2. 山东省动物生物工程与疾病防治重点实验室, 泰安 271018
2. Shandong Provincial Key Laboratory of Animal Biotechnology and Disease Control and Prevention, Tai'an 271018, China
锰广泛存在于自然界，也是机体必需的微量元素。经过研究发现，锰能促进机体生长，提高免疫力和繁殖性能同时对神经情绪活动影响也较大[1]。锰对机体糖类、脂肪、蛋白质代谢及细胞能量调节有重要作用，对骨骼的结构和生长也有重要影响。锰参与体内大多数生物化学反应，同时是体内众多酶的组成成分或激活剂。锰缺乏会导致生长受损、骨缺损、生育能力降低和出生缺陷增加、糖耐量异常、脂质和碳水化合物代谢改变等[2-3]。有研究表明，锰参与脂质代谢，对脂质代谢有重要的作用[4-5]。在断奶母猪饲粮中添加锰已被证明可以减少背膘厚度[3]。Lu等[6-7]报道，在肉鸡基础饲粮中添加锰可显著降低腹脂率。目前，国内对锰的研究主要集中在家禽上，对家兔的研究还很少，尤其对獭兔的脂肪代谢的研究还不是很明确。因此，本试验旨在通过在饲粮中添加不同水平的锰，研究其对生长獭兔的脂肪组织脂肪代谢的影响，探讨其对生长獭兔脂肪代谢相关基因表达的影响，以期阐明饲粮中锰对生长獭兔脂肪代谢的作用机制。
1 材料与方法 1.1 试验饲粮基础饲粮参照文献[8-9]配制而成，其组成及营养水平见表 1。在基础饲粮中以硫酸锰的形式添加锰配制试验饲粮，试验饲粮中锰的添加水平分别为0(对照)、5、10、20、40 mg/kg。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) |
本试验选取平均体重接近的、健康状况良好的3月龄生长獭兔200只(公母各占1/2)，随机分为5组，每组40个重复，每个重复1只，分别饲喂不同锰添加水平的5种饲粮。试验前将饲养环境彻底清洗消毒，期间保持自然采光和消毒。试验兔单笼饲养，每天08:00和16:00各饲喂1次。每周带兔消毒兔舍1次。预试期7 d，正试期29 d。
1.3 样品采集与制备在饲养试验结束时，每组随机选取8只试验兔，剥离肩部、胃周、肾周脂肪组织，称重后及时放入液氮，随后转移到-80 ℃中保存。
1.4 测定指标与方法 1.4.1 脂肪沉积肩胛、胃周或肾周脂肪沉积率(%)=100×肩胛、胃周或肾周脂肪重/屠宰前的活兔体重。
1.4.2 脂肪组织中脂肪代谢相关基因的表达量脂肪组织中的总RNA采用Trizol法提取，注意提取过程中将离心出的油脂清除。用琼脂糖凝胶电泳和生物分光光度计分别检测RNA的质量和浓度。按照大连宝生物工程有限公司(TaKaRa)的PCR反转录和荧光定量试剂盒操作说明，将RNA反转录成cDNA，然后在美国ABI7500荧光定量PCR仪上进行实时荧光定量PCR，表 2列出了所有引物的序列。试验结果用2-ΔΔCt法分析，以β-肌动蛋白(β-actin)基因作为内参基因校正目的基因的表达量。
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表 2 实时荧光定量PCR所用引物序列 Table 2 Primer sequences of real time-PCR |
数据以平均值和均方根误差表示，采用SAS 9.1.3统计软件进行数据的方差分析，用Duncan氏法进行数据的多重比较，以P < 0.05为差异显著，以0.05≤P < 0.10为有变化趋势。
2 结果与分析 2.1 饲粮锰添加水平对生长獭兔脂肪沉积的影响由表 3可知，与对照组相比，饲粮中添加10~20 mg/kg锰显著降低了肩胛脂肪沉积率(P < 0.05)，饲粮中添加5~40 mg/kg锰显著降低了胃周脂肪沉积率(P < 0.05)。饲粮中锰添加水平对肾周脂肪沉积率没有显著影响(P>0.05)。
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表 3 饲粮锰添加水平对生长獭兔脂肪沉积的影响 Table 3 Effects of dietary Mn supplementation level on fat deposition of growing Rex rabbits (n=40) |
由表 4可知，饲粮中锰的添加水平对肉碱脂酰转移酶2(CPT2)、激素敏感脂酶(HSL)、脂蛋白脂酶(LPL)和过氧化物酶体增殖物激活受体β(PPARβ)基因的表达量没有显著影响(P>0.05)。与对照组相比，饲粮中添加20~40 mg/kg锰显著降低了脂肪酸合成酶(FAS)基因的表达量(P < 0.05)；与对照组相比，饲粮中添加20~40 mg/kg锰显著降低了乙酰辅酶A羧化酶(ACC)基因的表达量(P < 0.05)；与对照组相比，饲粮中添加10~40 mg/kg锰显著提高了肉碱脂酰转移酶1(CPT1)基因的表达量(P < 0.05)；与对照组相比，饲粮中添加10~20 mg/kg锰显著提高过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)基因的表达量(P < 0.05)。
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表 4 饲粮锰添加水平对生长獭兔脂肪代谢相关基因表达的影响 Table 4 Effects of dietary Mn supplementation level on expression of genes related to lipid metabolism of growing Rex rabbits(n=8) |
Sands等[10]的研究表明，饲粮中添加锰可降低肉鸡腹脂沉积率。Lu等[6]研究表明，在断奶母猪饲粮中添加锰可以减少背膘厚度。本试验结果与上述在其他动物上的报道一致。饲粮中添加锰可降低獭兔脂肪沉积率的原因可能与其影响与脂肪代谢相关基因的表达有关。
3.2 饲粮锰添加水平对獭兔脂肪代谢相关基因表达的影响FAS在动物体内脂肪合成途径中起着极其重要的作用，在脂肪的合成过程中可以提供长链脂肪酸[11]。熊文中等[12]试验证实，猪的脂肪组织中FAS活性对胴体的脂肪量和脂肪率有显著的影响。FAS是脂肪酸合成的限速酶[13]。本试验发现，在饲粮中添加20~40 mg/kg锰后显著降低了脂肪组织中FAS基因的表达量，说明饲粮中添加锰之后獭兔的脂肪酸合成受到了抑制。张光磊等[14]研究表明，肥胖小鼠使用ACC抑制剂能够降低小鼠的肥胖程度。ACC在维持整个机体调控脂肪代谢中发挥着必不可少的作用[15]。Abu-Elheiga等[16]研究发现，缺失ACC2基因的小鼠脂肪组织中的脂肪沉积减少。在本试验中发现，饲粮中添加20~40 mg/kg锰显著降低了脂肪组织中ACC基因的表达量，表明ACC基因的表达量的降低减少了獭兔的脂肪沉积。这说明脂肪酸的从头合成过程降低了。CPT1是脂肪酸β-氧化的限速酶[17]。本试验发现，饲粮中添加10~40 mg/kg锰显著提高了CPT1基因的表达量，这说明锰显著提高了脂肪酸的β-氧化过程。CPT是线粒体外膜上的酶，负责将长链脂肪酸转运进入线粒体[18]。CPT1基因表达量的增加，进入线粒体的长链脂肪酸增加，脂肪酸的β-氧化提高，较多的脂肪酸为机体提供了能量。当HSL的基因敲除后，脂肪水解能力遭到破坏，脂质合成和脂肪代谢能力明显下降[19]。在本试验中，饲粮锰的添加对獭兔的HSL基因表达没有显著影响，说明锰对獭兔脂肪沉积的影响不是通过抑制HSL基因的表达来实现的。LPL是调控肉鸡脂肪沉积的关键酶[20]。有试验证明，LPL的水平与脂肪细胞的大小和重量无关[21]。本试验结果表明，锰对獭兔脂肪沉积的影响可能是通过影响脂肪数量来实现的。PPARs是调节脂质代谢的重要转录因子，PPARα和PPARγ属于PPARs超家族成员[22]。PPARα可以调节脂肪酸的摄取、氧化以及运输过程，进而调节脂质代谢[23]。本试验研究表明，饲粮中添加10~20 mg/kg锰显著提高PPARα基因的表达量。这表明锰可以通过影响PPARα基因的表达来降低獭兔的脂肪沉积。PPARα可以调节线粒体膜上的CPT1和CPT2，从而控制脂肪酸在线粒体膜上的转运[24]。由此可以推断，饲粮中添加锰促进了獭兔脂肪的氧化，从而降低了獭兔脂肪沉积。结果表明，饲粮中添加锰降低獭兔的脂肪沉积，是通过抑制脂肪合成和促进脂肪氧化分解共同进行的。
4 结论饲粮中添加锰影响了3~4月龄獭兔的脂肪沉积和脂肪组织脂质代谢。当饲粮中锰添水平为20 mg/kg时，锰通过降低FAS和ACC基因的表达量，提高CPT1和PPARα基因的表达量，导致脂肪的合成受到抑制同时脂肪的分解得到增加，从而降低了獭兔的脂肪沉积。
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