锌在动物机体内发挥着非常重要的作用，它维持动物正常的生长发育、调节动物的生殖机能、保证动物正常的免疫功能等[1-4]，是动物体不可缺少的微量元素[5]。除此之外，饲粮锌水平还影响动物肉品质，增强角质化蛋白生成，促进被毛健康生长[6]。在毛皮动物上的研究发现，蓝狐[7]和银狐[8]的针毛长度和绒毛长度随着饲粮中锌水平的提高在一定范围内有所增加。同时，也有研究结果表明，饲粮缺锌会减缓羊毛被毛的生长速度，造成局部发育不良，严重时甚至导致掉毛和脱毛[9]；饲粮缺锌还会降低动物毛质，影响毛皮的经济价值[10]。由此可以看出，锌在动物的被毛生长中发挥重要作用。络先虎等[11]研究结果表明，饲粮添加蛋氨酸锌具有促进皖西白鹅羽绒生产的作用。罗义春等[12]发现，利用氧化锌可以人工调节鹅换羽。我国是鹅羽绒生产和出口大国，羽绒生产也是肉鹅产业重要的组成部分。但目前有关羽绒的相关研究却相对滞后，不能满足生产需求。作为生物合成角蛋白的另一种表现形式，鹅羽绒的生长发育是否受饲粮锌调控?饲粮锌水平不同，鹅羽绒品质是否也会有所不同?与羽绒发育相关的基因表达水平是否会随之变化?鹅适宜的饲粮锌水平是多少?这一系列问题均尚无参考资料。因此，本试验以霍尔多巴吉鹅为研究对象，探讨饲粮锌水平对其再生羽绒品质、血清指标及毛囊发育相关基因表达的影响，旨在揭示锌对鹅羽绒再生的作用，同时也为确定鹅羽绒再生期适宜的饲粮锌水平提供科学的理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验动物及分组随机选取同条件养殖的5月龄健康霍尔多巴吉鹅128只，采绒后随机分成4组，每组4个重复，每个重复8只，公母各占1/2。4组鹅分别饲喂在基础饲粮(锌水平为31.68 mg/kg)中添加0(Z1组)、60(Z2组)、120(Z3组)和180 mg/kg(Z4组)一水合硫酸锌(ZnSO4·H2O，折合成锌的添加量分别为0、21.79、43.57和65.36 mg/kg)的饲粮。基础饲粮营养水平参照NCR(1994)[13]设计，其组成及营养水平见表 1。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) |
试验鹅在整个试验期内均采用网上平养模式，自由采食饲粮，自由饮水。预试期7 d，正试期42 d。
1.3 样品采集背部毛囊组织样于正式试验第28天采集，每个重复选取公母鹅各1只取样，样品直接保存于Trizol中，置于-80 ℃保存。
背、腹、胸部羽绒样品于正式试验第42天时采集，每个重复选取公母鹅各2只取样；采集羽绒样品后，翅静脉采集全血约4 mL，静置后于离心机内以4 500 r/min离心10 min，制备上清液，并于-20 ℃保存。
1.4 指标测定 1.4.1 再生羽绒品质指标的测定千朵绒重：随机从背、腹、胸部混合绒中数1 000个完整朵绒，用0.000 1 g感量电子天平称质量。
绒朵长度：分别随机选取背、腹、胸部50个完整绒朵，稍作整理，使其呈现收起的伞状，置于载玻片上，上覆盖玻片，用游标卡尺测定绒朵根部到尖端的长度。
绒枝细度：采用测量绒朵长度的样品，每个取2根绒丝，整理平直，夹于盖玻片与载玻片之间，在Leica DM1000显微镜下拍照，在电脑程序中每个绒丝取中部2个点测量直径，取平均值。
1.4.2 血清指标的测定血清总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLOB)、甘油三酯(TG)含量与碱性磷酸酶(AKP)活性使用日立7180全自动血液生化分析仪测定，血清生长激素(GH)、类胰岛素生长因子-1(IGF-1)和催乳素(PRL)浓度采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定。上述指标测定所用试剂盒均为上海博谷生物科技有限公司产品。
1.4.3 毛囊发育相关基因mRNA相对表达量的测定IGF-1和表皮生长因子(EGF)基因的引物(表 2)采用Roche LCPDS 2软件设计，由上海生工生物技术有限公司合成，目的基因为β-肌动蛋白(β-actin)。荧光定量PCR采用SYBR染色，使用QuantiFast® SYBR® Green PCR Kit试剂盒和LightCycler® 480 Ⅱ型荧光定量PCR仪进行，每个实时定量PCR设3个重复。PCR反应程序为：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火及延伸30 s，共40个循环。
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表 2 实时荧光定量PCR引物信息 Table 2 Primer information for quantitative real-time PCR |
试验所得数据由Excel 2010软件录入和前期处理，用SPSS 20.0中的one-way ANOVA模块进行方差分析，Duncan氏法进行多重比较，数据采用“平均值±标准差”表示，以P < 0.05作为差异显著性的判断标准。
2 结果 2.1 饲粮锌水平对鹅再生羽绒品质的影响由表 3可知，饲粮中添加不同水平的锌均可提高试验鹅再生羽绒的千朵绒重以及背部、腹部、胸部绒朵长度，但差异均未达到显著水平(P>0.05)，当锌添加量为43.57 mg/kg时，千朵绒重以及背部、腹部、胸部绒朵长度达到最大值。再生羽绒的羽枝细度随着饲粮中锌添加量的增加而降低，锌添加量为43.57和65.36 mg/kg时，试验鹅羽枝细度显著低于锌添加量为0和21.79 mg/kg时(P < 0.05)。
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表 3 饲粮锌水平对鹅再生羽绒品质的影响 Table 3 Effects of dietary zinc level on regenerative down quality of geese |
由表 4可知，饲粮中添加不同水平的锌可不同程度提升鹅血清中AKP活性和TG含量。当饲粮中锌添加量为65.36 mg/kg时，血清中AKP活性达到最高，为74.00 U/L，显著高于锌添加量为0和21.79 mg/kg时(P < 0.05)；当饲粮中锌添加量为43.57 mg/kg时，血清中TG含量达到最高，为0.71 mmol/L，显著高于锌添加量为0、21.79和65.36 mg/kg时(P < 0.05)。饲粮中添加不同水平的锌对血清中TP、ALB和GLOB含量未产生显著影响(P>0.05)。
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表 4 饲粮锌水平对鹅血清生化指标的影响 Table 4 Effects of dietary zinc level on serum biochemical indices of geese |
由表 5可知，饲粮中添加不同水平的锌对鹅血清中GH和PRL浓度产生了影响显著(P < 0.05)，对血清中IGF-1浓度未产生显著影响(P> 0.05)。饲粮中锌添加量为21.79 mg/kg时，血清中GH和IGF-1浓度均最高，血清中PRL浓度则在锌添加量为43.57 mg/kg时最高。
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表 5 饲粮锌水平对鹅血清激素浓度的影响 Table 5 Effects of dietary zinc level on serum hormone concentrations of geese |
由表 6可知，饲粮中添加不同水平的锌对鹅血清中钙、铁和锌含量均未产生显著影响(P>0.05)。血清中锌含量随着饲粮中锌添加量的增加先升高后降低，当锌添加量达到43.57 mg/kg时，血清中锌含量最高。血清中钙和铁含量则随着饲粮中锌添加量的增加分别呈现上升和下降趋势。
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表 6 饲粮锌水平对血清中钙、铁和锌含量的影响 Table 6 Effects of dietary zinc level on serum calcium, iron and zinc contents of geese |
从图 1可以看出，毛囊中EGF基因的mRNA相对表达量随着饲粮中锌添加量的增加先升高后降低，在锌添加量为43.57 mg/kg时最高，显著高于锌添加量为65.36 mg/kg时(P < 0.05)。毛囊中IGF-1基因的mRNA相对表达量也随着饲粮中锌添加量的增加先升高后降低，但各添加量之间差异不显著(P>0.05)。
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*表示组间差异显著(P < 0.05)。 * mean significant difference between groups (P < 0.05). 图 1 饲粮锌水平对鹅毛囊发育相关基因mRNA相对表达量的影响 Fig. 1 Effects of dietary zinc level on mRNA relative expression levels of genes related to follicle development of geese |
在动物体内，锌具有调节胱氨酸等多项物质代谢、正常合成与转化，促进细胞正常生长并维持其完整结构等多种功能，在保证动物绒毛健康生长中发挥着重要作用。刘海英等[14]研究发现，补锌对羊毛的生长有促进作用。郭强[7]在蓝狐、耿文静[8]在银狐上的研究结果表明，适当范围内提高饲粮锌水平，绒毛长度和针毛长度皆有所提升。本研究结果也显示，饲粮中添加不同水平锌后，试验鹅再生羽绒的千朵绒重以及背部、腹部和胸部绒朵长度均有不同程度增加，这与上述研究结果相类，证明锌可以对动物羽绒的生长起调节作用。但本试验结果也显示，饲粮中锌添加量超过43.57 mg/kg后再生羽绒的千朵绒重以及背部、腹部和胸部绒朵长度均呈现下降趋势，这表明锌可能仅在适宜的添加范围内才可以促进动物羽绒的再生。
3.2 饲粮锌水平对鹅血清指标的影响锌是体内多种酶的辅助因子，也是多种锌指蛋白的结构域，与机体蛋白质、脂类等代谢息息相关[15-16]。陈苗璐等[17]在鹅上、冯江[18]在肉仔鸡上的研究均发现适宜的饲粮锌水平能显著提高血清TP含量。本研究中饲粮锌水平虽未对鹅血清TP含量产生显著影响，但以饲粮中锌添加量为43.57 mg/kg时血清TP含量最高。刘泽辉[19]研究发现，肉鸡胸肌的肌内脂肪含量随饲粮锌水平的提高而显著增加，腿肌的肌内脂肪含量也有类似的趋势。由此可以看出，锌在动物机体内起着调节脂肪代谢的作用。本研究结果显示，试验鹅血清中TG含量随锌添加量的增加先升高后降低，在饲粮中锌添加量为43.57 mg/kg时达到最高，说明此时脂肪沉积能力最强。
高惠林等[20]对桃源鸡血清中AKP的活性进行了研究，发现在一定范围内，饲粮中添加锌能提升血清中AKP的活性。由于锌是AKP的辅基，因此，经常用AKP的活性来反映体内锌的状况。AKP可以催化磷酸单酯水解，释放出无机磷，加快机体代谢，其活性高低也可间接判断动物的生长发育情况。本研究结果显示，随着饲粮中锌添加量的增加，鹅血清中AKP活性增加，动物生长发育加快，与上述研究结果基本一致。
一定量的锌可以调节GH的浓度，促进其与受体的结合，从而诱导合成IGF-1。陈苗璐等[17]在鹅上、蒋宗勇等[21]在黄羽肉鸡上的研究发现，一定范围内，血清中GH与IGF-1的浓度随着饲粮锌水平的提高而增加。本研究结果与上述研究结果相似，当饲粮中锌添加量达到21.79 mg/kg时，鹅血清中GH与IGF-1浓度达到最高，之后开始下降。此外，饲粮在一定范围内添加锌还可以提高鹅血清中PRL浓度，以锌添加量为43.57 mg/kg时效果最好。
本试验结果显示，饲粮锌水平影响血清中其他微量元素的含量，使钙含量提高，铁含量降低，这表明微量元素间有极其复杂的相互协同和拮抗作用，这与彭西等[22]的研究结果基本一致。孙永伟等[23]对内蒙古白绒山羊毛发发育过程中的背部、体侧及腹部皮肤的转录组数据进行了分析，发现钙、铁、锌相关基因参与调控毛发生长。从本研究结果还可以看出，饲粮中锌添加量的改变引起血清中钙、磷、铁含量的相应变化，这些微量元素可能共同参与鹅羽绒再生过程的调节，但其相关的分子机制还未阐明，仍需进一步探讨。
3.3 饲粮锌水平对鹅毛囊发育相关基因表达的影响锌是动物体必需的微量元素，通过催化和调节机体毛囊和皮肤中绒毛或羽绒发育相关基因的表达，实现其对动物绒毛或羽绒生长发育与凋亡等的调控[24]，通过以上调控，对细胞的增殖与分化进行干预，进而影响机体的发育[25]。有试验表明，降低饲粮锌或细胞中锌的水平会引起机体系统功能紊乱[26]。当饲喂只含1 mg/kg锌的饲粮时，动物出现缺锌的典型症状，如秃头症、皮炎、食欲降低等。由此可以看出，锌对动物绒毛发育的调控起着重要作用。研究表明，EGF可以促进毛囊上皮细胞增殖，对毛囊发育有促进作用[27]。IGF-1则通过与其结合蛋白作用，维持毛发初期生长，刺激毛囊增殖[28]。锌对动物绒毛或羽绒发育相关基因EGF和IGF-1表达的调节功能部分通过生长激素-类胰岛素生长因子轴实现[29-30]。因此，如本试验结果所示，当饲粮中锌添加量发生改变时，会引起毛囊中IGF-1与EFG基因mRNA相对表达量的上调或下调，从而对鹅羽绒的生长发育起到调控作用。
4 结论在锌水平为31.68 mg/kg的基础饲粮中添加21.79~43.57 mg/kg锌(使饲粮锌水平达到53.47~75.25 mg/kg)时，鹅的各项血清指标均处于较理想的状态，并能提高再生鹅绒的千朵绒重以及胸部、背部、腹部绒朵长度，降低羽枝细度，提高羽绒品质。此外，饲粮锌水平对IGF-1与EFG等鹅毛囊发育相关基因的表达起到不同程度的调节作用，从而影响鹅羽绒的生长发育。
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