牦牛生活在被称为“世界屋脊”的青藏高原，青藏高原的草原冷季漫长，而暖季只有几个月，在冷季的时候牧草中营养十分匮乏，能量和蛋白质、矿物质含量都低于暖季，为适应严酷的生活环境，造就了牦牛相应的生理特性，尤其是对于母牦牛，产牛犊时间多集中在每年的4~6月份，即牧草返青期^[1]。为了让牦牛更好地生长，研究每段时期牧草的营养供给尤为重要。天然放牧草场的牧草是反刍家畜主要饲料来源，其营养状态也决定了反刍家畜的机体代谢及生长状况。体外发酵法操作简便、标准化、重复性和稳定性好，是目前快速动态评定饲料营养价值的方法，也是目前人工瘤胃模拟效果最接近体内的方法。研究表明，牧草的营养价值随着季节、草场位置、环境气候及生长时期等条件的不同存在一定的差异，进而导致牧草的营养价值及利用率产生较大的波动性^[2]，特别是在冷季(2~4月份)，可供家畜采食的牧草营养严重不足，仅能提供给需求量的33.71%，在恶劣的环境下家畜死亡率高达40%~50%^[3]。草畜矛盾日益尖锐，严重影响着高寒草畜生产系统的稳定与发展。张建勋^[4]采用代谢组学技术揭示了冷、暖两季对母牦牛补饲的季节特性及饲料利用机理，表明补饲青稞、菜籽饼均能够提高其生长性能，并促进了脂肪和蛋白质的代谢。晁文菊^[5]以围产期牦牛及其犊牛为研究对象研究补饲对其生长性能的影响，结果表明补饲能够有效提高其产奶量及加快产后体况恢复，提高犊牛初生重，并可缓解草场压力，解决草畜平衡问题。张胜权^[6]采用体外发酵法对三江源地区13种典型草甸草场牧草的营养价值进行了评价，筛选出优质的牧草品种，并为后期三江源地区草甸草场牧草营养价值评定工作的开展提供了数据支撑。以上研究表明草畜矛盾日益尖锐，严重影响高寒草畜生产系统的稳定与发展。

本试验选取处于三江源地区的青海省泽库县典型的高寒草甸草场1~6月份的牧草作为研究对象，此时正值繁殖母牦牛的妊娠中后期、泌乳早期，通过测定牧草中常规营养成分含量以及体外发酵产气量(GP)和体外干物质消失率(IVDMD)等指标，对这一关键时期牧草的营养价值进行评价，进而为该区域放牧草场牧草营养物质的合理利用、放牧家畜冬春季营养需求平衡及牧户适度放牧和精准补饲等研究提供基础依据，以便改善当地畜牧业的发展局面。

1 材料与方法 1.1 牧草采集地情况

牧草采集区域位于青海省黄南州泽库县，地处昆仑山系西倾山北麓，黄南藏族自治州中南部，是青海省三江源自然保护区建设县之一，地理坐标在北纬34°45′~35°32′，东经100°34′~102°08′，平均海拔高度为3 700 m^[7]。该区域由于受纬度、海拔、地形、大气环流等因素的影响，形成了独具特色的高原大陆性气候，雨热同季，降水量较丰富且集中；气温较低，热量不足，无霜期短，年平均日照时间达2 509~2 639 h，太阳辐射强；冷季漫长，年平均风速是4.1 m/s；暖季短促凉爽。境内年平均气温在-2.4~2.8 ℃，县城地区年平均无霜期12 d；年平均降雨量为460 mm，主要集中在5~9月份，牧草生长期仅有150 d左右^[8-10]。境内草地类型主要为典型的高寒草甸和山地草甸草地，主要生长有高山嵩草、矮嵩草、线叶嵩草、藏嵩草等优势植物，还有垂穗披碱草、紫花针茅、细叶苔草、矮火绒草和兰石草等伴生植物，其中禾本科占8.26%，莎草科占38.73%，豆科占1.94%，可食杂草占30.35%，不可食杂草占1.79%，毒草占18.93%。王江山等^[11]研究表明“三江源”地区近40年来在全球气候变暖的大背景下气候呈现出气温升高、降水减少、蒸发增大的干旱化趋势，进而使“三江源”地区牧草的有效生长季呈缩短趋势，牧草产量也呈现下降趋势。

1.2 试验材料

牧草样品采自泽库县放牧草场，从2018年枯草期的1月份至返青期的6月份，每月中旬采样1次，每次在放牧反刍家畜所在的草场内分别随机选取5个采样小区，每个小区间相隔25 m，每个采样小区大小为1 m×1 m，齐地剪取地上部分，除去杂物后编号。将采集的牧草样品带回实验室后80 ℃烘干(8 h)至恒重，粉碎后过60目筛，储备待用。

1.3 试验方法 1.3.1 常规营养成分含量测定

牧草样品中粗蛋白质(CP)含量采用GB/T 6432—1994^[12]方法测定；粗脂肪(EE)含量采用ANKOM XT15i自动脂肪分析仪测定；粗灰分(Ash)含量采用GB/T 6438—1992^[13]方法测定，中性洗涤纤维(NDF)、酸性洗涤纤维(ADF)含量采用Van Soest^[14]的方法测定，所用仪器为ANKOM 200i半自动纤维分析仪。以上测定指标均以干物质为基础。半纤维素(HC)、中性洗涤可溶物(NDS)含量以及消化能(DE)和代谢能(ME)经计算得出，计算公式如下：

1.3.2 体外发酵指标测定

选用3头体重相近、健康状况良好的成年阉牦牛作为瘤胃液供体动物。瘤胃液的采集步骤及人工瘤胃缓冲液的配制参考Menke等^[15]的方法进行，瘤胃液与人工瘤胃缓冲液按照1 : 2的比例混合制成体外瘤胃发酵液。使用分析天平准确称取(200±5) mg牧草烘干样，每个月份的采样时间点各设置3个重复，空白对照设置为不加任何样，放置在100 mL发酵培养管中，加入30 mL体外瘤胃发酵液进行体外发酵。分别在发酵3、6、9、12、18、24、36、48、60、72 h时记录GP，并在发酵24、48、72 h后收集发酵底物，计算IVDMD；在发酵48 h后收集瘤胃液测定pH、氨态氮(NH₃-N)浓度和挥发性脂肪酸(VFA)含量。

使用HANNA HI221型台式酸度计测定发酵液pH，测定前先对该酸度计使用相应标准液进行校正；参照冯宗慈等^[16]改进的比色法测定发酵液NH₃-N浓度；参考文献[17-18]，使用日本岛津GC-2014型气相色谱仪，并依据所用仪器性能设定合适的试验条件对发酵液VFA含量进行测定；体外发酵24、48、72 h的IVDMD依据Bodas等^[19]和Hall等^[20]的方法进行测定与计算。根据各时间点GP按照如下公式计算：

1.4 统计分析

试验数据采用Excel 2010进行数据整理，用SPSS 19.0统计分析软件对不同月份牧草的常规营养成分含量和体外发酵指标进行单因素方差分析，并用Duncan氏法进行组间的多重比较，显著性水平设置为P < 0.05。

2 结果 2.1 不同月份牧草的常规营养成分含量

由表 1可知，牧草的CP、EE、Ash、NDF、ADF、HC、NDS含量以及DE和ME都有着很大的季节性变化。其中，5、6月份的CP含量极显著高于其他月份(P < 0.01)，在6月份达到最高值12.49%，是其他月份的1~3倍，而在1月份达到最低值，仅为4.29%，相对6月份降低了65.63%；5、6月份的EE含量极显著高于其他月份(P < 0.01)，1、2月份的EE含量则极显著低于其他月份(P < 0.01)，1月份的EE含量依然是最低值，仅为1.67%；Ash含量在6月份极显著高于其他月份(P < 0.01)，达到7.88%，是其他月份的1~2倍，5月份则最低，为3.78%；NDF、ADF和HC含量均呈现相似的变化趋势，随月份的增加呈递减趋势；NDS含量、ME和DE与之相反，随月份的增加呈现递增趋势，NDF、ADF和HC含量均在1月份达到最高值，NDS含量在1月份为最低值，为37.55%；在5、6月份NDF、ADF和HC含量均处在较低水平，相应的NDS含量、ME和DE在这2个月份均处于较高水平，与其他月份均存在极显著差异(P < 0.01)。

2.2 不同月份牧草不同发酵时间点的GP和IVDMD

不同月份牧草不同发酵时间点GP动态变化趋势见图 1。由图可知，5、6月份牧草的72 h GP极显著高于其他月份(P < 0.01)，1~3月份均极显著低于其他月份(P < 0.01)，1月份达到最低值，仅为40.93 mL。

不同月份牧草体外发酵24 h的IVDMD为29.93%~54.31%，体外发酵48 h的IVDMD为40.41%~64.64%，体外发酵72 h的IVDMD为46.36%~69.16%。6月份牧草72 h的IVDMD极显著高于其他月份(P < 0.01)，1月份牧草48和72 h的IVDMD极显著低于其他月份(P < 0.01)，具体见图 2。

2.3 不同月份牧草体外发酵48 h发酵液pH和NH₃-N浓度

由表 3可知，发酵液pH在6.88~6.96之间变化，不同月份牧草之间无显著差异(P>0.05)，其中以4月份最低，为6.87，5月份最高，为6.96。发酵液NH₃-N浓度在1~3月份牧草之间不存在显著差异(P>0.05)，但上述月份均显著低于其他月份(P < 0.05)，6个月份中以6月份最高，为10.25 mg/dL，4、5月份次之，2月份最低，为8.47 mg/dL。

2.4 不同月份牧草体外发酵48 h发酵液VFA含量

由表 4可知，不同月份牧草经体外瘤胃液发酵48 h后，除乙酸/丙酸值无显著差异(P>0.05)外，发酵液中各VFA和总VFA含量均产生了极显著变化(P < 0.01)。其中，乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸和异戊酸含量变化趋势相似，均表现为5、6月份较高，极显著高于其他月份(P < 0.01)，2、3、4月份次之，均在1月份最低，且极显著性低于其他月份(P < 0.01)；戊酸含量在6月份有最高值，为0.56 mmol/L，极显著高于其他月份(P < 0.01)，2、5月份次之，1~3月份之间没有显著差异(P>0.05)，但均极显著低于其他月份(P < 0.01)，4月份有最小值，为0.38 mmol/L。在总VFA含量上，5、6月份之间没有显著差异(P>0.05)，二者均极显著性高于其他月份(P < 0.01)，6月份达到最高值55.64 mmol/L，1月份有最小值46.07 mmol/L，极显著低于其他月份(P < 0.01)。

3 讨论 3.1 不同月份高寒草甸草场牧草常规营养成分含量分析

通过对研究区域1~6月份牧草CP、EE、Ash、NDF、ADF、HC、NDS含量及消化能和代谢能进行测定分析，发现不同月份或物候期的牧草营养特性有一定差异，并存在一定的季节性变化规律。牧草作为反刍家畜的主要粗饲料来源，其营养价值对反刍家畜健康生长具有重要作用，青藏高原地区高寒草甸草场产草量与CP含量随季节变化差异较大，而且草场不断退化，人畜、草畜矛盾日趋严重，进而需要更加准确地估测牧草营养价值，实施精准补饲和合理利用草场资源^[21]。CP作为牧草品质的重要构成组分，也是评定牧草营养价值的重要指标之一，且牧草营养价值与CP含量呈正相关性^[22-23]。本研究结果表明，青海省泽库县高寒草甸草场牧草CP含量从枯草期至返青期呈逐渐递增趋势，6月份含量最高，1月份含量最低，分别为12.49%和4.29%。杜雪燕等^[24]对青海省河南县嵩草草地不同时期牧草进行了CP含量测定，得出其含量为5.11%~15.96%，在返青期含量最高，在枯草期含量最低。范小红等^[25]对青海省海晏县典型牧场牧草进行全年营养动态测定后得出CP含量为3.68%~19.21%，5月份含量最高，10月份含量最低。扎西卓玛等^[26]对青海省天峻县高寒草甸草场枯草期和青草期牧草进行了主要营养成分含量测定，得出枯草期和青草期牧草CP含量分别为4.35%和5.80%。不同月份牧草Ash含量变化动态呈“W”型变化，含量为3.78%~7.88%，在返青期6月份含量最高，4月份含量最低。由于Ash主要是植物生长纤维所需原料中的无机盐类，Ash含量越高说明牧草中矿物质含量越高^[27]，即6月份牧草中矿物质含量较高。牧草中EE含量在1.67%~4.11%波动，其中1~3月份含量偏低，5、6月份含量升高，与张均^[28]对西藏那曲地区围栏内外不同月份草地混合牧草EE含量测定结果相似，在返青期含量偏高，之后逐渐降低，在2月份含量最低。NDF和ADF含量分别与反刍家畜的采食量和牧草的适口性、消化率有直接关系，一般来说，其含量随着牧草成熟度和收割时间的延长而逐渐提高^[29]。本试验中牧草NDF和ADF含量的变化趋势基本一致，均在5、6月份极显著低于其他月份，随后伴着牧草的不断生长和成熟，其含量又相应的逐渐升高，均在1月份最高，分别为62.45%和37.34%。综合分析常规营养成分含量测定结果表明，青海省泽库县高寒草甸草场牧草在5、6月份即返青期营养品质优良。

3.2 不同月份高寒草甸草场牧草体外发酵48 h IVDMD分析

干物质消失率在一定程度上均能够反映粗饲料在瘤胃中的难易消化度，是衡量饲料利用率的重要指标^[30]。粗饲料在瘤胃中的降解主要是瘤胃微生物和其分泌相应酶的相互作用，而纤维作为被其利用的大量结构性碳水化合物，NDF和ADF降解率是影响反刍家畜生长性能的重要指标^[31]。张胜权^[6]测得三江源地区草甸草场13种典型牧草的48 h IVDMD在19.9%~54.1%，薛艳锋等^[32]测得玉树州藏蒿草草地牧草的48 h IVDMD为62.67%。本试验中不同月份的牧草经过体外72 h发酵后IVDMD为46.36%~69.16%，在6月份最高。IVDMD越高表明瘤胃发酵情况越好，瘤胃微生物活性越强，且牧草的利用率越高，进而得出反刍家畜在返青期5、6月份能够更好地吸收和消化牧草，使其生长性能良好。

3.3 不同月份高寒草甸草场牧草体外瘤胃发酵相关指标分析

GP能够表现瘤胃微生物活动的总体趋势及干物质消化的水平，其与饲料的可发酵性营养成分含量及瘤胃微生物的活性呈正相关性^[33]。本试验中，不同月份牧草随着发酵时间的延长GP也逐渐递增，但产气速率有所降低，出现这种情况的原因可能是发酵后期发酵底物剩余养分减少或发酵不完全，同时发酵液的pH逐渐降低，对瘤胃微生物活性产生抑制作用^[30]。5、6月份牧草72 h GP显著高于其他月份，且在枯草期1~3月份牧草GP显著偏低，这种变化趋势与不同月份牧草IVDMD的变化趋势基本一致，在牧草品质状况比较差时，干物质消失率和GP自然偏低。这与杜雪燕等^[24]、郝力壮等^[34]对三江源玉树县嵩草草地枯草期牧草48 h IVDMD的变化趋势相似。瘤胃内环境参数如pH、NH₃-N浓度等均可以反映机体营养状况，且是评定饲料营养价值的重要指标^[35]。瘤胃pH是影响瘤胃发酵的重要指标之一，一般在5.5~7.5之间变动，适宜瘤胃微生物生长及正常发酵的pH在6.5左右，当pH<6.2时，分解纤维的细菌的活性将受到抑制^[36-37]。本试验中牧草在4月份发酵液中pH最低为6.88，5月份最低为6.96，均在正常范围内。有研究指出，瘤胃NH₃-N浓度是反映瘤胃微生物对饲料中蛋白质分解能力及吸收速率动态平衡的重要指标，而且在一定范围内，NH₃-N浓度同微生物蛋白质合成速度相关，且NH₃-N主要来自牧草中蛋白质及非蛋白氮物质的降解，因此一般与蛋白质采食量成正比^[38]。本试验中，发酵液中NH₃-N浓度的变化趋势与牧草CP含量的变化情况基本一致，6月份牧草中CP含量最高，可消化蛋白质含量也较高，所以致使NH₃-N浓度在6月份较高，而枯草期时牧草品质较劣，CP含量偏低，满足不了瘤胃中氮循环，致使NH₃-N浓度也偏低，在2月份NH₃-N浓度仅为8.47 mg/dL。VFA是反映瘤胃发酵的重要指标之一，主要包括乙酸、丙酸、丁酸，是碳水化合物发酵得到的主要产物，也是动物机体能量的主要来源和乳脂、体脂合成的主要原料^[39]。Shi等^[40]研究发现在绵羊饲粮中添加一定量的矿物元素可显著提高瘤胃总VFA含量。本试验中，除乙酸/丙酸值无显著差异，均分布在2.61~2.92外，不同月份牧草发酵48 h发酵液中各VFA和总VFA含量均发生了显著变化。其中，乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸和异戊酸含量变化趋势相似，均在6月份最高；戊酸含量在6月份最高，4月份最低，为0.38 mmol/L；在总VFA含量上，6月份最高，为55.64 mmol/L，1月份最低，为46.07 mmol/L。产生这种差异可能与不同月份牧草所含可发酵物质及营养品质不同有直接关系。

4 结论

由牧草常规营养成分含量及体外瘤胃发酵相关指标随物候期变化的动态变化规律可知，青海省泽库县当地典型高寒草甸草场牧草在5、6月份即返青期营养品质优良，体外瘤胃发酵相关指标也均在正常范围内，可满足当地反刍家畜的营养需求；但1~3月份即枯草期牧草营养品质偏低，纤维含量增加，其利用率下降，不能够维持瘤胃微生物的健康生长及反刍家畜的营养需求。因此，为保证家畜在枯草期的恶劣环境下正常生长，当地牧民需要保证放牧家畜瘤胃正常，进行精准补饲，供给所需的营养，实现天然草地和畜牧业发展的互利共赢模式。