白酒糟是白酒酿造工业的副产物，据统计，每年我国白酒糟产量高达3 000万t，量大、集中而且营养丰富[1]。目前，白酒糟常作为饲料原料使用到反刍动物饲粮中，但因其含酸量较高，长期饲喂或饲喂过量易造成瘤胃酸中毒[2]。研究发现，在酒糟饲粮中加入小麦秸可维持瘤胃内pH，减少因高酸含量而产生的问题[3]；粗饲料中含有丰富的粗纤维，能增加反刍动物咀嚼时间，促进唾液分泌，降低瘤胃内pH[4]。稻草是我国南方的主要农作物，年产量可达2亿t；燕麦干草是我国北方高海拔冷凉地区的重要饲草，年产量可达280万t[5]。在我国西南地区，尤其是白酒金三角地区，由于缺乏优质粗饲料，往往用酒糟搭配稻草作为粗饲料，形成酒糟饲粮饲喂肉牛；在凉寒地区，陆续出现干酒糟和燕麦草搭配饲喂。因此，目前生产上存在酒糟搭配粗饲料饲喂肉牛的现状。国外也有学者将酒糟搭配苜蓿作为肉牛饲粮使用[6]。近年来，越来越多的学者开始研究通过对不同种类的饲料进行合理配比，充分激发饲料间产生正组合效应，提高粗饲料利用率。
Sun等[7]通过体外产气法研究发现，将稻草与苜蓿干草以20 : 80的比例组合发酵时，会出现最高的正组合效应。Liu等[8]研究表明，稻草与牧草、桑叶以不同比例混合发酵，其12~96 h的产气量(GP)均产生正组合效应。其他学者也研究表明，不同粗饲料间，以及粗饲料与精料组合可以通过体外产气法评价组合效应[9-10]。Gill等[11]通过饲喂高粱酒糟以及高粱酒糟与苜蓿混合物发现，饲喂高粱酒糟与苜蓿混合物的肉牛肉质显著高于单独饲喂高粱酒糟的肉牛。
白酒糟、稻草、燕麦干草是养牛生产中常用的粗饲料，但其组合效应还少有研究报道。因此，本次试验目的是通过体外产气法，探究不同来源和不同产品形式的白酒糟与稻草、燕麦干草间的组合效应及对酒糟型饲粮体外发酵参数的影响，为科学利用区域性饲料资源提供试验数据。
1 材料与方法 1.1 试验材料浓香型湿酒糟(Luzhou flavor wet distiller’s grains，LFWDG)产地：四川邛崃；原料组成：高粱、大米、小麦、稻壳(作为填充剂)等；酿酒工艺：经过中温曲发酵35~50 d。酱香型湿酒糟(Maotai flavor wet distiller’s grains，MFWDG)产地：四川邛崃；原料组成：高粱、大米、小麦等；酿酒工艺：经过高温曲发酵3~5年。酱香型发酵酒糟(Maotai flavor fermented distiller’s grains，MFFDG)产地：四川古蔺；原料组成：高粱、大米、小麦等；酿酒工艺：以酱香型白酒糟为主要原料，采用酵母菌等菌种经过3个发酵阶段发酵。浓香型干酒糟(Luzhou flavor dried distiller’s grains，LFDDG)产地：四川宜宾；原料组成：高粱、大米、小麦、稻壳(作为填充剂)等；酿酒工艺：以浓香型湿酒糟为原料，再经干燥粉碎。稻草产地：四川雅安；燕麦干草产地：黑龙江。
按四分法从所采集的样品中各取500 g在65 ℃条件下烘干，粉碎过40目筛，至于干燥处备用。待测常规营养成分含量(表 1)：水分与干物质(DM)含量采用直接烘干法测定；粗蛋白质(CP)含量根据GB/T 6432—1994的凯氏定氮法测定；中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维(ADF)含量采用Van Soest等[12]的方法测定；粗纤维(CF)含量根据GB/T 6434—2006的过滤法测定；粗灰分(Ash)含量根据GB/T 6438—2007的马福炉灰化法测定；钙(Ca)含量根据GB/T 6436—2002的高锰酸钾法测定；磷(P)含量根据GB/T 6437—2002的钼黄比色法测定。
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表 1 不同粗饲料的营养成分(干物质基础) Table 1 Nutrient composition of different roughages (DM basis) |
选择健康状况良好、年龄和体重相近的荷斯坦奶公牛3头为瘤胃液供体，饲粮配方参照NRC(2000)进行配制，其组成及营养水平见表 2。试验牛采用单栏饲养方式，09:00和16:00各饲喂1次，自由饮水，定期驱虫消毒。
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表 2 饲粮组成及营养水平(干物质基础) Table 2 Composition and nutrient levels of the diet (DM basis) |
本试验采用单因素试验设计，将稻草分别与酱香型发酵酒糟、浓香型干酒糟、浓香型湿酒糟、酱香型湿酒糟以0 : 100、25 : 75、50 : 50、75 : 25、100 : 0的比例组合(在干物质基础上组合)，再将燕麦干草分别与4种白酒糟按以上比例组合，每种组合6个重复，进行体外产气试验。
筛选出4种白酒糟与2种干草间的最佳组合后，再将最佳组合与相同精料混合(精粗比6 : 4)进行体外产气试验。
1.4 体外培养试验 1.4.1 瘤胃液的采集于晨饲前，试验牛绑定后，将真空泵管通过试验牛食管插入胃内，抽取足够的瘤胃液，4层纱布过滤到提前预热39 ℃并已通入二氧化碳(CO2)的保温瓶中，立即封严瓶口，返回实验室，将瘤胃液与预热到39 ℃的缓冲液以1 : 2的比例混合。
1.4.2 体外发酵参考Menke等[13]的方法配制培养液及进行体外产气试验。预先在每根发酵管(国产100 mL注射器)中称入0.3 g样品，在活塞处涂抹适量凡士林起到润滑和防止漏气的作用。迅速将30 mL混合液分装到发酵管中，排尽管内空气，记录初始刻度，放入(39.0±0.5) ℃的恒温水浴摇床中开始培养。试验设1个空白组，即无底物的混合液，在培养开始后的48 h记录GP。在48 h时，迅速将发酵管放入冷水浴中终止发酵，测定pH后取培养液分装于5只10 mL的离心管中，用于微生物蛋白(MCP)含量的测定。待得出最佳组合后，将精料与最佳组合按6 : 4的比例混合进行体外产气试验，试验步骤同上，同时利用集气袋收集48 h气体，用于气体成分测定，收集48 h发酵液，用于MCP、氨态氮(NH3-N)、挥发性脂肪酸(VFA)含量的测定。
1.5 测定指标与方法 1.5.1 pH的测定采用雷磁25型高精度pH酸度计测定pH，取3次测定结果的平均值。
1.5.2 GP的测定根据以下公式计算每个时间点的GP：
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式中：GPt为样品在t时刻的产气量(mL)；Vt为样品发酵t h后，培养管刻度读数；V0为对应时间空白培养管刻度读数；w为样品干物质重(mg)。
1.5.3 MCP含量的测定使用南京建成生物工程研究所BCA法蛋白定量试剂盒测定发酵液中MCP的含量，具体步骤按照说明书并参考文献[14]进行。
1.5.4 VFA含量的测定使用气相色谱仪(CP-3800)测定VFA含量。色谱柱为4 mm(内)×2 m玻璃柱，内部充满物质为3%游离脂肪酸相(FFAP)。柱温为140 ℃，汽化室温度为200 ℃，氢火焰检测器(FID)温度为180 ℃。载气使用氮气，流速为40 mL/min；氢气流速为50 mL/min；氧气流速为50 mL/min；样品进样量为1 μL。测定指标包括发酵液中乙酸、丙酸、丁酸含量及乙酸/丙酸；总挥发性脂肪酸(TVFA)含量为乙酸、丙酸、丁酸含量之和。
1.5.5 NH3-N含量的测定使用碱性次氯酸钠-苯酚分光光度计法测定NH3-N含量，具体步骤参照Broderick等[15]。
1.5.6 气体成分的测定利用气相色谱仪(福立GC9790Ⅱ)测定48 h气体中甲烷(CH4)、CO2的浓度。测定条件：载气为氩气，气体流量为20 mL/min，进样量为0.5 mL；热导检测器(TCD)，柱子型号：TDX-01(1 m×1/8), 柱箱温度为80 ℃，检测器温度为120 ℃，进样口温度为120 ℃。
1.5.7 组合效应值计算方法根据以下公式计算48 h产气量单项组合效应指数(SFAEI)：
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试验数据经Excel 2017整理后，用SPSS 22.0统计软件进行one-way ANOVA方差分析并以Duncan氏法进行多重比较，P＜0.05为差异显著，P>0.05为差异不显著。
2 结果与分析 2.1 各组合体外发酵48 h累积GP结果比较由表 3可知，随着酱香型发酵酒糟和浓香型湿酒糟所占比例的增加，酱香型发酵酒糟：稻草和浓香型湿酒糟：稻草的48 h累积GP显著降低(P < 0.05)，随着浓香型干酒糟和酱香型湿酒糟所占比例的增加，浓香型干酒糟：稻草和酱香型湿酒糟：稻草的累积48 h GP显著升高(P < 0.05)；在与燕麦干草的组合中，48 h累积GP均随着4种白酒糟所占比例的升高而显著降低(P < 0.05)。当4种白酒糟与燕麦干草以25 : 75、50 : 50、75 : 25的比例组合时，其48 h累积GP均显著高于与稻草的组合(P < 0.05)，2种干草与浓香型干酒糟和酱香型湿酒糟组合的48 h累积GP优于与酱香型发酵酒糟和浓香型湿酒糟的组合。
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表 3 各组合体外发酵48 h累积产气量 Table 3 Cumulative gas production at 48 h fermentation in vitro of each combination |
由表 4可知，各组合的pH在6.52~6.76。在酱香型发酵酒糟、酱香型湿酒糟与稻草、燕麦干草的组合中，随着2种白酒糟所占比例的升高，MCP含量显著升高(P < 0.05)；在浓香型干酒糟与稻草组合中，随着浓香型干酒糟所占比例的升高，MCP含量显著降低(P < 0.05)；在浓香型湿酒糟与稻草、燕麦干草的组合中，浓香型湿酒糟：燕麦干草的MCP含量随着浓香型湿酒糟比例的升高而显著降低(P < 0.05)，与稻草组合的MCP含量差异不显著(P>0.05)。
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表 4 各组合体外发酵48 h的MCP含量和pH Table 4 MCP content and pH at 48 h fermentation in vitro of each combination |
由表 5可知，酱香型发酵酒糟与稻草组合的SFAEI随着酱香型发酵酒糟含量的增加由负变正，与燕麦干草组合均产生正组合效应；在与浓香型干酒糟组合中，除浓香型干酒糟:燕麦干草=25 : 75外，其余组合均产生正组合效应；浓香型湿酒糟与稻草组合均产生负组合效应，但与燕麦干草组合随着浓香型湿酒糟含量的增加，产生正组合效应；酱香型湿酒糟与燕麦干草组合均产生正组合效应，但与稻草组合当酱香型湿酒糟含量为25%时，产生正组合效应。综上所述，最佳组合及SFAEI为：酱香型发酵酒糟:燕麦干草=25 : 75、SFAEI=11.48，浓香型干酒糟:燕麦干草=25 : 75、SFAEI=3.95，浓香型湿酒糟:燕麦干草=50 : 50、SFAEI=6.70，酱香型湿酒糟:燕麦干草=25 : 75、SFAEI=6.47。
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表 5 各组合体外发酵48 h产气量SFAEI Table 5 SFAEI of gas production at 48 h fermentation in vitro of each combination |
由表 6可知，Ⅲ组48 h累积GP显著低于其他3组(P < 0.05)。各间pH、MCP含量差异不显著(P>0.05)。在气体成分中，Ⅰ组CH4和CO2产量显著低于Ⅲ、Ⅳ组(P < 0.05)，且Ⅳ组CO2产量最高。Ⅱ组NH3-N含量显著低于其他3个组(P < 0.05)。在VFA含量的结果中，Ⅰ、Ⅱ组的TVFA含量显著高于Ⅲ、Ⅳ组(P < 0.05)。Ⅲ组乙酸/TVFA显著低于其他3组(P < 0.05)，丁酸/TVFA显著高于其他3组(P < 0.05)，各组间丙酸/TVFA、乙酸/丙酸差异不显著(P>0.05)。
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表 6 最佳组合比例与精料混合体外发酵结果 Table 6 In vitro fermentation results of optimum combination proportion and concentrate mixtures |
GP的大小取决于发酵底物中非结构性碳水化合物的多少，饲粮中的非结构性碳水化合物越多，GP就越大。研究表明，通过体外法的GP和化学成分结合估计的消化率与体内法的消化率高度相关，且体外发酵GP与饲粮在体内的消化率呈正相关[16]。本试验结果中，燕麦干草48 h累积GP显著高于稻草, 且燕麦干草与白酒糟组合48 h累积GP也优于稻草与白酒糟的组合，这是由于燕麦干草所含易发酵的碳水化合物较多，发酵速度快，在瘤胃中的降解速度高于稻草，随之GP也升高，与张毕阳等[17]的研究结果一致。同时，酱香型湿酒糟、浓香型干酒糟与稻草、燕麦干草组合的48 h累积GP优于浓香型湿酒糟与2种干草的组合，也是由于其营养价值更高[18]。试验发现，不管是酱香型发酵酒糟的单个体外48 h累积GP或是组合48 h累积GP，均低于其他组合，这可能是由于酱香型发酵酒糟含有较高的粗蛋白质，Cone等[19]通过对比淀粉与酪蛋白的体外GP发现，粗蛋白质体外发酵GP仅为淀粉的30%，因此48 h累积GP随着酱香型发酵酒糟比例的升高而逐渐降低。张一帆等[20]通过分析GP与营养物质相关性得知，GP与粗蛋白质含量呈极显著负相关。
3.2 体外发酵pH及MCP含量瘤胃pH是瘤胃代谢情况的重要反映指标，本次试验结果各组合体外发酵pH在6.52~6.76，均在瘤胃正常发酵时的pH范围(6.2~7.0)内，当pH低于这一范围瘤胃纤维分解菌会受到抑制[21]。在2种酱香型白酒糟与稻草、燕麦干草组合的MCP含量结果中，随着2种酒糟所占比例的升高，其MCP含量显著升高，是由于在逐渐增加2种白酒糟比例的同时，也为底物增加了可溶性碳源、易降解氮源的数量，利于微生物对纤维类物质的吸附，瘤胃微生物增殖加快，因此MCP含量增加[22]。Nocek等[23]也研究发现，饲粮中含大量的易发酵粗蛋白质和碳水化合物能显著提高MCP含量。
3.3 SFAEI组合效应发生的机制受到饲粮类型和营养水平的影响，且低质粗饲料与精饲料或优质牧草间更容易发生正组合效应[14]。试验发现，2种酱香型白酒糟与稻草、燕麦干草组合均能产生较多的正组合效应，说明其组合后饲料利用效率更高，可能是由于酱香型白酒糟含有较高的粗蛋白质。有研究表明，在低质粗饲料中补充蛋白质饲料能提高饲料的消化率，将甜高粱与苜蓿组合发酵发现，其在消化率上产生了正组合效应[24]，与本次试验结果相似。Caton等[25]研究表明，牧草补饲少量玉米和豆粕后，在消化率上产生了正组合效应。本试验发现，浓香型干酒糟和浓香型湿酒糟与稻草组合后均产生负组合效应，可能是由于浓香型白酒糟粗蛋白质含量较低，同时稻草含有很高的粗纤维，2种低质饲料组合易产生负组合效应。Maccarana等[26]将奶蓟草和番茄皮组合发酵发现，在GP上产生了负组合效应。
3.4 最佳组合与精料混合发酵国内外研究结果表明，反刍动物CH4产量与饲粮采食水平、精粗比、碳水化合物类型有关，而精粗比中的纤维成分起重要作用，通过瘤胃发酵作用植物纤维被分解成VFA，随后又经过微生物作用产生CH4。在此次研究结果中，2种干酒糟组的CH4产量显著低于2种湿酒糟组，是因为2种干酒糟中含有较低的纤维，这与前人研究发现CH4排放量与纤维素、半纤维素、NDF、ADF的摄入量呈显著正相关的结果[27-28]相似。反刍动物采食任何饲粮，瘤胃内乙酸的含量都是最高的，乙酸、丙酸、丁酸占TVFA的比例分别是50%~65%、18%~25%、12%~20%，因此在正常情况下，乙酸/丙酸在2.0~3.6[29], 本研究结果在此范围内。在此次试验中，各组NH3-N含量在27.90~29.55 mg/dL，均在Illius等[30]研究报道的瘤胃NH3-N正常浓度范围(6~30 mg/dL)；但4个组中的NH3-N含量均接近30 mg/dL，可能是由于随着发酵时间的延长，发酵产物积累过多且无法移出，使氨在发酵管内积累造成的[31]。
4 结论① 4种白酒糟与稻草、燕麦干草组合均能产生正组合效应，且与燕麦干草的组合效应优于与稻草的组合，最佳组合比例为：酱香型发酵酒糟:燕麦干草=25 : 75、浓香型干酒糟:燕麦干草=25 : 75、浓香型湿酒糟:燕麦干草=50 : 50、酱香型湿酒糟:燕麦干草=25 : 75。
② 发酵酒糟饲粮产CH4、CO2最低，干酒糟饲粮48 h累积GP高于湿酒糟饲粮，且高比例的湿酒糟饲粮TVFA含量最低。
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