全株玉米青贮具有生物学产量高、营养价值高、适口性好、贮藏时间长等优点，是反刍动物生产中重要的粗饲料来源^[1]。全株玉米青贮的制作质量直接关系到反刍动物的健康、生产性能以及养殖场的经济效益，如何生产优质全株玉米青贮是养殖业普遍关注的问题^[2]。提升青贮饲料的发酵品质是生产优质全株玉米青贮的重要环节，尽管青贮发酵是一个复杂的微生物活动和生物化学变化过程，但可以在青贮过程中加入青贮添加剂进行调控，青贮添加剂已被作为一种提升青贮饲料发酵品质、营养价值和动物适口性的有效手段^[3]。

青贮饲料添加剂的种类较多，根据其功能可分为4类：发酵促进剂、发酵抑制剂、好氧性腐败菌抑制剂和营养性添加剂^[4]。国内外有关青贮添加剂的研究主要集中于乳酸菌复合制剂、纤维素酶、有机酸及其对应的盐类等。乳酸菌复合制剂综合了同型和异型发酵乳酸菌的优势，在发酵前期，同型发酵乳酸菌快速产生大量乳酸并降低青贮pH，有效抑制有害菌的生长，进而降低干物质损失^[5]；在发酵后期，异型发酵乳酸菌发酵产生的乙酸可提升青贮饲料有氧稳定性，防止二次发酵^[6]。纤维素酶一方面可水解植物细胞壁为单糖，增加乳酸菌发酵底物，另一方面可改变植物的纤维素结构并降低纤维含量，改善青贮饲料适口性的同时，提高其消化率^[7]。甲酸、乙酸及丙酸等有机酸能够直接酸化青贮饲料，迅速降低pH，抑制好氧微生物的活力和不良微生物的生长，防止青贮饲料的腐败，有利于保存饲料营养价值^[8]。苯甲酸、山梨酸及其盐类可抑制青贮中梭菌和酵母菌的生长，降低pH及氨态氮和丁酸浓度，提升青贮发酵品质^[9]。尽管国内外有关青贮添加剂的研究已经十分广泛和深入，但多数研究只是针对单一或2种添加剂进行研究，关于多种青贮添加剂比较的研究较少。因此，本研究在前人研究的基础上，探讨不同青贮添加剂(乳酸菌、有机酸、有机酸盐、纤维素酶)对全株玉米青贮营养价值、发酵品质和瘤胃降解率的影响，以期为青贮添加剂的合理选择和使用提供数据支持。

1 材料与方法 1.1 试验材料

青贮原料为来自山东省阳信县河流镇蜡熟期刈割的全株玉米(登海605)，全株玉米青贮前营养成分见表 1。乳酸菌制剂主要成分为戊糖片球菌、屎肠球菌、植物乳杆菌和布氏乳杆菌，乳酸菌含量为5×10¹⁰ CFU/g。甲酸、乙酸、丙酸、苯甲酸钠和山梨酸钾均为实验室用分析纯试剂，购自国药集团化学试剂有限公司。纤维素酶(绿色木酶，又称1, 4-β-D-葡聚糖葡糖苷水解酶，活性为400 000 U/g)购自上海源叶生物科技有限公司。聚乙烯单向呼吸阀厌氧袋(22 cm×40 cm)购自平阳胜光实业有限公司。

1.2 试验设计

全株玉米用粉碎机切短至1~2 cm，混合均匀后备用。试验共设5个组，分别为对照组(不添加任何青贮添加剂)、乳酸菌组(添加5×10⁵ CFU/g乳酸菌制剂)、有机酸组(甲酸、乙酸和丙酸按照7 : 1 : 2的体积比进行混合，添加量为4 mL/kg)、有机酸盐组(苯甲酸钠和山梨酸钾按照1 : 1的质量比进行混合，添加量为2 g/kg)和纤维素酶组(添加50 mg/kg纤维素酶)，添加剂的添加量均以青贮鲜重为基础，每组4个重复。各组混合均匀后，称取约1 kg样品于聚乙烯厌氧袋中，真空密封，于室温避光发酵45 d后开袋取样，随后开展相关指标的测定。

1.3 指标测定 1.3.1 常规营养成分指标

全株玉米青贮前和开袋后分别取约500 g样品，在65 ℃烘箱(DHG-9053A型)中烘干48 h，采用粉碎机(Tecator 1093，瑞典)粉碎至1 mm待测。干物质(DM)、粗灰分(Ash)、粗蛋白质(CP)和粗脂肪(EE)含量参照AOAC(2005)^[10]方法进行测定，其中DM含量采用重量法测定，Ash含量含量采用灰化法测定，CP含量采用凯氏定氮法测定，EE含量采用索氏浸提法(乙醚浸出法)测定。钙(Ca)含量参照GB/T 6436—2018^[11]，采用高锰酸钾法测定。磷(P)含量参照GB/T 6437—2018^[12]，采用分光光度法测定。中性洗涤纤维(NDF)、酸性洗涤纤维(ADF)和酸性洗涤木质素(ADL)含量参照Van Soest等^[13]的方法，采用Ringbio纤维分析仪(R-2000，英国)测定。水溶性碳水化合物(WSC)含量参照蒽酮-硫酸比色法^[14]，采用分光光度计(Alpha-1506，上海)进行测定。淀粉(Starch)含量采用高氯酸水解-蒽酮比色法^[15]测定。相对饲喂价值(RFV)根据公式^[16]进行计算：

式中：DMI为干物质采食量；BW为体重；DDM为可消化干物质。

1.3.2 碳水化合物组分指标

碳水化合物组分剖分参照NRC(2016)^[17]的方法，各组分计算公式如下：

1.3.3 预测能值指标

总可消化养分(TDN)根据Weiss等^[18]的方法计算，计算公式如下：

式中：NDFn为无氮中性洗涤纤维[NDFn=NDF-中洗不溶蛋白(NDICP)]；各组分的单位均为%DM。

消化能(DE)、代谢能(ME)、维持净能(NE_m)和增重净能(NE_g)参照NRC(2016)^[17]，在TDN基础上进行计算，公式如下：

泌乳净能(NE_L)根据Undersander^[19]的方法进行计算，公式如下：

1.3.4 发酵指标

称取25 g新鲜青贮样品，置于榨汁机(HR2027，飞利浦)中，加入250 mL无菌蒸馏水，间歇榨汁搅拌5~6次，每次5 s。用4层纱布过滤上清液至三角瓶中，混匀，立即使用pH计(HANNA HI 9125，意大利)测定pH，随后使用0.1 mol/L HCl滴定至pH为3.0，然后用0.1 mol/L NaOH滴定至pH为10.0，缓冲力(BC)按照pH每变化0.5个单位所消耗0.1 mol/L NaOH的体积进行计算；另取滤液于-20 ℃冰箱保存，用于后续测定挥发性脂肪酸(VFA)、乳酸和氨态氮(NH₃-N)含量。VFA含量采用气相色谱法^[20]测定；乳酸含量采用对羟基联苯比色法^[21]测定；NH₃-N含量采用苯酚-次氯酸钠比色法^[22]测定。参照王国艮^[23]的方法计算发酵系数(fermentation coefficient，FC)和费氏评分(Fleig score，FS)，公式如下：

1.3.5 瘤胃降解率指标

选用3头体况良好、体重(550±50) kg、安装永久性瘤胃瘘管的荷斯坦奶牛，试验饲粮组成(DM基础)为：玉米24.1%、麸皮12.3%、豆粕11.6%、苜蓿14.4%、羊草11.2%、全株玉米青贮24.4%、预混料2%；营养水平为：CP 15.03%、NDF 38.13%、ADF 20.15%、NE_L 6.49 MJ/kg，每天于06:00和18:00进行饲喂，全天自由饮水。采用尼龙袋法^[24]测定青贮饲料24和48 h的干物质降解率(DMD)和中性洗涤纤维降解率(NDFD)。尼龙袋规格为12 cm×6 cm，孔径为50 μm，称量3 g左右青贮样品装入尼龙袋中，每个样品每个时间点每头牛设置4个重复，尼龙袋取出后，使用自来水冲洗干净，在65 ℃烘箱中烘干48 h，采用粉碎机粉碎至1 mm，后续测定DM和NDF含量，计算降解率，公式如下：

1.3.6 营养价值综合评价

采用模糊数学隶属函数法^[25]对青贮营养价值进行综合评价，如果测定的指标与青贮的营养价值呈正相关，计算公式如下：

如果为负相关，则用反隶属函数进行转换，计算公式如下：

式中：R(X_i)为指标测定值，X_min和X_max分别为某一指标所有测定值中的最小值和最大值。

对所有指标隶属函数值进行相加，求其平均值，以平均值大小进行排名。

1.4 统计分析

数据使用Excel 2013进行汇总和整理，使用SAS 9.1软件中GLM过程进行方差分析和Duncan氏法多重比较检验，结果以最小二乘均值表示，P < 0.05为差异显著，0.05≤P < 0.10为存在趋势。

2 结果 2.1 不同青贮添加剂对全株玉米青贮营养成分的影响

由表 2可以看出，不同青贮添加剂对全株玉米青贮的DM、ADF、ADL、EE、Ca和P含量无显著影响(P＞0.05)。有机酸组的CP含量显著高于其他各组(P < 0.05)，较对照组提高了8.33%。有机酸盐组和纤维素酶组的NDF含量显著低于其他各组(P < 0.05)。有机酸盐组的Ash含量显著高于有机酸组和纤维素酶组(P < 0.05)。有机酸盐组和纤维素酶组的RFV显著高于对照组(P < 0.05)。

2.2 不同青贮添加剂对全株玉米青贮碳水化合物组分含量的影响

由表 3可以看出，不同青贮添加剂对全株玉米青贮的CHO、CB1、CB2、CB3和CC含量无显著影响(P＞0.05)。有机酸盐组和纤维素酶组的Non-NDF含量显著高于对照组(P < 0.05)，较对照组分别增加了3.75%和3.66%。乳酸菌组、有机酸组、有机酸盐组和纤维素酶组的OA和CA含量均显著高于对照组(P < 0.05)，其中乳酸菌组的OA和CA含量最高。

2.3 不同青贮添加剂对全株玉米青贮预测能值的影响

由表 4可以看出，乳酸菌组和有机酸组的TDN含量显著高于对照组、有机酸盐组和纤维素酶组(P < 0.05)，乳酸菌组和有机酸组的DE、ME、NE_m和NE_g均显著高于对照组、有机酸盐组和纤维素酶组(P < 0.05)。不同青贮添加剂对全株玉米青贮的NE_L无显著影响(P＞0.05)。

2.4 不同青贮添加剂对全株玉米青贮发酵参数的影响

由表 5可以看出，乳酸菌组、有机酸盐组和纤维素酶组的pH显著低于对照组(P < 0.05)，乳酸菌组、有机酸组、有机酸盐组和纤维素酶组的乳酸含量显著高于对照组(P < 0.05)，其中，乳酸菌组的pH最低，乳酸含量最高。有机酸组的丙酸含量显著高于其他各组(P < 0.05)。有机酸组和有机酸盐组的氨态氮/总氮(NH₃-N/TN)显著低于对照组(P < 0.05)。有机酸组、有机酸盐组和纤维素酶组的发酵系数显著高于对照组(P < 0.05)。乳酸菌组、有机酸盐组和纤维素酶组的费氏评分高于对照组(P < 0.05)。不同青贮添加剂对全株玉米青贮的乙酸和丁酸含量无显著影响(P＞0.05)。

2.5 不同青贮添加剂对全株玉米青贮瘤胃降解率的影响

由表 6可以看出，有机酸盐组的DMD_{24 h}和NDFD_{24 h}显著高于对照组(P < 0.05)，纤维素酶组的DMD_{24 h}、NDFD_{24 h}和DMD_{48 h}显著高于对照组(P < 0.05)。不同青贮添加剂对全株玉米青贮的NDFD_{48 h}无显著影响(P＞0.05)。

2.6 不同青贮添加剂处理的全株玉米青贮的营养价值综合评价

将各组有显著差异的15个指标进行隶属函数分析，其中CP、RFV、Non-NDF、CB₁、TDN、乳酸、发酵系数、费氏评分、DMD_{24 h}、DMD_{48 h}和NDF_{24 h}为正相关指标，NDF、Ash、pH和NH₃-N/TN为负相关指标。依据15个指标的平均隶属函数值进行排序，数值越大则综合营养价值越高，综合营养价值从高到低为：纤维素酶组>有机酸盐组>有机酸组>乳酸菌组>对照组。

3 讨论 3.1 不同青贮添加剂对全株玉米青贮营养成分的影响

本试验中，乳酸菌组的常规营养成分与对照组无显著差异，与孙贵宾等^[26]和李金俐等^[27]的研究结果一致，而尉小强等^[28]添加植物乳杆菌显著降低了全株玉米青贮的NDF和ADF含量，不同研究采用的乳酸菌种类和浓度不同可能是结果存在分歧的原因。本试验中，有机酸组的CP和WSC含量较对照组显著增加，与和张晴晴等^[29]分别在天然牧草和燕麦青贮中添加甲酸的结果一致，原因可能是有机酸直接酸化青贮饲料，抑制了腐败菌和梭菌等有害微生物的活动，同时降低了青贮发酵早期植物自身呼吸作用对CP和WSC的消耗，有效保留了营养物质^[29]。有机酸盐组和纤维素酶组的NDF和ADF含量较对照组显著降低，而Non-NDF含量显著增加，由于有机酸盐和纤维素酶对植物细胞壁有降解作用，尤其是对半纤维素和纤维素的降解，进而提高了非结构性碳水化合物的含量^[30]。RFV是评定粗饲料营养价值的重要指标，其主要基于粗饲料中NDF和ADF含量进行估算，NDF和ADF含量越低，粗饲料品质越好^[31]。因此，有机酸盐组和纤维素酶组的高RFV与其低NDF含量直接相关。TDN是饲料有效能值的一种表现形式，比较全面的综合了饲料的NDF、CP、Ash、ADL和EE等指标^[32]。但李悦铭等^[33]发现，添加不同浓度的甲丙混合酸对全株小麦青贮的能量指标无显著影响。不同研究间采用的青贮原料种类以及测定能值的方法不同可能是结果存在分歧的原因。由于DE、ME、NE_m和NE_g均是在TDN的基础上计算而来，因此各能值指标的变化规律与TDN相似。

3.2 不同青贮添加剂对全株玉米青贮发酵品质的影响

青贮pH、乳酸含量和NH₃-N/TN是衡量青贮饲料发酵品质的重要指标。优质青贮饲料的pH应在4.2以下^[34]，NH₃-N/TN低于10%^[35]，乳酸含量在4%~6%^[36]。本试验中，对照组青贮的各项指标均达到优质青贮饲料的要求，表明全株玉米青贮是一种较易获得高品质青贮饲料的原料，主要与其高WSC含量和附生乳酸菌数量较大有关。尽管如此，本试验添加不同青贮添加剂均可进一步提升青贮饲料的发酵品质，不同程度地提升了乳酸含量，降低了pH和NH₃-N/TN，其中，乳酸菌组提升乳酸含量的能力强于有机酸组，原因主要与二者调控青贮发酵的模式不同有关，乳酸菌作为青贮发酵促进剂，增加了乳酸菌的数量，进而促进WSC被乳酸菌利用而产生大量的乳酸，而有机酸作为青贮发酵抑制剂，直接酸化青贮饲料来抑制有害微生物的活动，保留饲料营养价值和改善发酵品质的同时，会对乳酸菌的活动造成影响^[33]。李悦铭等^[33]在小麦青贮中添加不同浓度的甲丙混合酸，随着甲丙混合酸浓度的增加，乳酸含量显著线性降低。而薛春胜等^[37]在苜蓿青贮中添加甲酸显著提升了青贮乳酸含量。因此，应用有机酸作为青贮添加剂，使用前应需根据饲草的属性筛选出适宜的添加量。NH₃-N/TN是反映青贮过程中蛋白质降解程度的指标，其含量直接影响饲料的适口性和营养价值，NH₃-N/TN越高则表明蛋白氮降解越多，青贮发酵品质越差。本试验中，有机酸盐组和有机酸组的NH₃-N/TN较对照组显著降低，与Da Silva等^[38]的结果一致，表明有机酸及其盐对青贮饲料蛋白质具有较强的保护能力。费氏评分作为评估青贮饲料质量优劣的标准之一^[23]，主要由青贮DM和pH计算得出，由于各组的DM含量无显著差异，因此，本研究中费氏评分的变化规律与pH一致。

3.3 不同青贮添加剂对全株玉米青贮瘤胃降解率的影响

青贮饲料的DM和NDF瘤胃降解率是影响反刍动物干物质采食量(DMI)的重要因素^[39]。目前，有关青贮添加剂对青贮饲料瘤胃DMD和NDFD影响的结果存在分歧，本试验中，有机酸盐组和纤维素酶组的DMD_{24 h}和NDFD_{24 h}较对照组显著增加，且纤维素酶组最高，而乳酸菌组和有机酸组的DMD和NDFD与对照组无显著差异。但刘帅等^[39]添加乳酸菌提高了全株玉米青贮DM和NDF的有效降解率。苗树君等^[40]和万江春等^[41]研究表明，添加乳酸菌分别提高了玉米秸秆和棉花秸秆的NDFD。李悦铭等^[33]研究表明，添加甲丙混合酸增加了小麦青贮的DMD和NDFD。通过分析发现，青贮饲料DMD和NDFD与其NDF含量密切相关，以上研究中，青贮添加剂提升DMD和NDFD的同时，NDF含量均显著降低。相比之下，纤维素酶对DMD和NDFD的影响研究结果较为一致。万江春等^[41]研究发现，添加纤维素酶分别增加了玉米秸秆和草原天然牧草青贮的NDFD，与本试验结果一致，主要原因是纤维素酶可水解植物细胞壁为单糖，改变其纤维素结构并降低纤维含量^[7]。因此，添加纤维素酶是提升青贮饲料营养物质消化率的有效手段。

4 结论

乳酸菌、有机酸、有机酸盐和纤维素酶对全株玉米青贮的营养成分含量、发酵品质和瘤胃降解率均有不同程度的提升作用，各组全株玉米青贮的综合营养价值从高到低依次为：纤维素酶组>有机酸盐组>有机酸组>乳酸菌组>对照组。