胱氨酸水平为0.64%条件下，松浦镜鲤适宜Met需要量为0.90%。此结果稍高于以往的研究结果，可能是由于试验鱼种类、生长阶段及投喂策略不同导致。

3.2 饲料Met水平对松浦镜鲤肌肉合成通路相关基因表达的影响

肌肉的增加是鱼类生长的直接因素。研究发现，Met在鱼类肌肉合成过程中处于相当重要的地位[18]。饲料Met水平的增加可提高鱼类肌肉合成中对氨基酸的利用效率，减少氨基酸的氧化损失[2, 19]，增加肌肉生长相关基因的表达，提高肌肉总横截面积[20]。本试验中，饲料添加Met可提高鲤鱼快肌及慢肌中IGF-Ⅰ基因表达量。IGF-Ⅰ作为鱼类生长的重要因子，其大量受体存在于鱼类肌肉中[21]，IGF-Ⅰ在受营养活化后可进一步促进体外物质摄取，刺激鱼类肌细胞对氨基酸的摄取、合成及代谢[18]，调节骨骼肌纤维功能，主要包括促进卫星细胞的活化、增殖和分化[22]，其在提高肌肉合成效率等方面都具有相当重要的作用[5]。磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)作为IGF-Ⅰ下游靶点，IGF-Ⅰ的活化可促进肌肉组织中PI3K合成基因的表达，进一步促进蛋白激酶B(AKT)的磷酸化过程[21]。本研究发现，PI3K及AKT相关基因PIK3R3及STK11在快肌与慢肌中的表达效应虽然总体都呈上升趋势，但个别组之间具有一定的差异，其中0.92%和1.01%组的快肌PIK3R3基因表达量与其余4组显著差异，而慢肌中各组之间均无差异显著；对照组慢肌STK11基因表达量与其余5组显著差异，而在快肌各组之间差异不显著。

雷帕霉素(TOR)及其效应子的mRNA表达能力主要受氨基酸的直接调节，mTOR作为营养敏感信号通路的重要靶点[23]，具有整合来自营养素、能量状态和生长因子的信号，并且具有控制细胞周期、基因转录、细胞骨架组织和蛋白质合成等功能[24]。IGF-Ⅰ对mTOR信号通路的激活具有间接作用，一般需通过诱导PI3K/AKT信号通路的激活进而作用于mTOR[25]。但本试验中，mTOR在快肌及慢肌中的表达量都呈现高饲料Met水平抑制现象，其原因还需要进一步探索。此外，Shan等[9]提出肝脏中IGF-Ⅰ的水平可被认为是比肌肉中更好的指标，但是该假设需要进一步研究。MHC作为肌肉合成的标志基因，其表达量与饲料Met水平呈正相关，研究表明，MHC活性与IGF-Ⅰ在肌细胞中的含量有关，IGF-Ⅰ能够增加肌细胞生成素阳性细胞的存在，提高MHC表达[26]。此外，虽然大多数关于鱼类的研究表明IGF-Ⅰ基因表达量与其生长之间呈现正相关关系，但在澳洲肺鱼(Lates calcarifer)[27]和南部蓝鳍金枪鱼(Thunnus maccoyii)[28]等鱼类中未发现IGF-Ⅰ促进鱼类生长的这一特点。

3.3 饲料Met水平对松浦镜鲤肌肉品质的影响

肌肉营养成分是评价肌肉价值和品质的重要指标。本试验中，饲料添加Met可提高肌肉中粗蛋白质含量，降低肌肉水分含量，进而提高肌肉营养成分。除营养成分外，肌肉pH及保水性等指标也是肌肉加工贮藏中影响肌肉品质的重要因素[29]。研究表明，动物经屠宰后会使得体内糖原迅速降解，产生乳酸，降低肌肉pH[30]。本试验结果显示，饲料添加Met可提高鲤鱼肌肉pH，但对肌肉滴水损失及蒸煮损失并无显著影响，此结果与蒋雪樱等[31]在肉鸡中的研究结果相同。

本试验结果表明，饲料添加Met对鲤鱼快肌及慢肌Nrf2基因表达量都具有提高作用。Nrf2作为抗氧化调节的关键因子，可诱导调节SOD、CAT和GPx等抗氧化酶基因编码[32]。大量研究表明，Nrf2表达受饲料多种氨基酸的影响；Luo等[33]研究发现，随饲料缬氨酸水平的增加，幼龄草鱼肌肉中的Nrf2表达上调，并且提高了肌肉SOD和CAT活性，相似的现象在草鱼饲料亮氨酸的研究中也有发现[34]。但本试验中，虽然Nrf2基因表达量与饲料Met水平呈正相关，但肌肉中SOD、CAT和GPx活性却呈降低趋势，此现象与Xiao等[35]研究的Met羟基类似物(MHA)对建鲤肌肉影响的结果相同，相似的结论在黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)中也有发现[36]，其原因可能是Met对转录或翻译后的SOD和CAT活性具有一定的调节作用有关[35]。此外，饲料氨基酸的合理补充可增加鱼类肌肉中Nrf2基因表达量，但并无研究表明氨基酸可直接增加Nrf2基因表达量。一般认为Nrf2的调节机制包括胰岛素及mTOR调节2种方式：哺乳动物mTOR表达可调节肝癌细胞系HepG2细胞中的Nrf2水平，另外胰岛素可以增加Nrf2的核积累，从而上调小鼠肾细胞中Nrf2靶基因的表达。本试验结果中Met促进肌肉IGF-Ⅰ及mTOR的表达可能是介导Nrf2表达升高的原因，但是详细的机制还需要进一步探索。

4 结论

饲料添加Met可促进鲤鱼生长，增加鲤鱼肌肉合成，提高肌肉品质，促进肌肉合成相关基因的表达。当饲料半胱氨酸含量为0.64%时，以特定生长率和蛋白质效率为评价指标，通过折线模型分析得到松浦镜鲤幼鱼Met需要量为0.90%。

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