2. 河北天和肉牛养殖有限公司, 石家庄 050200;
3. 保定市畜牧工作站, 保定 071051
2. Hebei Tianhe Beef Cattle Breeding Co., Ltd., Shijiazhuang 050200, China;
3. Animal Husbandry Workstation of Baoding, Baoding 071051, China
蛋白质饲料资源紧缺和利用效率低是困扰畜牧业发展的瓶颈，提高蛋白质的利用率既能降低饲养成本又能保护环境。调控氨基酸的供需平衡可提高蛋白质的转化效率，改善氮利用率[1]。近年来，动物营养学家研究证实在饲粮中添加蛋氨酸、赖氨酸、色氨酸等氨基酸能提高奶牛、猪等动物的生长性能及氮利用率[2-4]，而这些研究主要集中在有限的几种必需氨基酸或限制性氨基酸的添加比例和水平，对非必需氨基酸和功能性氨基酸需要量研究很少。
精氨酸(Arg)作为功能性氨基酸之一，广泛参与机体组织代谢，与机体蛋白质代谢、免疫等密切相关[5]。L-精氨酸是动物体内携带氮最多的氨基酸，能调节尿素生成[6]，维持体内氮平衡[7]。在单胃动物(猪、鸡、鸭等)上研究表明，适量的精氨酸能够提高机体的生长性能、繁殖性能及屠宰性能[8]。在反刍动物上的相关研究较少，Davenport等[9]给小母牛输注精氨酸溶液证实可改善小母牛的氮代谢。由于精氨酸的价格昂贵且在瘤胃中极易被降解[10]，而补充过瘤胃精氨酸会影响小肠对其他碱性氨基酸的吸收[11]，因此亟需开发能够替代精氨酸功能的产品。N-氨甲酰谷氨酸(N-carbamylglutamate，NCG)作为N-乙酰谷氨酸(N-acetylglutmate，NAG)的结构类似物，瘤胃降解率较低，能够激活氨甲酰磷酸合成酶，促进内源精氨酸的生成，是精氨酸的潜在代替物[11]。有研究表明，NCG可促进单胃动物组织蛋白质的合成[12]，降低牛奶、血浆中尿素氮(UN)的含量，提高蛋白质代谢利用率，平衡机体氨基酸的组成，从而提高奶牛的泌乳性能和氮利用率[13]。但NCG的研究主要集中在单胃动物上，反刍动物上报道较少，特别是NCG对反刍动物氮代谢机制研究更少。因此，本试验旨在研究添加不同水平的NCG对荷斯坦奶公牛氮排放、血浆游离氨基酸及尿中嘌呤衍生物排出量的影响，探讨NCG对奶公牛氮代谢的影响规律，为后期优化肉牛饲粮氨基酸平衡、降低氮排放奠定基础。
1 材料与方法 1.1 试验设计及饲粮本试验采用完全随机试验设计，选择12~13月龄、体重为(478.00±13.66) kg、健康的、膘情正常的荷斯坦奶公牛45头，随机分成3组，每组15个重复，每个重复1头牛，分别饲喂在全混合日粮(TMR)基础上添加0(Ⅰ组，对照组)、15(Ⅱ组)、25 g/d(Ⅲ组)NCG的饲粮。
将NCG与100 g精料混合均匀后于每天07：00投喂给试验组奶公牛，确保每个试验牛全部采食，对照组奶公牛只额外饲喂100 g精料。基础饲粮参考《日本饲养标准·肉用牛》(2008)及我国《肉牛饲养标准》(NY/T 815—2004)配制，饲粮在预计日增重1.7 kg营养需要基础上，粗蛋白质含量降低27.22%。基础饲粮组成及营养水平见表 1。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (DM basis) |
本试验于2018年9—12月在满城宏达牧业有限公司进行。预试期7 d，正试期90 d。奶公牛散栏饲养，每天饲喂2次TMR，自由采食、饮水，定期消毒，每天打扫料槽，每周清洗水槽2~3次。
1.3 计算公式
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饲粮样的采集：试验期每隔15 d连续3 d采集TMR样本，将每天采集的TMR样本混匀，于65 ℃烘干，粉碎备用。
粪样与尿样的采集：在正试期第87~89天，每组选取5头体况良好、大小相近的试验牛，采用全收粪尿法，采集连续3 d粪便和尿液。收集粪便每天称重，取5%的粪样均匀混合分成2份，其中一份不加酸，另一份加10%的硫酸溶液(100 g粪样加20 mL 10%的硫酸溶液)，-20 ℃冰箱中储存，于65 ℃烘箱烘干。全天收集尿液称量，取尿量的1%，4层纱布过滤，加10%的硫酸溶液(100 mL加10 mL 10%的硫酸溶液)，于-20 ℃冰箱中储存，备用。
1.4.2 血样的采集在正试期第80天，采用颈静脉无菌采血法(用抗凝管和促凝管抽取全血)于晨饲前采集每组5头试验牛血液。其中抗凝管采集的血液4 ℃下静置3~4 h，4 ℃、5 000 r/min离心5 min，取上清液分装，做好标记，于-80 ℃保存，待测血浆中游离氨基酸含量；促凝管采集血液，37 ℃水浴0.5 h，4 ℃、3 000 r/min离心15 min，取血清分装至1.5 mL的离心管中，做好标记，-20 ℃中储存，待测血清生化指标。
1.5 指标测定及计算 1.5.1 饲粮样、粪样、尿样成分的测定饲粮样、粪样及尿样中氮含量参照国标[15]的方法，采用全自动凯氏定氮仪(FOSS-8400，丹麦)测定。饲粮样、粪样中粗灰分含量参考《饲料分析及饲料质量检测技术》[16]中的方法测定。将每头牛收集的粪样与尿样分别作为1个样品，每个样品测定3次。
1.5.2 血清生化指标的测定血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)活性使用酶标仪(BioTek，美国)，采用酶联免疫分析法进行测定；血清UN含量采用二乙酰肟法进行测定。每个样品测定3次。
1.5.3 血浆游离氨基酸含量的测定利用超高效液相色谱仪(Waters，UPLC I-Class)、串联四极杆质谱仪(Waters，XEVO TQ-S-Micro)测定血浆中游离氨基酸含量[17]。每头牛做1次重复，每组测5次重复。
1.5.3.1 血浆样本处理方法1) 将加热装置预热至55 ℃；
2) 血浆样本常温解冻，涡旋混匀；
3) 取10 μL血浆样本到1.5 mL EP管中，加入30 μL乙腈；
4) 涡旋1 min，4 ℃、13 200 r/min离心5 min；
5) 取上清液10 μL到新的1.5 mL EP管中，加入10 μL超纯水，涡旋混匀；
6) 取10 μL混匀的样本到新的1.5 mL EP管中，准确加入70 μL缓冲液，涡旋混合1 min；
7) 加入20 μL配制好的6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯(AQC)衍生试剂，涡旋混合1 min；
8) 室温静置1 min；
9) EP管转移到加热装置上，55 ℃加热10 min，4 ℃、13 200 r/min离心2 min；
10) 样本加入带内衬管的2 mL进样瓶，待测。
1.5.3.2 色谱条件色谱柱：Waters UPLC HSST3(内径1.8 μm, 2.1 mm×150 mm)。流动相：A(水，0.1%甲酸)和B[乙腈:水(95 : 5)，0.1%甲酸1 mmol/L，甲酸铵]。流速0.6 mL/min；进样量8 μL；柱温40 ℃。具体洗脱程序见表 2。
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表 2 氨基酸分析梯度洗脱程序 Table 2 Amino acids analysis gradient elution procedures |
质谱分析采用四极杆串联质谱仪(Waters, XEVO TQ-S-Micro)。采集模式为正离子，离子源温度为150 ℃，毛细管电压为1.5 kv，脱溶剂气温度为600 ℃，锥孔气流速为150 L/Hr，脱溶剂气流速为1 000 bar，均使用高纯氮气。液质系统由Masslynx质谱数据采集软件控制。
1.5.3.4 数据处理采用串联四极杆质谱仪，进行高灵敏度的定量分析，同时使用外标法，同位素内标或生物体内不含有的同系物内标，实现生物样本中的靶向代谢物定量。靶向代谢组使用Masslynx(美国Waters)定量分析软件进行提峰计算。
1.5.4 尿中嘌呤衍生物及肌酸酐含量的测定 1.5.4.1 样本制备1) 尿样本常温融化，涡旋混匀；
2) 取500 μL尿液至标记好标签的1.5 mL离心管中，加入500 μL的水；
3) 充分振荡5 min，离心，取上清液50 μL到标记好的2 mL离心管，加入1.2 mL乙腈，振荡5 min，混匀，取上清100 μL，置于1.5 mL样品瓶，用于尿中尿酸、尿囊素、肌酸酐含量的测试；
4) 取步骤2中的样本300 μL于标记好的离心管，加入300 μL乙腈，振荡混匀，取上清100 μL，置于1.5 mL样品瓶，用于尿中黄嘌呤、次黄嘌呤含量的测试。
1.5.4.2 色谱条件采用超高效液相色谱仪(Thermo Fisher Scientific, DionexTM UltiMateTM 3000)使用亲水色谱对尿样本进行分析。将每头牛3 d的尿样混合，作为每头牛的尿样，每头牛做1次重复，每组测5次重复。
流动相：A(水，0.1%甲酸)和B[乙腈:水(95 : 5)，0.1%甲酸，1 mmol/L甲酸铵]。流速0.3 mL/min；柱温40 ℃。具体洗脱程序见表 3。
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表 3 尿液嘌呤分析梯度洗脱程序 Table 3 Urine PD analysis gradient elution procedures |
质谱分析采用四极杆轨道离子阱质谱仪(Thermo Fisher Scientific，Q ExactiveTM)。正离子离子源电压为3.7 kV，毛细管加热温度320 ℃，翘气压力30 psi，辅助气压力10 psi，容积加热蒸发温度300 ℃，翘气和辅助气均为氮气，碰撞气为氮气，压力为1.5 mTorr(1 mTorr=0.133 Pa)。一级全扫描参数为：分辨率70 000，自动增益控制目标为1×106，最大隔离时间50 ms，质荷比扫描范围150~1 500。质谱质量轴校准采用外标法。
1.5.4.4 数据处理使用XCalibur数据分析软件，采用外标标曲法，以浓度对应化合物峰面积与标准品峰面积做线性回归方程和线性相关系数，使用此标准曲线定量样本。
1.6 数据统计分析采用SAS 9.4软件的MIXED模型进行分析，其中不同的NCG添加水平作为固定因子，重复作为随机因子，用PDIFF矫正的Tukey模型进行多重比较。P < 0.05表示差异显著，试验结果以“平均值±标准误”表示。
2 结果与分析 2.1 NCG对荷斯坦奶公牛血浆氨基酸含量的影响由表 4可知，Ⅱ组血浆中游离精氨酸、组氨酸、天冬氨酸含量显著高于Ⅰ组、Ⅲ组(P＜0.05)；与Ⅰ组相比，Ⅱ组、Ⅲ组血浆中异亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、丙氨酸、谷氨酸、酪氨酸、总必需氨基酸、总非必需氨基酸及总氨基酸含量显著提高(P＜0.05)。
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表 4 NCG对荷斯坦奶公牛血浆氨基酸含量的影响 Table 4 Effects of NCG on plasma amino acid contents of Holstein bulls |
由表 5可知，3组间血清中ALT活性差异不显著(P＞0.05)；Ⅱ组血清AST活性显著高于Ⅰ组、Ⅲ组；与Ⅰ组相比，Ⅱ组血清中UN含量显著降低(P＜0.05)。
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表 5 NCG对荷斯坦奶公牛血清生化指标的影响 Table 5 Effects of NCG on serum biochemical indexes of Holstein bulls |
由表 6可知，Ⅰ组、Ⅱ组及Ⅲ组间可消化有机物质采食量无显著差异(P＞0.05)；尿中嘌呤衍生物主要为尿囊素与尿酸。添加NCG对尿中尿囊素、尿酸、嘌呤衍生物排出量无显著影响(P＞0.05)。
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表 6 NCG对荷斯坦奶公牛有机物质采食量及尿中尿嘌呤衍生物排出量的影响 Table 6 Effects of NCG on organic matter intake and urine PD production in urine of Holstein bulls |
由表 7可知，Ⅰ组、Ⅱ组及Ⅲ组间氮摄入量无显著差异(P＞0.05)；Ⅰ组粪氮的排出量显著高于Ⅱ组(P＜0.05)，Ⅱ组、Ⅲ组尿氮排出量显著低于Ⅰ组(P＜0.05)；Ⅱ组氮沉积显著高于Ⅰ组(P＜0.05)；Ⅱ组、Ⅲ组的净蛋白质利用率与蛋白质生物学价值均显著高于Ⅰ组(P＜0.05)。
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表 7 NCG对荷斯坦奶公牛氮代谢的影响 Table 7 Effects of NCG on nitrogen metabolism of Holstein bulls |
血液中游离氨基酸含量能反映动物体内氨基酸平衡和代谢状况[18-19]。当饲粮中氨基酸含量不足，血液中游离氨基酸含量相应降低[20]。NCG是NAG的结构类似物，不受细胞质中氨基酰化酶的影响，能进入线粒体，提高氨甲酰磷酸合成酶-Ⅰ(CSP-Ⅰ)和二氢吡咯-5-羧酸合成酶(P5CS)的活性，促进鸟氨酸循环与氨甲酰磷酸合成瓜氨酸，瓜氨酸进入细胞质进一步转化为精氨酸，进而增加肠道中瓜氨酸与精氨酸的合成[21]，最终促进机体蛋白质的合成[22]。本试验结果表明，NCG影响肉牛体内精氨酸的合成，添加水平为15 g/d时，血浆精氨酸的含量显著增加，但当添加水平为25 g/d时，血浆中游离精氨酸的含量有所降低，原因是精氨酸的合成受血浆中脯氨酸、谷氨酸含量的影响[23-25]，添加25 g/d NCG降低血浆中谷氨酸的含量(从68.93 μmol/L降低到63.19 μmol/L)，从而限制了精氨酸的生成。与王琤[26]在断奶仔猪试验中添加0.12%的NCG组精氨酸含量低于添加0.08% NCG组的结果相似。
亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸是肝外代谢的支链氨基酸，与精氨酸协同共同参与抗氧化作用[27]，能激活哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路促进翻译起始，促进蛋白质合成，减少肌蛋白分解[28]。本试验中添加NCG提高了血浆中异亮氨酸与缬氨酸的含量，从而增强了机体抗氧化及蛋白质合成能力。
血浆中必需氨基酸与总氨基酸供给充足，能够激活哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1(mTORC1)通路[29-30]，为动物体蛋白质沉积提供必需的物质来源，有利于机体氨基酸平衡及蛋白质的沉积[31]。本试验中，饲粮中添加15 g/d NCG，血浆中组氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸与蛋氨酸等必需氨基酸以及总必需氨基酸、总非必需氨基酸、总氨基酸的含量显著增加，而添加25 g/d时血浆中总必需氨基酸、总非必需氨基酸、总氨基酸的含量并没有线性增加。
3.2 NCG对荷斯坦奶公牛血清生化指标的影响ALT和AST是动物机体三大营养物质代谢过程中的转氨酶[32]，主要存在于心肌中，能够反映蛋白质在机体内的合成与分解状况[33]。本试验中各组的血清ALT和AST活性均在正常范围内，添加15 g/d的NCG时血清AST活性显著升高，说明饲粮中添加适宜的NCG影响了肉牛血清中AST活性，提高了机体蛋白质代谢。
UN是机体蛋白质和氨基酸代谢的产物，血清中UN含量反映动物体内氮代谢与氨基酸平衡状态，与氮利用呈负相关[34]。当动物体氨基酸平衡良好，氮利用率高时，血清中UN含量减少。本试验结果表明，添加15 g/d的NCG显著降低了血清中UN的含量, 说明适量NCG能够促进肉牛对营养物质的利用，调节体内氨基酸平衡，提高氮沉积。添加25 g/d的NCG，血清UN含量升高，是由于血清中AST活性降低，使氨基酸的利用效率降低，体内多余的氨基酸转化为尿素排出体外，精氨酸可以促进体内尿素循环[6]，本试验中血浆精氨酸含量降低，导致UN的排出量增加。
3.3 NCG对荷斯坦奶公牛可消化有机物质采食量与嘌呤衍生物排出量的影响嘌呤衍生物主要来源于被宿主吸收的瘤胃微生物蛋白的嘌呤代谢[35-36]，很少一部分来源于自身组织蛋白的嘌呤代谢，其含量的高低与瘤胃微生物蛋白产量呈正相关[37]。嘌呤衍生物由尿囊素、尿酸、黄嘌呤及次黄嘌呤组成，尿囊素和尿酸所占比重较大[38]，而黄嘌呤和次黄嘌呤所占比重较小[39-40]。本试验研究结果表明，奶公牛尿液的嘌呤衍生物中未检测出黄嘌呤和次黄嘌呤，这是由于牛的肝脏、血液、小肠黏膜细胞具有较高的黄嘌呤氧化酶活性，其体内的黄嘌呤与次黄嘌呤极易被氧化成尿酸[41]。
反刍动物尿中嘌呤衍生物排出量主要受采食量的影响，可消化有机物质采食量与嘌呤衍生物排出量存在显著的正相关，体重相近时，采食量越高，尿中嘌呤衍生物的排出量会越高[42-43]。本试验中添加NCG对有机物质采食量无显著影响，因此嘌呤衍生物的排出量也无显著变化。
肌酸酐是尿中非蛋白氮物质，是体内肌酸与肌酸磷酸的代谢产物，其排出量相对稳定[44]。反刍动物尿中肌酸酐的排出量不受食入蛋白质及尿量的影响，只与成年动物体重相关[43]。本试验尿中肌酸酐含量无显著变化，与已有研究结果[45]一致。
3.4 NCG对荷斯坦奶公牛氮代谢的影响粪便中排泄的氮主要由未消化的饲粮蛋白质、微生物蛋白和内源氮组成，而尿中排泄的氮主要来源于瘤胃中蛋白质降解[46]。动物体内氨基酸含量不足或不平衡，抑制其他氨基酸吸收，未被机体吸收利用的氨基酸以氨的方式进入肝脏，经鸟氨酸循环生成尿素后通过肾脏随尿排出，导致尿氮排出量增加；当体内氨基酸含量超过机体需要量时，氨基酸经糖异生作用或参与能量代谢，增加尿氮排出量[18]。L-精氨酸是动物体碱性最强的氨基酸，与氮的运输、储存、排泄密切相关[47]。一方面，精氨酸是体内一氧化氮的唯一前体物，与一氧化氮共同调控mTOR通路，进而促进肠道蛋白质的合成[48]，提高蛋白质利用率；另一方面，精氨酸在精氨酸水解酶的作用下分解为鸟氨酸与尿素，将多余的氨转为尿素排出体外，维持机体氮平衡[49]。NCG能够维持机体内较高的精氨酸含量，促进氨基酸平衡[13]。本试验结果表明，尿氮的排泄量降低，是由于NCG促进机体的尿素循环，增强肾脏对氮的截留能力，提高了AST的活性，使动物体内更多的氨基酸用于合成代谢，从而使尿液中的氮尤其是尿素氮的排出量降低，进而减少了尿氮排泄量；添加15 g/d NCG粪氮的排泄量显著降低，显著增加了奶公牛氮的沉积量，提高了净蛋白质利用率和蛋白质生物学价值，是由于添加NCG提高营养物质的消化率，增加了血浆中氨基酸含量，为机体蛋白质沉积提供必需的物质来源，进而增加了氮的沉积量，减少了氮排泄量，粪氮的排泄量也与氮的摄入量相关[50]。当饲粮中NCG添加水平为25 g/d时，氮的利用效率降低主要原因是：1)继续增加NCG添加水平并不能提高机体对氨基酸的吸收和转化，表现为血浆中总氨基酸含量无显著变化；2)继续增加NCG添加水平降低蛋白质合成效率，主要是因为其降低精氨酸、谷氨酸的含量，导致由精氨酸、谷氨酸正向调控的蛋白质合成效率降低，并且增加NCG降低血清中转氨酶的活性，不利于氨基酸之间的相互转化利用，进而使蛋白质的转化效率下降；3)继续增加NCG添加水平尿素循环再利用效率下降，氨基酸利用效率降低，尿素氮的排出量增加。当NCG添加水平为15 g/d时，奶公牛氮沉积达到最大，继续提高添加水平会破坏机体氮平衡，进而导致氮的利用率下降。
4 结论荷斯坦奶公牛饲粮中添加15 g/d NCG显著增加了血浆中必需氨基酸、非必需氨基酸及总氨基酸的含量，提高血清中AST的活性, 使粪氮及尿氮的排出量分别降低了10.28、11.01 g/(d·头)，氮沉积量提高了12.73 g/(d·头)。当NGG添加水平为25 g/d时，荷斯坦奶公牛蛋白质的合成效率降低，氮的利用率降低。
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