奶牛乳腺炎是乳品行业中的世界性难题，它可能会引起奶牛的不适，并造成一定的经济损失。奶牛乳腺炎可能在哺乳过程中多次发生，导致奶牛产奶量降低，严重时也可能造成奶牛的繁殖性能降低，增加医疗成本，并增加死亡率和淘汰率^[1]。

1 奶牛乳腺炎的病原学研究

乳中的一系列物理和化学变化以及乳房组织的病理变化都会引起乳腺炎症的发生^[2]。引起乳腺炎发生的病原体可以被分为2类，一类为非传染性微生物，最常见的是乳房链球菌、停乳链球菌、大肠杆菌和凝固酶阴性葡萄球菌；另一类是传染性微生物，主要包括金黄色葡萄球菌和无乳链球菌等^[3]。当感染发生时，乳腺中的细菌数量逐渐增多使乳腺上皮细胞开始损伤；且由于感染持续的存在，乳中的体细胞数不断增加致使乳腺组织损伤恶化，最终导致腺体中的腺泡开始失去完整的结构，引起血乳屏障被破坏，造成炎症反应^[4]。

2 奶牛乳腺防御中的第1道防线

乳腺上皮组织是抵御病原体入侵的第1道防线。研究发现，在患有乳腺炎的牛乳中存在不同类型的细胞，主要包括内皮细胞、嗜中性粒细胞(PMN)、淋巴细胞、巨噬细胞和乳腺上皮细胞等。这些细胞也被称为乳体细胞，其中乳腺上皮细胞占乳体细胞的1%~2%，PMN、内皮细胞、淋巴细胞和巨噬细胞之和占乳体细胞的98%~99%^[5]。在正常奶牛乳中，体细胞数为每毫升20万~30万个；然而在感染乳腺炎的奶牛乳中，体细胞数高达每毫升50万个以上。目前引起乳体细胞数增加的最主要的原因就是乳腺炎的发生^[6]。

奶牛乳腺上皮细胞除了具有泌乳功能外，还是先天性免疫的重要组成部分，可合成和分泌多种免疫活性物质，如炎症趋化因子、细胞因子和宿主防御肽等，对乳腺的免疫防御功能发挥重要作用。研究表明，奶牛乳腺上皮细胞在被病原微生物感染后会启动非特异性免疫反应，并且对不同的病原微生物作出特异性的免疫应答^[7]。Paape等^[8]研究发现，乳腺上皮细胞可分泌大量的白细胞介素-8(IL-8)，诱导PMN从血液迁徙到乳腺中，通过黏附分子CD11/CD18家族与内皮细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、内皮细胞间黏附分子-2(ICAM-2)和内皮细胞白细胞黏附分子-1(ELAM-1)相结合，在感染部位充当吞噬细胞，发挥更强的抑菌效果。Pareek等^[9]在研究中也证实了奶牛乳腺上皮细胞有分泌IL-8的功能，且PMN可通过奶牛乳腺上皮细胞屏障进行迁移。因此，奶牛乳腺上皮细胞是乳腺免疫防御的重要屏障。

内皮细胞通过血乳屏障的建立，为促进奶牛最佳产奶所必需的溶质和大分子的交换提供了有力保障。除此之外，在炎症发生时，还能够通过调节血浆成分和白细胞来保护乳腺组织免受损伤^[10]。乳腺通过乳头管暴露于外部环境，如果细菌能够穿透乳头末端屏障，那么乳腺炎症反应的效率将决定乳腺炎是否发生。但炎症加剧或持续反应会导致内皮功能障碍，对屏障完整性和周围血管外组织的健康产生负面影响。另外，内皮细胞还在协调宿主对传染性细菌病原体的防御中起直接作用^[11]。血管内皮细胞在细菌入侵的初始阶段促进可溶性和细胞宿主防御机制进入乳腺组织中，有效的炎症反应将迅速识别并消除入侵细菌，不会引起乳腺组织的任何可辨别的变化。然而，当最初的炎症反应未能阻止细菌感染时，临床或慢性乳腺炎会导致产奶量和乳品质受损^[12]。正常内皮细胞功能的缺陷会造成炎症反应不足以及乳腺组织损伤和功能丧失。除此之外，内皮细胞调节多种稳态机制，包括维持适当的血管张力，调节血管通透性，调节血液流动性以及在病原体暴露期间保护乳腺的免疫反应调节^[11]。微生物和微生物组分侵袭机体，触发上皮细胞和常驻巨噬细胞的反应，从而产生和释放多种炎症介质，如细胞因子和活性氧(ROS)、一氧化氮(NO)等化学介质^[10]。这些炎症介质使吞噬细胞免疫细胞聚集并强力激活内皮细胞，内皮细胞还促进炎症的主动消退以保护脉管系统和间质组织的完整性^[13]。因此，内皮细胞可通过协调炎症来预防奶牛乳房炎。

巨噬细胞广泛分布于全身及血液，是炎症早期关键的效应细胞。在未感染的乳汁中，巨噬细胞数占总细胞数的30%~74%。当乳腺内感染(IMI)发生后，细菌与许多细胞类型相互作用，特别是巨噬细胞会与乳腺上皮细胞一起启动必要的炎症反应^[14]，释放前列腺素、白细胞三烯和趋化因子等，快速聚集PMN到达感染灶，一旦细菌附着在PMN表面上，就会释放出有效的氧化剂^[15]，如过氧化氢、超氧化物和羟基自由基，从而有效杀死细菌。这些有效的氧化剂不仅破坏了一些细菌，还破坏了周围的一些组织，最终导致PMN的死亡。在摄入和释放化学物质后，大多数PMN会消失。随后，巨噬细胞通过毛细血管的孔进行迁移^[16]。损伤的组织通过PMN和巨噬细胞的吞噬作用诱导细胞死亡，通过这个过程，破坏的化学物质被隔离在死亡的PMN内，然后被巨噬细胞吞噬，以最大限度地减少对组织的进一步损伤。

PMN是血液中的主要吞噬细胞。据报道，PMN在奶牛乳腺内病原体的控制中起着非常重要的作用^[17]，是先天免疫反应的主要效应细胞，以吞噬细菌和炎症反应为主。PMN是机体非特异性免疫因素之一，其功能下降与乳腺炎发病率的增加同时出现。PMN最主要的特点是它具有多叶核，可使其在内皮细胞之间快速迁移。在PMN细胞质内有糖原岛，约占细胞的20%，还有许多与膜结合颗粒，均可被细胞利用，杀灭细菌^[15]。牛的PMN中不仅含有嗜盐性和特异性颗粒，还含有第3种新颗粒，该颗粒比其他2种颗粒大、数量多，并且对于一些细菌成分有很强的特异性及杀菌性。研究发现，最重要的抗菌机制是由嗜盐性颗粒衍生的髓过氧化物酶-过氧化氢-卤化物系统组成的，髓过氧化物酶在过氧化氢和卤化物离子的存在下杀死细菌^[18]。据报道，核因子-κB(NF-κB)信号通路是PMN重要的炎症应答反应机制，通过促进PMN炎性因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)及白细胞介素-6(IL-6)的合成与释放，引起奶牛PMN炎性损伤，从而导致奶牛免疫机能低下^[19]。因此，PMN在快速消除病原体过程中起到重要的作用。

另外，淋巴细胞是免疫反应的核心，分为B淋巴细胞、T淋巴细胞以及自然杀伤细胞(NK细胞)，是机体进行免疫应答的重要细胞成分^[20]。在抗原刺激时，成熟的淋巴细胞分化和增殖，发挥其免疫功能。T淋巴细胞又被分为CD4⁺和CD8⁺细胞。除了这些先天性免疫细胞外，以淋巴细胞为代表的适应性免疫细胞在其转运过程中也会发生变化。细胞进入淋巴，恢复血液流动，并前往其他淋巴器官，继续对全身进行抗原监测^[21]。有研究表明，随着奶牛泌乳期的发展，淋巴细胞的数量及所占的比例会发生改变^[22]。另外，NK细胞是大颗粒非免疫淋巴细胞，在进入循环之前会在骨髓、淋巴结、脾和扁桃体中分化和成熟，其表面具有免疫球蛋白G(IgG)的Fc受体，当靶细胞表面受体与其特异性抗体结合后，将诱导Fc段活化，活化的Fc段与NK细胞表面的Fc受体结合，从而激活NK细胞对靶细胞的杀伤作用^[22]。

3 奶牛乳腺防御中的第2道防线

免疫球蛋白作为检验乳腺炎症的一项重要的指标，其含量与奶牛的泌乳阶段以及乳腺炎症的程度有关。IgG是血清中免疫球蛋白的主要成分，占血清免疫球蛋白总量的75%，其在结合补体、增强免疫细胞吞噬病原微生物和中和细菌毒素的能力方面具有重要的作用，能有效地抗感染^[23]。奶牛具有的免疫球蛋白有IgG1、IgG2、免疫球蛋白M(IgM)和免疫球蛋白A(IgA)4类，其中免疫识别主要由特异性抗体(IgG2和IgM)来完成，这些抗体通过Fab区识别细菌并通过PMN质膜上的Fc受体与PMN结合，另外，IgA可以阻止入侵的病原微生物在乳腺内扩散^[24]。Targowski等^[25]首次观察到牛的PMN通过膜体外迁移后刺激Fc受体的表达并增强了吞噬作用。在体内移植PMN到未经产的母牛乳房后，IgG1和IgG2的结合能力增加，而IgM的结合能力减少，IgA的结合能力保持不变。血液中的PMN有大约76%的IgM，而乳腺中的PMN只有2%的IgM；并且，PMN的吞噬活性在体外趋化后可显著增加，而不是在体内趋化后^{[24, 26]}。此外，研究还表明IgG2的缺乏会造成奶牛乳腺炎的发病率升高^[26]。这些研究结果表明，IgG2可能在介导PMN吞噬病原体作用方面比IgM发挥了更重要的作用。

除了免疫球蛋白外，补体的含量虽然很低，但是在奶牛乳腺免疫中的作用很大。补体存在于健康无炎症的奶牛乳汁中，它的激活促进了吞噬作用。在抗体结合的细菌表面产生的补体3b(C3b)和补体3bi(C3bi)分别由位于PMN细胞膜上的补体受体1(CR1)和补体受体3(CR3)识别。在感染过程中，PMN迁移到乳中，使C3b的结合能力增加^[27]。因此，PMN抑制细菌的入侵，从而更快地消除病原体。一旦补体和免疫球蛋白与PMN表面的受体相结合，就会产生“呼吸爆发”现象，细胞会变得活跃并产生ROS(如超氧阴离子和过氧化氢)且伴随着PMN中己糖磷酸酶活性的增强^[28]。细胞表面形成的超氧自由基和过氧化氢与吞噬体膜相互作用形成羟基自由基和单线态氧，此反应对于清除革兰氏阴性菌非常有效。此外，在缺乏特异性调理素的情况下，大肠杆菌富含凝集素的菌毛有助于革兰氏阴性菌的PMN吞噬作用，这是一种被称为非调理吞噬作用的过程^[29]。因此，通过这种机制，PMN能够结合和摄取大肠杆菌，从而抑制炎症反应。

作为微生物病原体的靶标，乳还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶是宿主对抗感染和炎症反应的核心。强效氧化剂的过量释放会破坏邻近的宿主组织并导致炎症组织损伤，所以吞噬细胞必须精确控制NADPH氧化酶活性的位置和时间。据报道，PMN-NADPH氧化酶的活性对奶牛乳腺防御的能力是至关重要的^[30]。NADPH氧化酶活性的提高有助于增强吞噬作用和维持胞浆pH的稳态。在泌乳早期时，当NADPH氧化酶活性降低时，会使乳中PMN产生ROS的量较低^[28]。在吞噬体中含有的过氧化物酶阳性物质中含有脂肪球，对细菌成分有很强杀菌性的嗜天青颗粒可能迁移到含有过氧化物酶阳性物质的吞噬体并与之融合，从而提高PMN杀灭细菌的能力。

炎症过程是由促炎和抗炎介质，特别是细胞因子的释放和代谢之间的平衡而决定的。然而，由于炎症反应的强度随着侵袭病原体的种类或产生的细菌毒素的类型而变化，所以还不能很好地理解所有细胞因子合成的协同作用^[31]。事实上，在大肠杆菌和金黄色葡萄球菌所诱导的感染试验中，牛乳中的细胞因子含量是不同的。对于一些特殊的炎症反应，需要其他的细胞的调控，如淋巴细胞和PMN凋亡所产生的免疫球蛋白等^[32]。当促炎和抗炎机制之间的平衡受到干扰时，疾病就变得不受控制。PMN通过释放各种炎性细胞因子[肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-12(IL-12)]和趋化因子IL-8、生长相关癌基因α和巨噬细胞炎症蛋白1α)促进炎症和免疫反应^[30]。IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α等细胞因子在乳腺炎症反应中起着重要的免疫调节作用。另外，由吞噬细胞产生的化学介质是消除入侵细菌所必需的，它们属于急性炎症反应的潜在机制。此外，化学介质，如来源于PMN的ROS，也可能导致乳腺分泌细胞广泛损伤，导致产奶量降低^[33]。将PMN和巨噬细胞暴露于脂多糖(LPS)可迅速诱导许多介质的分泌，如NO和ROS等。NO是一种主要的炎症介质，NO的过量产生会导致血管扩张和血管通透性的增加。研究表明，促炎细胞因子或LPS可诱导一氧化氮合成酶(iNOS)的表达，进一步促进NO的合成^[34]。而ROS作为第二信使，参与细胞生长、黏附、分化、衰老和凋亡，以及影响抗原加工、非经典自噬和信号传导等过程。ROS的过量产生和积累会增加炎性细胞因子如TNF-α、IL-6和IL-1β的释放，最终导致细胞凋亡。不平衡的氧化还原状态造成乳腺炎的发生^[35]。因此，抑制NO和ROS的产生是一种治疗炎症性疾病的有前景的方法。

在乳腺的防御反应中，最重要的模式识别受体为Toll样受体(TLR)，其分布非常广泛，并且每一种TLR都能识别病原微生物并诱发相关的免疫反应。TLR2可以与TLR1或TLR6结合成二聚体，从而识别革兰氏阳性菌和支原体。有研究表明，TLR2是实现金黄色葡萄球菌内化到奶牛乳腺上皮细胞(BMEC)所必需的，可通过介导NF-κB等信号通路的活化诱导TNF-α、IL-6、IL-8等炎性细胞因子的表达与释放^[36]。TLR4是一种跨膜蛋白，参与先天免疫反应，可被LPS激活。激活后，TLR4刺激下游NF-κB信号通路并触发大量炎性细胞因子的产生。激活的NF-κB作为诱导的转录因子，可抑制细胞因子对PMN凋亡的调节，并通过NF-κB信号通路调控免疫应答、细胞增殖和细胞凋亡^[37]。NF-κB作为一种关键的核转录因子，其包含p50和p65亚基，与未刺激细胞的细胞质中的抑制因子NF-κB抑制剂(IκB)相关，响应各种刺激。IκB是一种可以抑制NF-κB信号通路的抑制剂，它可以阻止促炎因子基因表达的激活^[38]。NF-κB被激活并诱导IκBα从二聚体复合物中降解和释放，随后NF-κB p65磷酸化并易位至细胞核。NF-κB亚基的磷酸化可以增加或减少靶基因的转录，从而对NF-κB功能产生影响。

当NF-κB信号通路异常时，会进一步导致机体炎症反应和免疫应答的异常，所以可通过调控NF-κB信号通路调节炎症机体的免疫应答。王亨等^[39]在LPS诱导奶牛乳腺上皮细胞先天性免疫反应中发现，乳腺上皮细胞可能通过TLR信号通路来识别病原微生物并促进NF-κB的转导，从而诱导炎性细胞因子IL-8、TNF-α等的表达。占今舜等^[40]在苜蓿素对LPS诱导下的奶牛乳腺上皮细胞炎症和乳蛋白合成相关基因表达的影响研究中发现，添加适当的苜蓿素可以通过提高奶牛乳腺上皮细胞的抗氧化性能来保护细胞免受氧化损伤，提高细胞活性，从而通过抑制TLR4/NF-κB信号通路的活化减少炎性细胞因子TNF-α的表达。

4 奶牛乳腺防御中2道防线相互作用

在奶牛乳腺中，这2道防线是一个高度组合的整体，它们即相互调节又相互作用，在乳腺的防御过程中起到十分重要的作用。尽管在乳腺感染的早期PMN对乳腺抵御病原菌入侵有利，但是促进PMN的凋亡也可能对随后将病原菌清除有利。而乳腺炎症的消除与PMN的存活和凋亡之间的平衡密切相关^[41]。一旦进入乳头管，病原体与白细胞和上皮细胞的接触就会激活先天性免疫系统。在病原菌识别后，通过表达TLR、CD14等特异性受体，循环PMN从血液中募集到乳腺组织，抑制细菌生长^[42]。白细胞释放多种细胞因子，进而诱发急性期蛋白的合成。据报道，不同的免疫球蛋白亚型可以阻止细菌的定植，或支持PMN的吞噬作用，尤其是对IMI病原体产生免疫应答的动物，可快速有效地提高PMN的招募能力，使趋化因子向感染灶聚集^[43]。这些趋化因子与PMN质膜上的特异性受体相结合，当细胞黏附到内皮表面之后，活化的PMN通过特定的膜黏附分子的表达发生外渗，离开血液循环并在感染部位充当吞噬细胞，有效消除炎症。

5 小结

奶牛乳腺炎作为奶牛生产中的一个急需解决的重要问题，了解乳腺的免疫机制，特别是感染初期发挥关键作用的免疫机制是非常重要的。细胞免疫是一个特别复杂的过程，涉及乳体细胞、血清蛋白等相互作用与调控，本文为更好地了解奶牛乳腺炎细胞免疫机制提供了参考。