瓦氏黄颡鱼[Pelteobagrus vachelli (Richardson)]属于鲇形目，鲿科，黄颡鱼属，是我国淡水优质特种水产鱼类品种之一，因其养殖周期较短、品质好、单位产量高、适应性强的特点而备受关注。而在养殖过程中由于片面追求高密度养殖和高营养水平饲料投喂，粪便与残饵导致养殖水体富营养化，引起各类病原菌大量滋生；饲料残饵和鱼粪便分解产生的硫化氢、亚硝酸盐和氨氮等化学物质，会对鱼体产生各种应激与毒害作用。为了控制水质以及鱼病，养殖户一般会采用微生态水质改良剂改善水质和利用水产药物防治病害，然而长期使用不单增加养殖成本，也极易造成药物残留。在水产养殖业无抗健康养殖的大趋势下，为了保持水产养殖业的健康可持续发展，可通过研究绿色环保、健康安全的生物活性饲料添加剂在水产饲料中的应用，为达到健康养殖目标提供有效途径。

小球藻(Chlorella vulgaris)是小球藻属的一种单细胞微型藻类，其细胞内含有丰富的蛋白质、脂质、多糖、食用纤维、维生素、色素、微量元素、活性代谢产物等^[1]。小球藻胞内物质要充分地被动物体消化吸收从而更好地发挥生理作用，可经过破壁浸提深加工处理。小球藻醇提物(ethanol extract from Chlorella vulgaris，EEFCV)是小球藻粉采用超声辅助溶剂浸提法，将料液比(藻粉:无水乙醇，g/mL)为1 : 6的浸提液，在40 ℃条件下，采用超声30 min醇提3次的提取工艺获取的醇提物，EEFCV的活性物质中含有丰富的叶绿素、类胡萝卜素和脂肪酸^[2]。小球藻及其提取物等相关生物活性物质在食品、医学保健、饲料等诸多领域均有应用^{[1, 3]}。有研究证明，添加适量的小球藻对动物的生长性能和饲料效率有促进作用^[4]；张宝龙等^[5]报道，小球藻粉对黄颡鱼生长性能和免疫力有促进作用；周蔚等^[6]研究发现，小球藻对银鲫鱼有一定的促进生长作用。因此，本试验通过探讨饲料中添加不同水平的EEFCV对瓦氏黄颡鱼幼鱼生长性能、体组成、消化酶活性及血清生化和抗氧化指标的影响，为EEFCV在黄颡鱼配合饲料中的应用提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 试验饲料

以秘鲁鱼粉、豆粕、棉籽粕和菜籽粕为蛋白质源，以面粉作为糖源，以磷脂油、鱼油和豆油为脂肪源，配制成EEFCV添加水平分别为0、0.25%、0.50%、1.00%、1.50%和2.50%的6种等氮(粗蛋白质含量为40%)等脂(粗脂肪含量为8%)试验饲料，依次分别标记为T0、T1、T2、T3、T4和T5。试验饲料组成及营养水平见表 1。饲料配方中所有原料先经过60目粉碎，各种低剂量原料先逐级扩大混合，再将全部原料集中置于V型混合机混匀，然后于油脂捏合机中加入卵磷脂、鱼油、豆油进行捏合，待油脂混合均匀后，于搅拌机中加入30%水搅拌混合，混匀后用制粒机制成粒径为1.5 mm的颗粒饲料，饲料在空调房18 ℃条件下风干，筛除粉碎状饲料后将颗粒料放入密封袋中，置于-20 ℃冰箱中保存。

1.2 试验设计与饲养管理

试验用瓦氏黄颡鱼苗种购自广州市锦龙渔业有限公司。养殖试验在广东省农业科学院国家农业科技创新与集成示范基地水产养殖试验基地室内循环水养殖系统(缸体为300 L的圆柱形玻璃纤维缸)中进行。试验开始前将鱼苗在渔排网箱中暂养2周，暂养期间每日用商品饲料饱食投喂2次(08:30和16:30)。试验分组时挑选规格均匀、体格健康、体质量约1.85 g的瓦氏黄颡鱼苗540尾，随机分为6个组(T0~T5组)，每组3个重复，每个重复放养30尾鱼，各组分别投喂对应的试验饲料，每日饱食投喂2次(08:30和16:30)，并根据各组鱼苗摄食和生长情况调节次日投喂量，若有剩料收集扣除，试验期间为自然光照，水温16~29 ℃，氨氮含量 < 0.20 mg/L，亚硝酸盐含量 < 0.05 mg/L，溶氧含量>5.0 mg/L，pH 6.8~8.0。饲养试验为期56 d。

1.3 样品采集和检测分析

饲养试验结束后禁食24 h，称量每缸试验鱼总重并统计存活尾数，用于生长性能统计分析。从每个重复缸中选取接近均重的18尾鱼，4尾置于-20 ℃冰箱保存，用于全鱼常规营养成分测定；6尾用于测定个体体重、体长、内脏重和肝脏重，用于计算形体指标；8尾用于尾静脉取血，血液室温静置2 h后，4 000 r/min离心10 min，制备血清样品，于-80 ℃冰箱保存，用于血清生化指标检测分析。另采集3尾鱼的肝脏、全肠和胃样品，于-80 ℃冰箱保存，用于匀浆后消化酶活性测定。

试验饲料和全鱼常规营养成分的测定方法如下：水分含量采用105 ℃常压干燥方法测定(GB/T 6435—1986)，粗蛋白质含量采用凯氏定氮法(GB/T 6433—2006)测定，粗脂肪含量采用石油醚抽提法(GB/T 6433—2006)测定，粗灰分含量采用550 ℃灼烧法(GB/T 6438—1992)测定。

血清谷丙转氨酶(alanine transaminase，ALT)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase，AST)活性及胆固醇(cholestero，CHOL)、甘油三酯(triglyceride，TG)、尿素氮(urea nitrogen，UN)、葡萄糖(glucose，GLU)和总蛋白(total protein，TP)含量采用罗氏全自动生化分析仪(Cobas-8000 c702)测定。匀浆组织液蛋白质含量采用考马斯亮蓝(G-250)方法测定，蛋白酶(protease)活性采用福林-酚法测定，超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase，SOD)、淀粉酶(amylase)、脂肪酶(lipase)活性和丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量及总抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)采用试剂盒(南京建成生物工程研究所)测定，具体操作按试剂盒说明书进行。

1.4 计算公式

相关指标计算公式如下：

1.5 数据统计分析

试验数据用平均值±标准差(mean±SD)表示，采用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，采用Duncan氏多重比较法进行组间显著差异分析，差异显著性水平为P < 0.05。

2 结果 2.1 EEFCV对瓦氏黄颡鱼幼鱼生长性能的影响

由表 2可知，T1~T5组的末均重、增重率和特定生长均高于T0组，T1~T5组的饲料系数均低于T0组，且T4和T5组的末均重、增重率和特定生长率均显著高于T0组(P < 0.05)，T4和T5组的饲料系数均显著低于T0组(P < 0.05)。各组的存活率、肥满度、脏体比和肝体比无显著差异(P>0.05)，但T1~T5组的肥满度、脏体比和肝体比均高于T0组。

2.2 EEFCV对瓦氏黄颡鱼幼鱼体成分的影响

由表 3可知，各组的粗蛋白质和粗灰分含量无显著差异(P>0.05)。T5组的粗脂肪含量显著高于T0组(P < 0.05)，T5组的水分含量显著低于T0组(P < 0.05)，其他各组的粗脂肪和水分含量均无显著差异(P>0.05)。

2.3 EEFCV对瓦氏黄颡鱼幼鱼消化酶活性的影响

由表 4可知，各组的胃、肠和肝脏的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性均无显著差异(P>0.05)，但T1~T5组的胃、肠和肝脏的蛋白酶活性均高于T0组，T1~T5组的胃淀粉酶活性呈先升高后降低趋势，T1~T5组的肠淀粉酶活性均高于T0组。

2.4 EEFCV对瓦氏黄颡鱼幼鱼血清生化指标的影响

由表 5可知，各组的血清谷丙转氨酶、谷草转氨酶活性及胆固醇、甘油三脂、尿素氮、葡萄糖和总蛋白含量均无显著差异(P>0.05)。T1、T3和T4组的血清谷草转氨酶活性显著高于T0组(P < 0.05)。T1~T5组的血清胆固醇、甘油三酯含量随着EEFCV添加水平的增加而升高。

2.5 EEFCV对瓦氏黄颡鱼幼鱼血清抗氧化指标的影响

由表 6可知，T4组的血清丙二醛含量显著低于T0组(P < 0.05)，各组的血清丙二醛含量随EEFCV添加水平的增加呈先降低后升高的趋势。T3~T5组的血清超氧化物歧化酶活性显著高于T0组(P < 0.05)。各组的血清总抗氧化能力无显著差异(P>0.05)。

3 讨论 3.1 EEFCV对瓦氏黄颡鱼幼鱼生长性能的影响

小球藻具有粒径小和营养价值高的特点，在水产养殖领域常常被用来强化培育水产动物的开口饵料或者直接用来作为水产动物幼体基础性生物饵料，比如用小球藻强化培养的轮虫饲养条斑星鲽幼鱼，可以提高泥鳅仔鱼幼鱼生长性能^[7]；用小球藻混合动物性饵料(丰年虫、臂尾轮虫)投喂泥鳅仔鱼，可以有效提高泥鳅仔鱼存活率和特定生长率^[8]；用小球藻强化培育后的轮虫投喂沙塘鳢仔鱼，苗种发育健康、存活率高^[9]。小球藻也可作为水产饲料蛋白质源或添加剂，比如在牙鲆幼鱼^[10]、尼罗罗非鱼^[11]、鲫鱼^[12]和南美白对虾^[13]饲料中的应用，亦可提高水产动物生长性能和饲料效率。小球藻在鱼类仔苗培育和水产饲料中的应用效果表明，小球藻含有对鱼类仔鱼生长的促生长因子。小球藻通过光合作用合成大量的营养物质，其藻体内富含蛋白质、脂质、多糖、色素、维生素、食用纤维、微量元素、活性代谢产物等营养物质^{[1, 14-15]}，为了高效充分地利用细胞内丰富的营养物质，通过细胞破壁释放出胞内物质后，再采用超声波辅助溶剂浸提法提取营养物质^[2]，能更加有效被动物体消化利用。本试验研究发现，随EEFCV添加水平的上升，各试验组末均重、增重率、特定生长率呈上升趋势，饵料系数呈下降趋势，且添加1.50%和2.50% EEFCV组的瓦氏黄颡鱼末均重、增重率、特定生长率相比对照组显著提高，饲料系数显著降低。这一结果与蔡荣等^[16]发现在饲料中添加不同水平的EEFCV对花鲈生长性能有促进作用，特定生长率、蛋白效率有提高趋势和饵料系数有降低的趋势的研究结果基本一致。这表明EEFCV物质中含有对瓦氏黄颡鱼的促生长因子，适量添加可提高瓦氏黄颡鱼的生长性能。

3.2 EEFCV对瓦氏黄颡鱼体成分的影响

水产动物体成分是水产动物生长过程中对营养物质的代谢、转化和沉积的结果。因此，饲料组成往往会影响水产动物的体成分。研究发现，小球藻在水产动物饲料中应用会对水产动物体成分产生影响。石西等^[12]研究发现，小球藻替代鱼粉使鲫肌肉蛋白质含量降低，脂肪含量随着替代比例的增加先下降后上升。而Kim等^[10]和Koo等^[17]研究发现，饲料中添加小球藻藻粉可提高牙鲆机体粗蛋白质含量，降低机体粗脂肪含量。本试验结果表明，饲料中添加0.25%~2.00% EEFCV对瓦氏黄颡鱼体成分中粗蛋白质、粗脂肪、粗灰分和水分含量均无显著影响，仅添加2.50% EEFCV时粗脂肪含量显著升高，水分含量显著降低。这与以上研究结果不一致。分析其原因除了水产动物品种差异外，也可能与小球藻粉和EEFCV营养成分差异有关。但本试验随着EEFCV添加水平增加，瓦氏黄颡鱼全鱼粗脂肪含量呈上升趋势，水分含量呈降低趋势，这与蔡荣等^[16]发现在饲料中添加EEFCV对花鲈体成分影响的试验结果相似。有研究表明，在鱼类饲料中添加不饱和脂肪酸会影响鱼类体成分或肌肉粗脂肪含量，如徐后国^[18]发现，饲料中添加亚麻酸可增加鲈鱼鱼体脂肪沉积；魏广莲等^[19]报道，不饱和脂肪酸能显著提高刀鲚幼鱼肌肉粗脂肪含量；曹俊明等^[20]研究发现，随亚油酸添加水平上升草鱼全鱼粗蛋白质含量降低，粗脂肪含量升高。因此，推断本试验瓦氏黄颡鱼体成分中粗脂肪含量的升高与EEFCV中的不饱和脂肪酸组分有关。

3.3 EEFCV对瓦氏黄颡鱼消化酶活性的影响

以往研究报道的小球藻或其相关制品在不同试验动物的应用对消化酶活性的影响结果存在差异。Radhakrishnan等^[21]研究发现，小球藻粉适量的替代饲料中鱼粉可提高罗氏沼虾消化道蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶活性。而蔡荣等^[16]研究结果表明，饲料中添加EEFCV显著降低了花鲈的肠道蛋白酶和淀粉酶活性，肠道脂肪酶活性则呈先上升后下降趋势。本试验结果发现，饲料中添加EEFCV对瓦氏黄颡鱼胃、肠和肝脏消化酶活性均无显著影响，但能提高瓦氏黄颡鱼消化道蛋白酶、淀粉酶活性，这与Radhakrishnan等^[21]的研究结果相似。而适量添加可提高胃、肠和肝脏脂肪酶活性，这与蔡荣等^[16]的研究结果相似。蔡荣等^[16]阐述了EEFCV中所含的不饱和脂肪酸对消化道消化酶活性有积极的促进作用，而在EEFCV中除了含有丰富的不饱和脂肪酸外还有丰富的天然色素(叶绿素、叶黄素、β-胡萝卜素)^[2]，因此，EEFCV对瓦氏黄颡鱼消化酶活性的影响机理有待进一步的研究。

3.4 EEFCV对瓦氏黄颡鱼血清生化指标的影响

鱼类的血清生理生化指标一定程度上反映鱼类营养状况、新陈代谢水平和生理健康状况，其指标受外部环境条件、自身机体、食物营养水平等诸多因素的影响。本试验中，饲料中添加0~2.50%的EEFCV对瓦氏黄颡鱼血清胆固醇、甘油三脂、尿素氮、葡萄糖和总蛋白含量均无显著影响，说明本试验条件下，饲料中添加EEFCV对瓦氏黄颡鱼蛋白质、脂肪和糖类三大营养物质代谢未产生显著的负效应影响。这与蔡荣等^[16]报道的EEFCV对花鲈血清生化指标没有显著影响的结果一致。但本试验结果发现，饲料中添加适宜水平的EEFCV使瓦氏黄颡鱼血清胆固醇、甘油三酯和葡萄糖含量及谷草转氨酶活性上升，表明EEFCV会提高瓦氏黄颡鱼血脂和血糖含量。这一结果与以往研究结果相反。以往研究报道了小球藻及其醇提物具有降血脂的作用，比如小球藻粉可降低牙鲆血清胆固醇含量^{[10, 22-23]}，EEFCV可降低花鲈血清胆固醇和甘油三酯含量^[16]。推测原因可能与试验动物种类和饲料营养差异有关，具体作用机理有待下一步研究。本试验结果发现，饲料中添加EEFCV对瓦氏黄颡鱼血清谷丙转氨酶活性无显著影响，但血清谷草转氨酶活性升高。这一结果也与蔡荣等^[16]研究结果不一致。而以往关于小球藻对水产动物血清转氨酶活性影响的报道结果亦不一致，如Koo等^[17]研究发现，小球藻粉能降低牙鲆谷血清谷丙转氨酶和谷草转氨酶活性；但Kim等^[10]的报道结果与之相反；Bai等^[24]报道称，饲料中添加小球藻使许氏平鮋血清谷丙转氨酶和谷草转氨酶活性先升高后降低。本试验综合脏体比、肝体比，血清转氨酶活性，血清胆固醇、甘油三脂和葡萄糖含量的结果，推测可能因为饲料中添加EEFCV提高了瓦氏黄颡鱼血脂和血糖含量，造成肝脏组织脂肪堆积，对肝脏组织细胞产生损伤，从而影响血清谷丙转氨酶和谷草转氨酶活性，具体机理有待进一步研究。

3.5 EEFCV对瓦氏黄颡鱼血清抗氧化指标的影响

李恒等^[25]报道了饲料中添加高剂量的海洋小球藻粉能显著降低糖尿病小鼠血清丙二醛含量和显著提高血清超氧化物歧化酶活性，表明海洋小球藻粉对糖尿病小鼠具有抗氧化作用。慈丽宁^[26]研究发现，小球藻粉适量替代鱼粉可提高团头鲂血清抗超氧化物阴离子含量，降低血清丙二醛含量，提高机体抗氧化能力。小球藻胞内醇提物主要含有天然色素(叶绿素、胡萝卜素)和脂肪酸^[2]。吴垠等^[27]研究发现，小球藻油能提高小鼠抗氧化能力，提高血清超氧化物歧化酶活性，降低血清丙二醛含量。刘明美等^[28]研究报道，β-胡萝卜素能使山羊血清超氧化物歧化酶活性和总抗氧化能力显著提高，丙二醛含量显著降低。本试验结果显示，饲料中添加EEFCV能提高瓦氏黄颡鱼抗氧化能力，血清丙二醛含量随EEFCV添加水平的提高呈降低趋势，当EEFCV添加水平达1.50%时，血清丙二醛含量显著降低；血清超氧化物歧化酶活性随EEFCV添加水平的增加呈上升趋势，当EEFCV添加水平达1.00%时，血清超氧化物歧化酶活性显著提高，这与以往报道结果一致。

4 结论

饲料中添加EEFCV对黄颡鱼幼鱼生长性能和抗氧化能力有促进作用，以增重率、特定生长率和饲料系数作为主要评估指标，饲料中添加1.50%的EEFCV应用效果较佳。