2. 水产高效健康生产湖南省协同创新中心, 常德 415000
2. Collaborative Innovation Center for Efficient and Health Production of Fisheries in Hunan Province, Changde 415000, China
金针菇菌渣是收集金针菇子实体后留下的培养基残渣。据中国食用菌协会统计,2015年全国金针菇总产量为2 238万t,按菌渣生成量为鲜菇产量的25%~33%计算[1],金针菇菌渣年产量可达559万t。将金针菇菌渣应用于水产饲料,不仅能充分利用资源,还可降低饲料成本。菌渣成分主要由栽培菌种及培养基原料决定,一般含丰富的菌丝残体、多种必需氨基酸及大量未分解的纤维素。金针菇菌丝体中特有的金针菇多糖具有多种免疫活性,可提高机体免疫力[2]。金针菇菌渣中含有18种水溶性氨基酸,总氨基酸含量为2 583.709 mg/kg,必需氨基酸占总氨基酸含量的37.62%[3]。金针菇菌渣中粗纤维含量为24.17%~27.40%,另外还含有一些矿物质元素及菌体生长代谢产物[4]。现阶段金针菇菌渣在肉兔[5]、山羊[6]等畜禽饲粮中取得良好的应用效果,但在水产饲料中的应用研究甚少。
草鱼在进化过程中形成了与草食性相适应的消化道结构与肠道微生物结构[7-8],本试验以对纤维素利用效率较高的典型草食性鱼类草鱼为研究对象,通过研究金针菇菌渣对草鱼生长性能、肠道组织结构及血清生化与免疫指标的影响,探索金针菇菌渣在草鱼饲料中的应用效果。
1 材料与方法 1.1 试验材料和试验设计试验所用金针菇菌渣由广州茂裕生物科技有限公司提供。金针菇培养基主要由玉米芯、米糠、麸皮、玉米粉、棉籽壳等组成。在收割菌体后会有部分金针菇菌丝残体脱离,因此菌渣中含有较丰富的粗纤维物质及金针菇多糖活性物质。金针菇菌渣使用前自然风干,其主要有效成分见表 1。
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表 1 金针菇菌渣主要有效成分(风干基础) Table 1 Main active ingredients of Flammulina velutipes medium residue (air-dry basis) |
选择初始体重(20.02±0.03) g的草鱼480尾,随机分为4组,每组3个重复,每个重复40尾。对照组饲喂基础饲料,试验组以金针菇菌渣替代基础饲料中的面粉,金针菇菌渣添加水平分别为5%(Ⅰ组)、10%(Ⅱ组)和15%(Ⅲ组),试验饲料组成及营养水平见表 2。
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表 2 试验饲料组成及营养水平(风干基础) Table 2 Composition and nutrient levels of experimental diets (air-dry basis) |
养殖试验在湖南省娄底市新化县车田江水库试验基地的聚乙烯网箱(1.5 m×1.5 m×1.5 m)进行,鱼苗购自湘潭某苗种场,购入后暂养30 d。每组饲料喂养3个网箱的草鱼,每个网箱40尾。驯化4 d后正式开始养殖试验,养殖持续56 d。每天投喂3次(07:00、12:00、17:00)。每5 d调整投饵量,10 d调整投饵率,投饵率为体重的3%~5%,记录每天的摄食情况。养殖期间水温26.0~31.5 ℃,水体溶氧含量(6.8±0.5) mg/L,氨氮含量≤0.21 mg/L。
1.3 样品采集试验鱼饥饿24 h后开始采样。称量每个网箱草鱼总重,记录总尾数,用于计算增重率(weight gain rate,WGR)、饲料系数(feed conversion rate,FCR)、存活率(survival rate,SR)。每个网箱随机取3尾草鱼麻醉后于冰盘上迅速解剖,测量体长,称取个体重、肝脏重、肠道重,用于计算肥满度(condition factor,CF)、肝体比(hepatosmatic index,HSI)、肠体比(viserosomatic index,VSI)。草鱼血清和肠道组织样品采集参照吴桐强等[9]的方法。
1.4 指标测定 1.4.1 生长性能生长性能相关指标计算公式如下:
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式中:Ne为每个网箱草鱼终末尾数;Ns为每个网箱草鱼初始尾数;Wr为每个网箱草鱼摄入饲料总量;We为每个网箱草鱼终末总体重;Ws为每个网箱草鱼初始总体重;Wd为每个网箱草鱼死亡个体体重;Wea为每个网箱草鱼终末个体均重;Wsa为每个网箱草鱼初始个体均重;Wb为采样个体体重;L为采样个体体长;Wl为采样个体肝脏重;Wc为采样个体肠道重。
1.4.2 肠道消化酶活性和肠道组织结构样品在测定前于冰盒中解冻、称重。待测组织用生理盐水进行匀浆,2 500 r/min离心10 min,取上清液测定总蛋白(total protein,TP)含量及淀粉酶、脂肪酶活性。每毫克组织蛋白在37 ℃与底物作用30 min,水解10 mg淀粉定义为1个淀粉酶活性单位;在37 ℃条件下,每克组织蛋白在反应体系中与底物反应1 min,每消耗1 μmol底物为1个脂肪酶活性单位。另称取肠道组织样品用胰蛋白酶匀浆液进行匀浆,2 500 r/min离心10 min,取上清液测定胰蛋白酶活性;在pH=8.0、温度37 ℃条件下,每毫克组织蛋白中含有的胰蛋白酶每分钟使吸光度变化0.03即为1个胰蛋白酶活性单位。试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。
使用光学显微镜观察草鱼中肠组织结构,于100倍下测定绒毛高度、肌层厚度;于400倍下进行杯状细胞计数。
1.4.3 血清生化和免疫指标血清样本于冰盒解冻后进行测定。血清补体3(C3)、补体4(C4)、免疫球蛋白M(IgM)含量采用酶联免疫吸附法测定,试剂盒购自浙江伊利康生物技术有限公司。血清谷草转氨酶(GOT)、谷丙转氨酶(GPT)、碱性磷酸酶(AKP)、过氧化氢酶(CAT)、抗超氧阴离子(ASAFR)、超氧化物歧化酶(SOD)活性及尿素氮(UN)、总胆固醇(TCHO)、甘油三酯(TG)、总胆汁酸(TBA)、丙二醛(MDA)含量均采用南京建成生物工程研究所的试剂盒测定。
1.5 数据统计与分析采用Excel 2016和SPSS 19.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA),用Duncan氏多重比较法分析组间差异性显著,P < 0.05表示差异显著,数据表示为“平均值±标准误”。
2 结果 2.1 金针菇菌渣对草鱼生长性能的影响由表 3可知,Ⅰ组草鱼增重率显著高于对照组(P < 0.05),而Ⅱ、Ⅲ组草鱼增重率与对照组差异不显著(P>0.05)。各组草鱼的饲料系数、存活率、肥满度、肝体比、肠体比无显著差异(P>0.05)。
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表 3 金针菇菌渣对草鱼生长性能的影响 Table 3 Effects of Flammulina velutipes medium residue on growth performance of grass carp (n=3) |
由表 4可知,与对照组相比,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组肠道淀粉酶、脂肪酶活性差异不显著(P>0.05);Ⅰ组肠道淀粉酶、脂肪酶活性最高,且显著高于Ⅲ组(P < 0.05)。与对照组相比,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组肠道胰蛋白酶活性均升高,并随着金针菇菌渣添加水平升高呈先升高后降低的趋势,且Ⅱ组肠道胰蛋白酶活性显著高于对照组和Ⅲ组(P < 0.05)。
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表 4 金针菇菌渣对草鱼肠道消化酶活性的影响 Table 4 Effects of Flammulina velutipes medium residue on intestinal digestive enzyme activities of grass carp (n=3) |
由表 5可知,与对照组相比,Ⅰ组中肠绒毛高度显著提高(P < 0.05),而Ⅱ、Ⅲ组没有显著差异(P>0.05);Ⅱ、Ⅲ组肌层厚度显著提高(P < 0.05),而Ⅰ组没有显著差异(P>0.05);Ⅰ、Ⅱ组杯状细胞数量显著增加(P < 0.05),而Ⅲ组没有显著差异(P>0.05)。
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表 5 金针菇菌渣对草鱼中肠组织结构的影响 Table 5 Effects of Flammulina velutipes medium residue on midgut tissue structure of grass carp (n=3) |
从图 1可见,对照组草鱼肠道绒毛生长最整齐,结构最完整,各试验组草鱼绒毛宽度均大于对照组,Ⅰ组杯状细胞数量最多。
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A:对照组control group (100×); B:Ⅰ组group Ⅰ (100×); C:Ⅱ组group Ⅱ (100×); D:Ⅲ组group Ⅲ (100×); E:对照组control group (200×); F:Ⅰ组group Ⅰ (400×)。 VH:绒毛高度villus height; MT:肌层厚度muscular layer thickntss; GC:杯状细胞goblet cell。 图 1 草鱼中肠组织切片图 Fig. 1 Tissue silce of midgut of grass carp |
由表 6可知,Ⅰ组血清GOT活性显著低于对照组(P < 0.05),Ⅱ、Ⅲ组与对照组差异不显著(P>0.05)。各组血清GPT活性及UN、TCHO、TG含量无显著差异(P>0.05)。Ⅲ组血清TBA含量显著高于Ⅱ组(P < 0.05),Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组与对照组差异不显著(P>0.05)。
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表 6 金针菇菌渣对草鱼血清生化指标的影响 Table 6 Effects of Flammulina velutipes medium residue on serum biochemical indexes of grass carp (n=3) |
由表 7可知,与对照组相比,Ⅰ组血清C3、IgM含量和AKP活性无显著差异(P>0.05),Ⅰ组血清C4含量显著升高(P < 0.05);Ⅱ、Ⅲ组血清C3、IgM含量和AKP活性显著降低(P < 0.05)。
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表 7 金针菇菌渣对草鱼血清免疫和抗氧化指标的影响 Table 7 Effects of Flammulina velutipes medium residue on serum immune and antioxidant indexes of grass carp (n=3) |
与对照组相比,Ⅰ组血清CAT、ASAFR、SOD活性及MDA含量无显著差异(P>0.05);Ⅱ、Ⅲ组血清CAT活性显著降低(P < 0.05),Ⅲ组血清ASAFR活性显著降低(P < 0.05),Ⅲ组血清MDA含量显著升高(P < 0.05)。
3 讨论 3.1 金针菇菌渣对草鱼生长性能和肠道组织结构的影响菇类菌渣直接应用于水产饲料的研究较少。黄立春等[10]使用姬菇菌渣搭配商品饲料喂养草鱼可一定程度提高草鱼增重率,降低饲料系数。庞思成[11]使用平菇菌渣替代罗非鱼饲料中30%的麸皮,对增重率与存活率没有显著影响。一些研究也探索了金针菇菌渣对畜禽生长的作用;王利民等[5]使用19%的菌渣完全替代麸皮后肉兔采食率、料重比没有显著变化。孟梅娟等[6]使用金针菇菌渣替代稻草喂养山羊,提高了山羊对有机物及总能的表观消化率。本试验中,饲料中添加5%的金针菇菌渣能显著提高草鱼增重率,其促生长作用可能与饲料粗纤维水平及其中的生物活性成分有关。粗纤维可以通过影响机体消化功能而对动物生长产生作用。晁洪雨等[12]研究表明,饲粮酸性洗涤纤维(ADF)水平为16%时肉兔淀粉酶、胰蛋白酶活性最高,高于或低于这个ADF水平其活性均降低。Hsu等[13]研究得出饲粮粗纤维水平高于120 g/kg时,雏鹅的淀粉酶活性显著下降。Santos等[14]研究表明,饲粮ADF水平为19%时,新西兰白兔对饲粮的消化率最高。适量的粗纤维可刺激消化道蠕动,促进消化酶分泌。过量的粗纤维会导致消化道蠕动过快,使饲粮与消化酶接触时间变短;粗纤维也能与消化酶络合,阻止酶与底物充分结合,降低消化酶活性[15]。本试验中,Ⅰ组即饲料粗纤维水平为9.62%时肠道淀粉酶和脂肪酶活性最高,这与草鱼增重率的表现一致,可能是适量的粗纤维提高了肠道消化酶活性,从而促进草鱼生长。
饲料粗纤维水平同样影响草鱼的肠道组织结构。肠道绒毛具有吸收营养物质的作用;杯状细胞能合成分泌黏蛋白,形成黏膜屏障保护上皮细胞[16];肌层厚度与肠道节律性收缩及食糜的机械消化有关[17]。本试验中,饲料添加5%的金针菇菌渣能促进草鱼中肠绒毛生长,增加杯状细胞数量;但添加水平高于5%时,中肠绒毛高度下降,杯状细胞数量减少,这与肠道消化酶活性变化的结果相适应。原因可能是适量的粗纤维刺激肠道黏膜,促进杯状细胞增生以抵抗外源性刺激;而高金针菇菌渣水平组由于棉籽壳等粗纤维物质含量的增加,可能对肠道黏膜产生一定程度的损伤,不利于绒毛生长及杯状细胞产生。肠道肌层厚度随金针菇菌渣添加水平增加而增加,可能是饲料中粗纤维水平提高,促进肠道机械蠕动,导致肌层厚度适应性增加,这也与草鱼肠体比的增加趋势相印证。
3.2 金针菇菌渣对草鱼血清生化指标的影响转氨酶参与氨基酸代谢[18],肝细胞受损时进入血液。本试验中,除Ⅰ组血清GOT活性显著低于对照组外,各组GOT、GPT活性与对照均无显著差异,这与孟梅娟等[19]对山羊的研究结果基本相同。TG和TCHO是血清中的主要脂类[20],反映机体脂质代谢状态。TBA是胆固醇在肝脏分解的终产物,肝细胞受损或胆汁代谢障碍时,血清TBA含量增加[21]。本试验中,各试验组血清TG、TCHO、TBA含量与对照组相比没有显著差异,与徐翱[22]在施氏鲟鱼的研究结果相同。这可能是因为饲料适宜的粗纤维水平对肝脏转氨基作用及脂肪代谢没有显著影响。UN是蛋白质代谢的主要产物,反映蛋白质的消化。血清UN含量与摄入蛋白质的数量和质量有关[23],饲料粗纤维水平也会影响蛋白质代谢。粗纤维水平过高使营养物质在小肠停留时间变短,粗蛋白质消化吸收不充分。本试验中,各试验组血清UN含量与对照组没有显著差异,可能是因为各组的粗纤维水平均在适量的范围内,同时也证明金针菇菌渣与面粉的蛋白质品质没有显著差异,也可验证各试验饲料粗蛋白质水平不存在显著差异。
3.3 金针菇菌渣对草鱼血清免疫和抗氧化指标的影响金针菇菌渣中的金针菇多糖是良好的免疫活性物质,能恢复、提高机体免疫力[24],清除羟自由基[25],抑制炎性细胞因子[25-26]。此外,金针菇培养基中的玉米、麸皮等谷实成分在发酵时可形成适宜的温度和水分环境,利于黄曲霉菌、赤霉菌生长繁殖,产生黄曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮毒素[27],可能会影响草鱼机体健康。
需氧生物在氧化还原循环过程中产生大量自由基,导致机体氧化损伤[28]。CAT可催化细胞内过氧化氢分解,降低氧化应激。SOD、ASAFR可清除超氧阴离子自由基,MDA是脂质氧化终产物。本试验中,Ⅰ组血清CAT、ASAFR、SOD活性及MDA含量与对照组没有显著差异,说明机体未有明显氧化应激反应;而Ⅲ组血清MDA含量显著上升,可能是饲料高水平纤维或积累毒素刺激机体,促进活性氧簇生成,提高膜脂过氧化水平[29]。C3、C4存在于人和动物体液及细胞表面,经活化后可介导免疫和炎症反应[30],通过改变吞噬细胞和病原细胞表面分子构象消除病原体[31]。IgM具有强大的杀菌、激活补体、免疫调理作用。AKP可直接参与生物体磷酸基团的转移和代谢。本试验中,与对照组相比,Ⅰ组血清C3、IgM含量及AKP活性没有显著变化,而当金针菇菌渣添加水平超过5%时则呈下降趋势,Ⅲ组显著低于对照组。Ⅲ组膜脂过氧化水平显著提高,机体受氧自由基攻击,但血清免疫活性物质及抗氧化酶活性反而显著下降,分析原因可能是饲料中棉籽壳等高纤维物质刺激或累积毒素影响了草鱼机体免疫功能。金针菇菌渣添加水平为5%时草鱼血清免疫和抗氧化水平没有显著变化,可能是饲料金针菇多糖与低毒素含量拮抗作用的结果。
4 结论① 饲料金针菇菌渣添加水平为5%时可提高草鱼生长性能,改善肠道组织结构,提高肠道消化酶活性。
② 综合草鱼生长性能、肠道组织结构及血清生化、免疫和抗氧化指标,饲料金针菇菌渣添加水平以不高于10%为宜。
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