豆渣是生产豆浆、豆腐、豆粉等豆制品的副产物。研究表明,豆渣具有丰富的营养价值,而且豆渣可以代替豆粕饲喂反刍动物[1-2]。利用豆渣替代部分豆粕饲喂奶牛30 d后,其产奶量、乳脂率、精料消耗量等指标与豆粕组无显著差异[3-4]。近年来,王治华等[5]、穆会杰等[6]、李岩等[7]、张学燕等[8]和高红[9]等众多学者利用传统化学方法和体外产气法等方法来评定豆渣的营养价值,结果表明,豆渣中可代谢蛋白质和潜在的可利用碳水化合物含量较高,可以为反刍动物提供较多的能量和氮源。豆渣具有较高的营养价值,是一种潜在的可以替代常规饲料的蛋白质来源。因此,我们应该充分掌握其营养价值并应用于反刍动物的生产中,从而达到节本增效的目的。由于豆渣含水量较高,不易储存,造成严重的资源浪费。因此,合理的开发和利用豆渣对节约资源和农业的发展具有重要意义。
生产上常采用烘干等方式降低豆渣等湿饲料的含水量,从而便于储存和运输。对饲料进行加热往往会伴随着美拉德反应的发生,且过度加热会破坏饲料内部分子结构,降低饲料的营养价值[10]。用传统的化学方法对热处理后豆渣营养价值及消化率进行测定既费时又费力,因此,寻求一种能够直接地反映出豆渣营养价值热损害程度的敏感指标显得尤为重要。傅里叶变换红外光谱(FTIR)技术能够简单、快速地分析不同饲料之间化学成分的细微差异,并且对其内部的分子结构不具有破坏性[11]。利用NRC(2001)[12]模型评定奶牛营养需要量已被许多国家和地区广泛应用。因此,本试验旨在利用FTIR技术研究不同程度热处理豆渣分子结构功能团的特征,同时运用NRC模型评价不同热处理对豆渣代谢蛋白质产量、可消化养分含量和能值的影响,进而探求它们之间是否存在相关关系,为简单、快速、准确地评定饲料营养价值提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料本试验于2017年5月在哈尔滨某饲料加工厂采集大豆经过豆制品加工后剩余的新鲜湿豆渣,并将采集到的新鲜豆渣在实验室条件下利用烘箱进行不同温度(100、115、130 ℃)下不同时间(2、4、6 h)的热处理,在持续烘干过程中每隔0.5 h进行搅拌,共计9种不同程度热处理样品,每个热处理样品的平行样为3个。取出样品冷却后,取部分样品用粉碎机粉碎过1 mm孔筛,用于常规化学分析;再取部分样品用粉碎机粉碎过2 mm孔筛,用于瘤胃降解试验;剩余样品用粉碎机粉碎过0.25 mm孔筛,用于光谱分析。
1.2 测定指标与方法 1.2.1 常规化学成分分析干物质(DM)、粗灰分(Ash)、粗脂肪(EE)、粗蛋白质(CP)、中性洗涤不溶蛋白(NDICP)和酸性洗涤不溶蛋白(ADICP)含量按照AOAC(1990)[13]的方法进行测定。中性洗涤纤维(NDF)、酸性洗涤纤维(ADF)和酸性洗涤木质素(ADL)含量按照Van Soest等[14]的方法进行测定。淀粉(starch)含量按照Weiss等[15]的方法进行测定。
1.2.2 瘤胃尼龙袋法降解试验选用东北农业大学阿城试验基地的3头装有永久性瘤胃瘘管的健康荷斯坦奶牛(体重600 kg左右)进行瘤胃降解试验。试验期间每日饲喂2次(08:00和16:00),自由饮水。试验饲粮参照NRC(2001)[12]奶牛营养需要标准进行配制,试验饲粮组成及营养水平见表 1。瘤胃降解试验过程根据Peng等[16]的方法,将装有豆渣样品的尼龙袋用橡皮筋扎紧袋口后随机投放到瘤胃网兜中,依次培养2、4、8、12、24、36、48 h,每个时间点同一瘘管牛的尼龙袋个数均是3个。取出尼龙袋后,选择300目尼龙布制成10 cm×20 cm的尼龙袋,准确称取7 g豆渣样品装入尼龙袋中,然与0 h时间点的尼龙袋一起用冷水冲洗,65 ℃烘干48 h至恒重,然后取出袋中的残渣粉碎过1 mm孔筛,将不同时间点的残渣分别装入封口袋中保存待测。
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表 1 试验饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the experimental diet (air-dry basis) |
利用NRC模型预测不同程度热处理豆渣的代谢蛋白质产量,包括瘤胃可降解蛋白质(RDP)、瘤胃非降解蛋白质(RUP)、菌体蛋白质(MCP)、小肠可吸收菌体蛋白质(AMCP)、小肠可吸收过瘤胃蛋白质(ARUP)、内源蛋白质(ECP)、小肠可吸收内源蛋白质(AECP)、可代谢蛋白质(MP)。根据康奈尔净碳水化合物-蛋白质体系(CNCPS)模型,瘤胃能氮平衡(RENB)值由瘤胃可降解蛋白质可合成菌体蛋白质(MCPRDP)和总可消化养分(TDNm)可合成菌体蛋白质(MCPTDNm)的差值来估测。相关计算公式如下:
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式中:A为快速降解蛋白质部分;B为可降解蛋白质部分;C为完全不降解的蛋白质部分;Kd为B的降解速率;Kp为待测饲粮瘤胃流通速率。A、B、C含量通过瘤胃尼龙袋法测定。
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式中:当物理有效中性洗涤纤维(peNDF)/NDF>20%时,peNDFadj=1.0;当peNDF/NDF<20%时,peNDFadj=1.0-[(20-peNDF)×0.025]。
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式中:MCP中80%为真蛋白质(PB),80%可在小肠内吸收[17]。
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式中:50%的ECP能到达十二指肠,且80%为真蛋白质(PB)[17]。
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式中:MCPTDNm=0.13×TDNm;MCPRDP=0.9×RDP。
1.3.2 利用NRC模型估测不同程度热处理豆渣的真可消化养分与能值利用NRC模型估测不同程度热处理豆渣的奶牛瘤胃真可消化非纤维性碳水化合物(tdNFC)、真可消化蛋白质(tdCP)、真可消化中性洗涤纤维(tdNDF)和真可消化脂肪酸(tdFA)。进而估测出各饲粮的TDNm、生产水平消化能(DEp)、生产水平代谢能(MEp)及生产水平泌乳净能(NELP)。同时,采用肉牛估测模型公式预测各饲粮的维持净能(NEm)和增重净能(NEg)。各预测公式[12, 17]如下:
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式中:PAF为加工校正因子;FA为脂肪酸,如果EE<1,则FA=0。
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式中:DE1X为1倍维持水平的消化能;如果TDNm<60%,消化率的折扣忽略不计。
1.4 FTIR分析在红外烤灯照射下,将称好的2 mg干燥的豆渣样品与200 mg溴化钾(KBr)放到玛瑙研钵中,充分研磨使其混合均匀,并用红外专用压片机(769YP-15A粉末压片机)压成半透明薄片状。然后利用傅里叶变换红外光谱仪(岛津FTIR-8 400S)对豆渣样品进行扫描,以溴化钾作为背景,背景图谱扫描次数为256次,并对空气(二氧化碳和水蒸气)进行校正,扫描波段在4 000~400 cm-1,分辨率为4 cm-1,扫描次数为128次,每个样品做5个重复,收集不同程度热处理豆渣的蛋白质和碳水化合物分子结构光谱图[18]。
1.5 光谱分子功能团特征参数处理使用OMNIC 8.2软件将得到的豆渣样品红外光谱图进行分析。先在OMNIC 8.2软件中找出蛋白质基线位置,确定出酰胺Ⅰ带区域(基线:ca.1 709~1 562 cm-1)和酰胺Ⅱ带区域(基线:ca.1 562~1 471 cm-1)。然后在OMNIC 8.2软件中找出碳水化合物基线位置,确定出结构性碳水化合物区域(基线:ca.1 475~1 187 cm-1)、纤维复合物区域(基线:ca.1 287~1 187 cm-1)和总碳水化合物区域(基线:ca.1 187~898 cm-1),然后利用Excel 2010表格记录其峰面积值。
本试验的分子功能团特征参数包括:蛋白质酰胺Ⅰ带与结构性碳水化合物峰面积比值(Amide Ⅰ_STCHO)、蛋白质酰胺Ⅰ带与纤维复合物峰面积比值(Amide Ⅰ_CELC)、蛋白质酰胺Ⅰ带与总碳水化合物峰面积比值(Amide Ⅰ_CHO)、蛋白质酰胺Ⅱ带与结构性碳水化合物峰面积比值(Amide Ⅱ_STCHO)、蛋白质酰胺Ⅱ带与纤维复合物峰面积比值(Amide Ⅱ_CELC)、蛋白质酰胺Ⅱ带与总碳水化合物峰面积比值(Amide Ⅱ_CHO)。
1.6 数据处理采用SAS 9.4软件中的PROC MIXED程序对不同程度热处理豆渣的代谢蛋白质产量、可消化养分和能值的含量进行数据分析。具体模型为:
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式中:Yijk是对自变量ijk的因变量;μ是变量的平均值;Fi是温度效应(i=3;100、115、130 ℃);Bj是时间效应(j=3;2、4、6 h);Fi×Bj是温度与时间的交互作用,作为固定效应;eijk是误差效应。
采用Tuley-Karmaer检验比较不同温度和时间之间的差异,P < 0.05表示差异显著,P>0.05表示差异不显著。
采用SAS 9.4软件中的PROC MIXED程序对不同程度热处理豆渣的蛋白质和碳水化合物光谱分子功能团特征参数进行数据分析,模型同上数据统计。再利用SAS 9.4软件中的PROC CORR对它们进行相关性分析(P < 0.01表示极显著相关,P < 0.05表示显著相关,0.05 <P < 0.10表示趋于相关)。最后,豆渣的分子功能团特征参数与其代谢蛋白质产量、可消化养分和能值之间的预测模型通过SAS 9.4软件中的PROC REG程序逐步回归。
2 结果与分析 2.1 利用NRC模型估测不同程度热处理对豆渣代谢蛋白质产量的影响由表 2可知,温度和时间对豆渣代谢蛋白质产量中ECP和AECP含量均有显著影响(P < 0.05),并且温度和时间之间存在显著的互作效应(P < 0.05)。随着温度的升高以及加热时间的延长,MP的含量没有明显变化趋势,RUP和ARUP的含量呈现出升高的趋势,其变化范围为28.14~33.79 g/kg DM、23.92~28.72 g/kg DM。随着温度的升高以及加热时间的延长,RDP、MCP、AMCP、MCPRDP、MCPTDNm含量和RENB值呈现出降低的趋势,其变化范围分别为196.74~196.55 g/kg DM、101.69~109.99 g/kg DM、65.08~70.39 g/kg DM、76.21~78.73 g/kg DM、101.69~109.99 g/kg DM、25.48~31.26 g/kg DM。
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表 2 利用NRC模型估测不同程度热处理对豆渣代谢蛋白质产量的影响 Table 2 Effects of different heat treated okara on metabolic protein production by using NRC model prediction |
由表 3可知,温度和时间对豆渣可消化养分中tdNFC含量有显著影响(P < 0.05),并且温度和时间之间存在显著的互作效应(P < 0.05)。随着温度的升高以及加热时间的延长,tdFA含量呈现出升高的趋势,其变化范围为35.24~39.66 g/kg DM。随着温度的升高以及加热时间的延长,tdNFC、tdCP、tdNDF和TDNm含量呈现出降低的趋势,其变化范围分别为261.52~321.79 g/kg DM、201.67~212.90 g/kg DM、236.80~239.08 g/kg DM、782.23~846.05 g/kg DM。随着温度的升高以及加热时间的延长,DEP、MEP、NELp、NEm和NEg表现为逐渐降低的趋势,其变化范围分别为57.53~62.19 MJ/kg DM、57.65~62.36 MJ/kg DM、40.34~43.65 MJ/kg DM、183.35~234.80 MJ/kg DM、195.99~253.44 MJ/kg DM。由此可见,加热会降低豆渣中估测的能值。
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表 3 利用NRC模型估测不同程度热处理对豆渣可消化养分含量和能值的影响 Table 3 Effects of different heat treated okara on digestible nutrient contents and energy values by using NRC model prediction |
由表 4可知,温度和时间之间对豆渣光谱分子结构功能团Amide Ⅰ_STCHO、Amide Ⅰ_CELC、Amide Ⅰ_CHO、Amide Ⅱ_STCHO、Amide Ⅱ_CELC和Amide Ⅱ_CHO存在显著的互作效应(P < 0.05)。
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表 4 不同程度热处理对豆渣光谱分子结构功能团特征的影响 Table 4 Effects of different heat treatments on spectral molecular functional group characteristics of okara |
由表 5和表 6可知,Amide Ⅰ_CHO与RDP、MCPRDP存在极显著正相关(r=0.52,P < 0.01),与RUP存在极显著负相关(r=-0.52,P < 0.01),与MCP、AMCP、MCPTDNm存在显著正相关(r=0.46,P < 0.05),与ARUP、ECP存在显著负相关(r=-0.38~-0.45,P < 0.05)。Amide Ⅰ_STCHO与RDP、MCP、AMCP、MCPRDP、MCPTDNm存在显著正相关(r=0.38~0.42,P < 0.05),与RUP存在显著负相关(r=-0.42,P < 0.05)。Amide Ⅰ_CELC与RDP、MCP、AMCP、MCPRDP、MCPTDNm存在显著正相关(r=0.45~0.47,P < 0.05),与RUP存在显著负相关(r=-0.45,P < 0.05)。Amide Ⅰ_CELC与tdCP、TDNm、DEP、MEP、NELp、NEm和NEg存在显著正相关(r=0.39~0.47,P < 0.05)。Amide Ⅰ_CHO与tdCP、TDNm、DEP、MEP、NELp、NEm和NEg存在显著正相关(r=0.41~0.46,P < 0.05)。
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表 5 不同程度热处理豆渣预测蛋白质代谢参数与光谱分子结构功能团特征的相关关系 Table 5 Correlation between predicted metabolic parameters of protein and spectral molecular functional group characteristics of different heat treated okara |
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表 6 不同程度热处理豆渣可消化养分和能值参数与光谱分子结构功能团特征的相关关系 Table 6 Correlation between prediction of digestible nutrient contents and energy values and spectral molecular functional group characteristics of different heat treated okara |
由表 7的回归方程可知,不同程度热处理豆渣分子结构功能团可以预测基于NRC模型下代谢蛋白质的产量。其中,Amide Ⅰ_STCHO和Amide Ⅰ_CHO可以共同作为预测因子估测RDP (R2=0.35,P < 0.05)、RUP(R2=0.35,P < 0.05)、ARUP(R2=0.33,P < 0.05)和MCRDP(R2=0.35,P < 0.05)的含量。
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表 7 不同程度热处理豆渣光谱参数与预测蛋白质代谢参数、可消化养分和能值参数之间的回归模型分析 Table 7 Regression model analysis of spectral parameters with predicted metabolic parameters of protein, digestible nutrient contents and energy values of different heat treated okara |
饲料蛋白质中70%的CP被微生物降解即为RDP,剩余的CP不被降解则为RUP。瘤胃微生物利用碳源和氮源合成MCP,并同RUP进入真胃和小肠中被利用[17]。RDP是合成MCP的主要氮源,对反刍动物瘤胃代谢起着至关重要的作用。本试验结果表明,豆渣的RDP含量随着加热程度的增加呈逐渐降低的趋势,这可能是由于CNCPS体系中非蛋白氮(PA)和快速降解蛋白(PB1)的含量随着加热程度的增加逐渐减小的原因,从而使RUP含量随着加热程度的增加而降低。MCP含量与饲粮TDNm含量呈正相关。本试验结果表明,豆渣的TDNm含量随着加热程度的增加呈现降低的趋势,故MCP随着加热程度的增加其含量逐渐减少。瘤胃ECP的含量与饲粮DM含量呈正相关,且有50%的ECP可到达十二指肠被吸收利用。本试验中,豆渣的DM含量随着加热程度的增加而增加,故ECP含量也随着加热程度的增加而增加;MP由MCP、RUP和ECP 3部分组成,本试验研究结果表明,MP含量随着加热程度的增加没有明显的变化趋势。REND值为MCPTDNm与MCPRDP的差值,若REND值为正值,说明其能量供给过剩,可降解蛋白质供给量不足,本试验中REND值随着温度的升高以及加热时间的延长表现为逐渐降低的趋势。这说明加热程度较小的豆渣其营养供给量较高,在实际生产中应该选择较低的温度对豆渣或其他的饲料进行加热。
3.2 利用NRC模型估测不同程度热处理对豆渣可消化养分含量和能值的影响NRC模型将饲粮中CHO划分为非纤维性碳水化合物(NFC)和纤维性碳水化合物(FC)[17]。tdNFC的含量随着加热程度的增加逐渐降低,这与其NFC的含量逐渐降低有关。tdNDF的含量越高说明对能量供应的贡献值越大。虽然热处理对蛋白质含量影响不显著,但加热会使暴露出的蛋白质二级结构与纤维素或半纤维素发生交联反应,生成不易被微生物破坏的化学键,从而降低tdNDF和tdCP的含量。虽然不同处理之间的脂肪含量差异不显著,但是由于加热会使脂肪表面的物理结构发生改变,从而改变了瘤胃微生物对脂肪的分解作用,从而增加了tdFA的含量增加。TDNm含量为各种真可消化养分之和减去粪中可代谢TDNm(7% DM)[19]。本试验中,随着加热程度的增加,TDNm含量逐渐降低。随着加热程度的增加,DEP、MEP、NELp、NEm和NEg呈逐渐降低的趋势。这说明加热处理会降低豆渣中可消化养分含量和能值,经100 ℃、2 h处理的豆渣可以为奶牛提供更高的TDNm和能值。由于可消化养分和能值的含量为模型估测结果,还需要在动物试验中进一步验证。
3.3 不同程度热处理对豆渣光谱分子结构功能团特征的影响蛋白质和碳水化合物可以为反刍动物提供充足的氮源和能量,因此,研究饲料中蛋白质和碳水化合物的分子结构及其营养价值能够为更好地饲喂奶牛提供重要的参考价值。饲料中蛋白质和碳水化合物的营养价值与其内部分子结构密切相关,而且蛋白质和碳水化合物的分子结构特点会反映饲料的利用价值。Sun等[20-21]研究发现,加热处理使饲料蛋白质和碳水化合物相关官能团分子结构发生变化,加热处理引起的分子结构变化与瘤胃可降解和不可降解碳水化合物组分密切相关。因此,加热处理可能也会使饲料的蛋白质与碳水化合物峰面积的比值发生变化。目前有关于热处理对豆渣光谱分子结构功能团特征(蛋白质与碳水化合物峰面积的比值)影响的研究鲜有报道。孙凯晶等[22]利用NRC模型预测不同玉米副产品代谢蛋白质产量,探究了分子结构功能团比值与代谢蛋白质产量之间的相关关系,对本试验的研究结果有一定程度的支持。因此,研究加热处理引起的饲料内部分子结构功能团及其比值的变化,对于快速、更好地了解饲料的化学组成、瘤胃降解情况和营养价值供给情况具有十分重要的意义。
3.4 不同程度热处理豆渣预测蛋白质代谢参数、可消化养分含量和能值与光谱分子结构功能团特征的相关关系饲料中蛋白质和碳水化合物的营养价值与其内部分子结构密切相关,且饲料分子光谱结构的变化会影响饲料的营养价值、消化行为和利用程度[23-25]。Xin等[26]研究结果表明,霜冻小麦与普通小麦蛋白质与碳水化合物的峰面积比值之间存在差异,利用光谱分析技术可以解释饲料内部分子结构功能团特征。孙凯晶等[23]发现玉米蛋白粉的Amide Ⅰ_CELC较高是由于玉米蛋白粉的CP含量较高,并得出不同玉米副产品的分子结构功能团比值可以作为预测因子对其代谢蛋白质产量参数进行预测,回归方程拟合较好,决定系数(R2)较高。而本试验中,回归方程的R2偏小,但Amide Ⅰ_STCHO和Amide Ⅰ_CHO与蛋白质代谢参数、可消化养分含量和能值存在相关关系。原因可能是饲料不同以及对饲料热处理的方式和程度不同导致回归方程的预测存在偏差。上述研究结果表明,可以利用豆渣蛋白质与碳水化合物峰面积的比值对不同程度热处理豆渣的蛋白质代谢参数、可消化养分含量和能值进行预测。为了得到更多更精准的预测方程,需要我们对不同热处理的豆渣或其他饲料进行大量的研究,找出适宜的分子结构功能团光谱参数来预测热处理后饲料的质量和营养价值。
4 结论① 不同程度热处理对豆渣的代谢蛋白质产量、可消化养分含量和能值具有影响,随着加热程度的增加,豆渣的代谢蛋白质产量、可消化养分含量和能值含量降低。经100 ℃、2 h处理的豆渣可以为奶牛提供更高的TDNm和能值。
② 不同程度热处理对豆渣的分子结构功能团具有影响,并与其代谢蛋白质产量、可消化养分和能值之间存在相关关系,初步证明可以利用分子结构功能团对热处理豆渣的营养价值进行估测,为简单、快速、准确地评定饲料营养价值提供了理论依据。
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