2. 莱阳市农业农村局, 烟台 265200
2. Laiyang Municipal Bureau of Agriculture and Rural Affairs, Yantai 265200, China
随着我国经济的快速增长，人们逐渐意识到为了提高畜禽生产水平而不合理地使用添加剂，不仅降低了动物自身的免疫力，破坏其肠道内微生物的平衡，而且直接影响肉制品的品质。半胱胺(cysteamine，CS)在生物学上来源于半胱氨酸代谢，欧洲药品评估局(EMEA)已将其归为“无需制定最大残留量”的有机物[1]。CS在动物生产中作为生长抑素(SS)的特异性抑制剂来影响内分泌，使生长激素(GH)的分泌增加，提高动物的生长性能[2]。林玲等[3]研究发现，给大鼠口服CS后，大鼠血清、下丘脑、垂体、胃窦黏膜和十二指肠SS含量分别降低39.60%、21.20%、44.00%、81.10%和55.00%，血清GH含量提高107.41%。肉鸡饲粮里添加100、150和200 mg/kg的CS可使其血清SS含量有显著或极显著的降低，并使饲料转化率分别提高5.7%、3.3%和6.3%[4]。杨佳栋[5]研究发现，CS添加量为20 g/(头·d)的西门塔尔杂交公牛血清GH含量有极显著的提高。给泌乳大鼠灌服80 mg/kg的CS，其哺乳期第15天的血清GH含量显著提高[6]。但CS分子中的巯基决定了它的不稳定性，极易被氧化，半胱胺螯合锌(cysteamine chelated zinc，Zn-CS)则克服了这一不足。余成蛟等[7]研究发现，饲粮中添加不同剂量的Zn-CS可极显著提高营养限制型发育迟缓猪的平均日增重，显著降低料重比，极显著降低血清中的SS、胰岛素(INS)含量，极显著提高血清GH含量，极显著改善血清T淋巴细胞转化率，显著提高血清中免疫球蛋白(Ig)A和IgG含量，提高其免疫性能，并显著降低粪便中大肠杆菌数量，改善胃肠道微生物环境。蒋志疆等[8]在基础饲粮中添加500 mg/kg的Zn-CS，发现试验组日增重显著提高11.07%，料重比显著降低6.40%。然而，目前有关Zn-CS对育肥猪免疫与抗氧化能力和肠道微生物的影响及其在育肥猪饲粮中最适添加量的研究鲜有报道。因此，本试验旨在研究不同添加量的Zn-CS对育肥猪免疫性能、抗氧化能力、血清生化指标及肠道微生物的影响，旨在为育肥猪饲喂Zn-CS以提高生长性能提供科学依据。
1 材料与方法 1.1 试验设计选择90头体况良好、体重为(64.67±1.15) kg的杜×长×大三元杂交猪，随机分为5组，每组3个重复，每个重复(圈)6头。对照组饲喂不添加Zn-CS的基础饲粮，试验组分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组，分别饲喂在基础饲粮中添加60、90、120、150 mg/kg Zn-CS的试验饲粮，其中Zn含量分别为24、36、48、60 mg/kg。
1.2 基础饲粮基础饲粮为玉米-豆粕型，参照《猪饲养标准》(NY/T 65—2004)配制，其组成及营养水平见表 1。所添加Zn-CS购自上海旭牧联生物科技有限公司。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) |
试验猪饲喂粉料，自由采食和饮水，试验开始前按照猪场常规程序进行消毒、驱虫和免疫。栏舍每天清扫1次，保持圈舍卫生，每天观察猪群健康状况。预试期为7 d，正试期为60 d。
1.4 样品采集试验结束时每个重复随机抽取1头猪，采用前腔静脉采血的方法采血5 mL，静置l~2 h后，用离心机3 000 r/min离心5 min，分离血清分装于干净离心管中并做标记，放入-20 ℃冰箱保存备测。
试验结束时，取各个重复猪只的盲肠内容物分别放于2个干净冻存管中并做标记，马上将其放到液氮罐中，而后转移到-80 ℃冰箱保存以备检测。
1.5 检测指标 1.5.1 免疫性能指标血清IgA、IgG、IgM、总蛋白(TP)的含量均使用试剂盒测定，试剂盒购自南京建成生物工程研究所，具体步骤按照说明书进行。
1.5.2 抗氧化能力指标血清谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量和总抗氧化能力(T-AOC)均使用试剂盒测定，试剂盒购自南京建成生物工程研究所，具体步骤按照说明书进行。
1.5.3 血清生化指标血清GH、SS、三碘甲状腺原氨酸(T3)、胃泌素(GAS)、尿素氮(UN)、甲状腺素(T4)、INS含量均使用试剂盒测定，试剂盒购自南京建成生物工程研究所，具体步骤按照说明书进行。
1.5.4 肠道微生物盲肠内容物送至北京诺禾致源科技股份有限公司检测，采用高通量测序技术(Illumina)，以得到有效数据(clean data)，在clean data的基础上进行操作分类单元(OTUs)聚类以及物种分类的分析。依照OTUs聚类结果，对各OTU序列进行物种的注释，获取相对应的物种信息和以物种的丰度为基础的分布状况。同时，计算OTUs丰度、alpha多样性，以得到各样本内物种丰富度信息等。
依照对物种进行注释的结果，统计各组在各分类水平上最大丰度排名前10位的物种，对育肥猪肠道菌群进行物种丰富度的统计，并计算出相对丰度。
1.6 数据统计分析试验数据用Excel 2016初步整理，后采用SPSS 22.0统计软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan氏法多重比较，P < 0.05表示差异显著，所有结果均以平均值±标准差表示。
2 结果与分析 2.1 Zn-CS对育肥猪免疫性能的影响由表 2可知，Ⅰ、Ⅱ组血清IgA含量显著高于对照组(P < 0.05)，分别提高了12.37%、14.43%，Ⅲ、Ⅳ组与对照组相比差异不显著(P>0.05)。Ⅲ组血清IgG含量显著高于对照组(P < 0.05)，提高了8.55%，Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ组与对照组相比差异均不显著(P>0.05)，其中Ⅲ组比Ⅳ组显著提高了7.96%(P < 0.05)。4个试验组血清IgM和TP含量与对照组相比差异均不显著(P>0.05)。
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表 2 Zn-CS对育肥猪血清免疫指标的影响 Table 2 Effects of Zn-CS on serum immune indexes of finishing pigs |
由表 3可知，试验组血清GSH-Px和SOD活性与对照组相比差异均不显著(P>0.05)。Ⅲ、Ⅳ组血清MDA含量比对照组分别显著降低了5.07%、5.46%(P < 0.05)。Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组血清总抗氧化能力比对照组分别显著提高了6.79%、7.34%、7.34%(P < 0.05)，Ⅰ组与对照组相比差异不显著(P>0.05)，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组分别比Ⅰ组显著提高了4.80%、5.33%、5.33%(P < 0.05)。
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表 3 Zn-CS对育肥猪血清抗氧化指标的影响 Table 3 Effects of Zn-CS on serum antioxidant indexes of finishing pigs |
由表 4可知，Ⅱ组血清GH和SS含量与对照组相比分别显著升高和降低了8.97%、6.45%(P < 0.05)，Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ组与对照组相比均无显著差异(P>0.05)。Ⅱ、Ⅲ组血清T3含量比对照组分别显著提高了23.08%、22.56%(P < 0.05)，4个试验组间差异均不显著(P>0.05)。各试验组血清T4和GAS含量与对照组相比差异均不显著(P>0.05)。Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组血清INS含量比对照组分别显著提高了14.56%、13.54%、12.52%(P < 0.05)。Ⅱ、Ⅲ组血清UN含量比对照组分别显著降低了9.09%、9.86%(P < 0.05)，Ⅰ、Ⅳ组与对照组相比差异均不显著(P>0.05)，4个试验组间无显著差异(P>0.05)。
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表 4 Zn-CS对育肥猪血清生化指标的影响 Table 4 Effects of Zn-CS on serum biochemical indexes of finishing pigs |
由表 5可知，各试验组香农指数、辛普森指数、Chao1指数、ACE指数和覆盖度与对照组相比差异均不显著(P>0.05)。
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表 5 盲肠内容物中微生物多样性指数 Table 5 Microbial diversity indexes in cecum digesta |
由表 6可知，各组在门水平上相对丰度超过1%的优势菌群有厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)，累计相对丰度达到97%以上，其中Ⅲ组厚壁菌门的相对丰度与对照组相比升高了2.88%，变形菌门的相对丰度与对照组相比降低了2.98%，但差异均不显著(P>0.05)。各组在属水平上相对丰度超过1%的优势菌属有梭菌属(Clostridium)、肠杆菌属(Enterobacteriaceae)、Romboutsia、Turicibacter、Terrisporobacter、放线菌属(Actinobacillus)，各菌属相对丰度4个试验组与对照组相比差异均不显著(P>0.05)。
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表 6 门与属水平相对丰度分析结果 Table 6 Phylum and genus level relative abundance analysis results |
CS可以影响激素分泌从而提高畜禽机体的免疫力。血清TP含量的高低会反映动物机体免疫力的强弱，进而对动物营养物质的吸收利用率产生影响。血清球蛋白含量能从侧面体现畜禽体内的抗体水平，也能体现机体免疫能力的高低。朱宇旌等[9]研究发现，Zn-CS可显著提高仔猪血清IgA及IgG含量，而对血清IgM及TP含量影响不显著。余成蛟等[7]研究发现，不同添加水平的Zn-CS均可不同程度地提高营养限制性发育迟缓猪血清IgA、IgG及TP含量，而对血清IgM含量影响不显著。本试验中，60及90 mg/kg的Zn-CS可显著提高血清IgA含量，120 mg/kg的Zn-CS可显著提高血清IgG含量，所得结果与余成蛟等[7]的研究结果基本一致，而与孙海元[10]在长大二元杂交育肥猪饲粮中添加300 mg/kg的CS有提高血清IgG含量的趋势，对血清IgA及TP含量影响不显著的结果有出入，或许是由于猪品种、添加量等差异所导致。
3.2 Zn-CS对育肥猪抗氧化能力的影响氧化应激过程可以在细胞中产生过多的活性氧原子，导致动物体细胞内氧化还原电位和细胞损伤的不平衡[11]。抗氧化系统不仅可以防止脂质和蛋白质氧化引起的损伤，还可以保持肠道屏障完整性，防止细菌感染[12-13]。Gu等[14]的研究表明，饲粮中补充CS可以减少小鼠消化过程中的过氧化应激。同时，添加CS可通过降低血清MDA含量，增加脑内谷胱甘肽(GSH)和GSH-Px活性来减轻大鼠试验性蛛网膜下腔出血模型的氧化应激[15]。成廷水等[16]研究发现，氨基酸锌能够显著提高蛋鸡肝组织的T-AOC和GSH-Px的活性，降低血清MDA含量，脾中SOD活性也有显著提高。本试验中120及150 mg/kg的Zn-CS能够显著降低血清MDA含量，90、120及150 mg/kg的Zn-CS都能够显著提高血清T-AOC，这与刘贵莲[17]在PIC肥育猪饲粮中添加CS可显著提高血清T-AOC的结果类似。此外，CS可以破坏胱氨酸中的二硫键，导致半胱氨酸(GSH合成的底物)的形成，从而增加细胞GSH水平[18]。
3.3 Zn-CS对育肥猪血清生化指标的影响CS分子中含有的巯基以及氨基等活性基团能够损害SS的二硫键从而降低SS含量，而GH分别通过生长激素释放激素(GHRH)促进作用或SS抑制作用特异性地刺激释放[19]。徐雪松[20]研究发现，添加120及200 mg/kg的CS可显著降低45日龄仔猪血清SS含量，极显著提高血清GH含量，显著提高血清T3及T4含量。王恩秀等[21]研究发现，给大鼠口服CS后，血清SS含量显著降低，血清GH含量极显著升高，而血清INS及T3含量略有提高。刘皙洁等[22]研究发现，给雄性香猪灌注80 mg/kg CS后，血清SS含量显著降低，血清GAS含量显著升高，与陈安国等[23]研究结果相似。张献新等[24]研究发现，120 mg/kg半胱胺盐酸盐可显著提高育肥猪血清GH及T3含量，从而使试验组平均日增重比对照组提高5.09%，料重比降低3.19%，提高肥育猪的生长性能。本试验结果显示，饲粮中添加90、120及150 mg/kg的Zn-CS可显著提高育肥猪血清中的INS含量，其原因在于哺乳动物中CS能够促进胰岛β细胞INS的释放[25]。90、120 mg/kg的Zn-CS还能够显著提高血清GH及T3含量，降低血清SS及UN含量，从而利于蛋白质的合成，与余成蛟等[7]研究结果类似。
3.4 Zn-CS对育肥猪肠道微生物的影响研究表明，肠道微生物群的组成不是呈静态的，而是随时间变化并最终形成一个稳定的状态[26]。许多因素促成了演替过程，除了当肠道转变为厌氧环境时肠道中发生的生理变化外，饲粮的消耗是另一个导致微生物群特有的细菌组合转变的主要因素。朱伟云等[27]研究指出，厚壁菌门、拟杆菌门与变形菌门是生长肥育猪肠道微生物群中最丰富的门，与本试验所得结果一致。厚壁菌门能够促进碳水化合物和蛋白质的有效吸收，并富含与营养转运蛋白相关的基因[28-29]，而变形菌及其相关菌属丰度的增加，则会使机体内毒素含量增加，从而导致疾病的发生[30]。朱宇旌等[9]在仔猪饲粮中添加Zn-CS，发现粪便中大肠杆菌的数量显著降低，起到抗菌和减少腹泻的作用，从而提高其生长性能。本试验结果显示，饲粮中添加120 mg/kg的Zn-CS能够增加肠道中有益菌厚壁菌门的相对丰度，降低有害菌变形菌门的相对丰度，但对育肥猪肠道微生物区系结构无显著影响。
4 结论① 在本试验条件下，饲粮中添加Zn-CS能够通过提高血清免疫球蛋白含量来提高育肥猪的免疫力，还可以通过提高血清T-AOC及降低MDA含量来改善育肥猪抗氧化能力。
② 在本试验条件下，饲粮中添加Zn-CS对育肥猪肠道微生物结构多样性及菌群相对丰度均无显著影响。
③ 综合各项指标，建议育肥猪饲粮中Zn-CS的适宜添加量为120 mg/kg。
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