我国长毛兔常年存栏量为4 000万~5 000万只，占世界总量的90%，兔毛产量占世界生产总量的95%，居世界首位[1]。但与兔肉生产和绵羊毛生产资料相比，有关长毛兔营养的资料相当缺乏，市场上长毛兔的专门化饲料也极为少见。因此，对长毛兔的营养研究值得格外关注。近年来，国内外对长毛兔营养方面的研究主要集中在添加剂的使用和非常规饲料资源的开发利用上[2]。纤维和淀粉是家兔商业饲料的主要组成部分，足够的饲粮纤维对维持家兔肠道健康具有重要作用，但家兔对不同纤维成分的利用能力有很大差异，因此应对不同纤维成分加以详细分析。Gidenne[3]报道，家兔对果胶、半纤维素和纤维素的全肠道消化率分别为30%~80%、20%~60%和5%~25%。因此，Gidenne[4]将半纤维素和果胶的总和定义为可消化纤维(digestible fiber，dF)。淀粉是家兔饲粮的主要能量来源，饲粮淀粉水平增加，可促进家兔生长，提高饲料转化率，但饲粮淀粉水平过高不但会增加饲料成本，还会引起盲肠超负荷，导致消化道疾病。研究表明，用富含dF的麦麸和甜菜渣代替部分淀粉后，不但没有降低家兔对饲粮的消化率[5-6]，还减少了家兔的消化道疾病[7]。使用高可溶性纤维和低淀粉饲粮可提高家兔的消化率、生长性能和盲肠发酵[8]。周勤飞等[9]研究表明，饲粮可消化纤维与淀粉比(dF/S)(0.73~1.77)显著影响35日龄肉兔的生产性能和消化道酶活性。因此，探索家兔饲粮适宜的dF/S至关重要。本课题组前期研究表明，饲粮dF/S为0.59~0.74时长毛兔生长性能(日增重、料重比)最好，有利于兔毛生长的最适dF/S为0.66~1.06[10]。本试验是在前期研究的基础上，探索饲粮dF/S对长毛兔消化道发育、消化酶活性、十二指肠组织形态及盲肠菌群数量的影响，为长毛兔饲粮的配制提供科学参考。
1 材料与方法 1.1 试验时间和地点饲养及消化试验于2016年10—12月在吉林省梅河口市东林兔业进化长毛兔产业园区进行。屠宰及指标测定于2017年1—10月在沈阳农业大学动物营养实验室进行。
1.2 试验设计采用单因素完全随机化试验设计，配制dF/S分别为0.59、0.66、0.71、1.05和1.44的5种全价配合饲料(表 1)并制粒。试验动物为120只83日龄、平均体重为(2.19±0.07) kg的雌性长毛兔(由于雄兔的产毛量低，很少用于兔毛生产)，随机分为5组，每组4个重复，每个重复6只兔，单笼饲养。5组长毛兔随机饲喂上述5种不同dF/S的饲粮。预试期7 d，正试期40 d。试验期间各组长毛兔饲养管理条件相同，每日饲喂2次，自由采食。
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表 1 试验饲粮组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (DM basis) |
饲养试验结束前1周，采用内源指示剂法进行消化试验，测定消化能。饲养试验结束(130日龄)后，每个重复取1只兔屠宰，取样，测定各项指标。
1.3.1 消化道相对长度及相对重量屠宰后取出胃、十二指肠、空回肠、盲肠和结直肠，分别测量长度。用滤纸吸去表面水分，收集内容物后放入10 mL离心管中用于消化酶活性测定。清除消化道中内容物后，称量各段消化道重量。
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屠宰后，取出胃、十二指肠及空肠与回肠的食糜分别放入10 mL离心管中，-20 ℃冰箱保存备用。采用南京建成生物工程研究所生产的对应消化酶活性试剂盒，按照操作说明测定胃蛋白酶、十二指肠和空肠与回肠胰蛋白酶活性。
1.3.3 十二指肠组织形态屠宰后，剪取十二指肠肠管约1 cm，用生理盐水反复冲洗干净，置10%福尔马林固定液中固定。采用常规法制作石蜡切片，并在显微镜下观察。在每组中挑选2张切片，40倍视野进行拍照。应用Image-Pro Plus 6.0软件的40倍标尺为标准，测定绒毛高度(V)、隐窝深度(C)，并计算V/C值。
1.3.4 盲肠主要菌群数量屠宰后，取出盲肠食糜样本于冻存管，液氮速冻20 min后至-80 ℃冰箱保存备用。采用实时荧光定量PCR法，检测盲肠食糜样品中主要细菌的绝对量。细菌名称和引物信息见表 2。
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表 2 细菌引物信息 Table 2 Primer sequences of bacteria |
采用细菌基因组DNA(genomic DNA，gDNA)快速提取试剂盒(北京美亿美生物技术有限公司)，提取食糜样本中的gDNA，分光光度计测定浓度，稀释样品gDNA浓度到30~100 ng，取1 μL gDNA进行定量PCR，包括3个技术性重复。PCR反应体系按照10 μL PCR Mix、1 μL上游引物(5 μmol/L)、1 μL下游引物(5 μmol/L)、1 μL gDNA和8 μL ddH2O进行配制，在PCR仪器扩增。扩增产物连接T载体，测序确定构建的重组质粒的正确性。根据质粒的浓度和分子质量计算拷贝数，并进行梯度稀释，绘制标准曲线。定量PCR在StepOnePlus实时荧光定量PCR仪上进行。反应程序为95 ℃预变性10 min，95 ℃变性20 s、60 ℃退火30 s，40个循环。输出数据，根据标准曲线计算样品中的各细菌数量。
1.4 数据统计与分析试验数据使用SPSS 22.0软件中的one-way ANOVA程序进行分析，结果用“平均值、均值标准误(SEM)和P值”表示，采用Duncan氏法进行多重比较。使用Contrast中的线性和二次项做趋势分析，对差异显著的二次曲线数据做回归分析。以P < 0.05为差异显著。
2 结果与分析 2.1 消化道相对长度及相对重量由表 3可知，各组长毛兔胃、十二指肠、空肠与回肠、盲肠和结直肠的相对长度分别在0.19~0.21、1.22~1.41、5.26~5.85、1.12~1.18和2.53~2.93，相对重量分别在9.67~11.60 g/kg、5.12~6.61 g/kg、16.46~21.94 g/kg、8.80~10.19 g/kg和7.79~9.95 g/kg。饲粮dF/S对胃、十二指肠、空肠与回肠、盲肠和结直肠的相对长度和相对重量的影响均不显著(P>0.05)。
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表 3 饲粮可消化纤维与淀粉比对长毛兔消化道相对长度及相对重量的影响 Table 3 Effects of dietary dF/S on gastrointestinal tract relative length and relative weight of Angora rabbits |
由表 4可知，饲粮dF/S对长毛兔胃蛋白酶和十二指肠胰蛋白酶活性有显著影响(P < 0.05)，对空肠与回肠胰蛋白酶活性无显著影响(P>0.05)。饲粮dF/S为0.71组的胃蛋白酶活性显著高于饲粮dF/S为0.59、1.05和1.44组(P < 0.05)，饲粮dF/S为1.05和1.44组的十二指肠胰蛋白酶活性显著高于饲粮dF/S为0.59和0.71组(P < 0.05)。十二指肠胰蛋白酶和胃蛋白酶活性与饲粮dF/S有显著的线性相关关系(P < 0.05)。
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表 4 饲粮可消化纤维与淀粉比对长毛兔消化酶活性的影响 Table 4 Effects of dietary dF/S on digestive enzyme activities of Angora rabbits |
由表 5和图 1可知，饲粮dF/S为0.66组的十二指肠绒毛高度最高(1 079.97 μm)，隐窝深度最低(81.44 μm)，V/C值最大(13.67)，但各组间差异均不显著(P>0.05)。
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表 5 饲粮可消化纤维与淀粉比对长毛兔十二指肠组织形态的影响 Table 5 Effects of dietary dF/S on duodenal histomorphology of Angora rabbits |
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a、b、c、d、e分别代表饲粮可消化纤维与淀粉比为0.59、0.66、0.71、1.05、1.44组。 a, b, c, d and e represented groups with dietary dF/S of 0.59, 0.66, 0.71, 1.05 and 1.44, respectively. 图 1 长毛兔十二指肠组织形态(苏木精-伊红染色) Fig. 1 Duodenal histomorphology of Angora rabbits (HE dyeing, 40×) |
由表 6可知，盲肠总细菌数量以饲粮dF/S为0.59组最低，饲粮dF/S为1.05组最高，且饲粮dF/S为0.59和0.66组的盲肠总细菌数量显著低于其余各组(P < 0.05)。饲粮dF/S为1.05组的盲肠乳酸菌数量显著低于饲粮dF/S为0.66、0.71和1.44组(P < 0.05)，以饲粮dF/S为1.44时盲肠乳酸菌数量最高，但与其余各组(dF/S为1.05组除外)相比差异不显著(P>0.05)。饲粮dF/S对盲肠大肠杆菌、双歧杆菌和产气荚膜梭菌数量无显著影响(P>0.05)。饲粮dF/S与盲肠大肠杆菌数量间有显著的线性关系(P < 0.05)，与盲肠总细菌、乳酸菌数量之间有显著的二次曲线关系(P < 0.05)。依据表 7的回归分析结果可知，饲粮dF/S为1.19时，盲肠总细菌数量最多；饲粮dF/S为0.99时，盲肠乳酸菌数量最少，但由于二次曲线回归方程的决定系数(R2)较小(0.285 6)，由此推算出的极值参考意义不大。
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表 6 饲粮可消化纤维与淀粉比对长毛兔盲肠菌群数量的影响 Table 6 Effects of dietary dF/S on cecal bacteria community counts of Angora rabbits |
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表 7 长毛兔盲肠总细菌或乳酸菌数量(Y)与饲粮可消化纤维与淀粉比(X)的关系 Table 7 Relationships between dietary dF/S (Y) and cecal total bacteria or Lactobacillus counts of Angora rabbits (X) |
已往的研究表明，高纤维水平饲粮能够促进家兔消化器官的发育，原因在于其能量密度低，家兔的采食量相应增大，进而造成其消化器官长度和重量的加大以及消化道黏膜增生[12-13]。Chao等[14]研究表明，饲喂高酸性洗涤纤维水平饲粮会导致断奶至2月龄肉兔胃、小肠和盲肠的相对重量增加。饲粮中性洗涤纤维水平升高显著增加了2~3月龄新西兰肉兔盲肠重量及盲肠相对重量[15]。但另有研究则表明，饲粮中性洗涤纤维水平对家兔的胃、小肠和盲肠绝对重量无显著影响，但高水平的中性洗涤纤维显著增加了肠道的相对重量[16]；饲粮中性洗涤纤维水平显著影响断奶至3月龄獭兔的胃、小肠和盲肠的相对重量[17]。孙佳易等[18]报道，饲粮纤维源及水平对肉兔胃、十二指肠、空肠与回肠、盲肠的相对长度以及胃、十二指肠、盲肠的相对重量均无显著影响。以上报道仅是针对饲粮纤维(中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、粗纤维)这一个因素对家兔肠道发育的研究，研究结果也不尽相同。朱岩丽等[19]研究表明，高淀粉低中性洗涤纤维饲粮能够显著促进肉兔胃肠道发育，而高中性洗涤纤维饲粮没有表现出增加胃容积，并获得了饲粮中性洗涤纤维/淀粉为1.4~1.9时才能促进胃肠道的发育的结论。本研究表明，饲粮dF/S对长毛兔的相对长度及相对重量无显著影响，与上述文献结果不完全一致，可能的原因是：1)高纤维饲粮会促进胃肠道发育，主要是针对低消化纤维(纤维素、酸性洗涤纤维、木质素)而言，高水平的中性洗涤纤维导致的肠道重量增加，主要与中性洗涤纤维中的木质素有关。本试验是将dF与淀粉结合起来进行研究，该结果也进一步说明了dF对淀粉的可替代性。2)本试验选取的是83日龄刚刚经历第1次剪毛的长毛兔，与文献中家兔的生理阶段不同；另外，长毛兔与肉兔、獭兔的生长发育规律也不同。3)试验所用纤维源及纤维类型与文献中不一致。
3.2 饲粮dF/S对长毛兔消化酶活性的影响消化酶对动物体内营养物质的吸收利用至关重要，消化酶活性也是反映动物生产性能及消化率高低的重要指标之一。例如，动物对蛋白质消化能力的强弱可以通过肠道食糜中胰蛋白酶的活性反映出来。崔文典[20]研究表明，在一定范围内，幼兔肠道食糜中的胰蛋白酶活性随饲粮纤维水平的升高而降低。晁洪雨等[21]报道，随着饲粮酸性洗涤纤维水平的升高，3月龄肉兔胰蛋白酶的活性有先上升后下降的趋势。周勤飞等[9]报道，肉兔十二指肠胰蛋白酶活性在饲粮dF/S为0.99时达到最高，但各组间无显著差异。本研究结果表明，饲粮dF/S越大，十二指肠胰蛋白酶活性越高。此结果与Hemid等[22]报道的随着饲粮淀粉和蛋白质水平的降低，肉兔胃、回肠、盲肠淀粉酶和蛋白酶的活性显著增加的结果不同，可能是由于文献中在降低淀粉水平的同时还降低了蛋白质水平所致，也可能是随着淀粉水平的降低，食糜在胃中停留时间变短所致。因此，在制作长毛兔配合饲料时，可考虑适当加大饲粮dF/S，改善长毛兔的消化能力。
3.3 饲粮dF/S对长毛兔十二指肠组织形态的影响养分吸收大部分在小肠中完成，因此十二指肠的形态结构能够反映动物吸收养分的能力，肠绒毛的存在极大增加了小肠的吸收面积。研究表明，纤维水平显著影响鹅的十二指肠绒毛高度[23]。晁洪雨等[21]报道，随着酸性洗涤纤维水平的增加，肉兔十二指肠的肠绒毛高度有先增加后降低的趋势。隐窝深度反映肠道内细胞的产生率，深度变浅表明基部细胞发生率降低，上皮细胞成熟率上升，养分的吸收能力增强。Serena等[24]的试验结果显示，饲喂母猪高纤维水平饲粮显著增加了母猪肠道的隐窝深度。V/C值越大，表明反映肠黏膜发育越好，吸收能力越强。朱岩丽等[19]报道，随着饲粮中性洗涤纤维水平的降低和淀粉水平的升高，肉兔十二指肠绒毛高度先升高后降低，但对隐窝深度和V/C值无显著影响。本试验研究表明，饲粮dF/S为0.66组的绒毛高度最高、隐窝深度最浅、V/C值最大，但各组间无显著差异，与以上研究结论略有出入，这与纤维来源、营养水平、动物生长时期及所研究的因素不同有关。
3.4 饲粮dF/S对长毛兔盲肠菌群数量的影响家兔盲肠作为纤维消化的主要场所，是利用微生物产生的酶或代谢产物来分解纤维。研究表明，无论是纤维水平[25]还是中性洗涤纤维与淀粉比[19]，均显著影响肉兔盲肠菌群结构，但有关纤维与淀粉比对家兔肠道菌群数量影响的研究则少见报道。饲粮中添加纤维可以增强鸡和猪的胃肠道功能，改变肠道菌群的组成和数量[26]。由于饲粮纤维影响家禽的胃及小肠和盲肠pH，因此纤维停留时间越长，消化液分泌越多，从而影响盲肠菌群数量的平衡[27]。淀粉一直被认为是导致家兔肠道不良菌群出现的诱因，但是淀粉摄入和消化紊乱之间的关系仍存在争议。
双歧杆菌和乳酸菌能够合成维生素、氨基酸等营养物质，还能产生分解纤维成分的酶类，参与家兔体内的营养物质消化代谢，属于肠道正常的厌氧菌群，其大量繁殖能够作为肠道的生物屏障。细菌代谢产物中的乙酸和乳酸等能够形成酸性环境，杀死不耐酸的大肠杆菌。谷子林等[28]研究表明，饲粮纤维水平对断乳仔兔盲肠菌群数量有较大影响，以12%纤维水平组盲肠有益菌的数量占有绝对优势，过低的纤维水平会导致大肠杆菌、沙门氏菌数量增加。本试验结果表明，饲粮dF/S为1.05组长毛兔盲肠总细菌数量最高，乳酸菌数量最低，而饲粮dF/S为1.44组的乳酸菌数量最高。各组长毛兔盲肠双歧杆菌和乳酸菌数量均大于大肠杆菌和产气荚膜梭菌数量，表明饲粮dF/S在0.59~1.44时不会破坏长毛兔盲肠菌群的平衡。
4 结论综上可知，在本试验条件下，适宜的饲粮dF/S有利于提高长毛兔胃蛋白酶活性，dF/S越高十二指肠胰蛋白酶活性越高，同时不影响消化道发育和十二指肠组织形态，也不会破坏盲肠菌群平衡。综合本试验结果并结合前期生长性能数据，推荐长毛兔饲粮适宜dF/S为0.71~1.05(可消化纤维水平为18.78%~22.98%，淀粉水平为26.44%~21.89%)。
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