近年来，随着我国农业生产技术水平的不断提高，粮食产量逐年攀升，导致农作物秸秆的数量也在不断增加。有效利用农作物秸秆作为饲料资源不仅可缓解人畜争粮这一矛盾，还可以降低秸秆处理的成本并减少焚烧处理带来的环境污染。然而秸秆细胞壁结构复杂，难以被动物消化吸收，从而造成秸秆的堆积浪费。玉米秸秆由细胞壁中的木质素和半纤维素相互交联并将纤维素镶嵌于内，以牢固的醚键或酯键连接；同时，木质素又包围着纤维素形成一种外围基质，致使微生物和酶对半纤维素、纤维素的降解受到限制，而且动物体内又缺乏降解木质素的酶^[1]，导致家畜对玉米秸秆的利用率较低。通过黄贮，既可降低秸秆的纤维组分含量，又可改善发酵品质，还有利于长期保存^[2]。冯冲凌^[3]在堆肥中接入黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)，其木质素降解率较对照组提高了10.9%；Zhi等^[4]通过试验对小麦秸秆在30 ℃条件下固态发酵12 d，其木质素降解率达到(28.5±1.3)%，使木质纤维素结构明显破坏；Chen等^[5]在玉米秸秆和低芥酸菜子残渣中接种黄孢原毛平革菌，结果表明，其纤维素和木质素含量分别降低了40.0%和64.3%。国内外有关秸秆黄贮的研究多集中在乳酸菌及产纤维素酶细菌等方面，但如果不解决木质素的问题，其纤维素酶的降解作用也会受到影响。黄孢原毛平革菌是白腐真菌的一种，其分泌的锰过氧化物酶、漆酶、木质素过氧化物酶等胞外酶可有效降解秸秆中的木质素，使原本被木质素包裹的纤维素、半纤维素释放出来^[6]。而纤维素酶、木聚糖酶可直接或间接通过物理或化学的作用使秸秆整个纤维结构得到膨胀和破坏^[7]。因此，本研究拟使用菌酶复合制剂对玉米秸秆进行混合发酵，探讨其最佳发酵条件，以期为提高玉米秸秆的饲用价值提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 菌种和酶制剂

黄孢原毛平革菌CICC 40299购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，活菌数为1×10⁸ CFU/mL；纤维素酶活性≥100 00 U/g；木聚糖酶活性≥300 00 U/g。

1.1.2 玉米秸秆

玉米秸秆购自大庆市周边农户，在自然风干后，用粉碎机切至1~2 cm。

1.1.3 培养基

马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养：马铃薯浸粉3 g，葡萄糖20 g，琼脂14 g。黄孢原毛平革菌液体种子培养基：马铃薯提取液1 L，葡萄糖20 g，KH₂PO₄ 3 g，MgSO₄·7H₂O 1.5 g，维生素B₁微量。121 ℃灭菌15 min。

1.1.4 菌种培养

菌种活化：将黄孢原毛平革菌冻干菌粉接种到PDA培养基上，在28 ℃条件下培养5 d，并转接活化2次，放于4 ℃保存备用。

液体菌种培养：将PDA培养基上的黄孢原毛平革菌接种到黄孢原毛平革菌液体种子培养基中，于28 ℃、150 r/min条件下振荡培养7 d。

1.2 试验方法 1.2.1 发酵条件的筛选

在固态发酵条件下，通过均匀设计^[8]对纤维素酶和木聚糖酶添加量、黄孢原毛平革菌接种量以及发酵天数进行筛选试验，水分含量调节至60%~65%。均匀设计因素水平见表 1。

1.2.2 发酵条件的验证

将切短至1~2 cm的玉米秸秆按均匀设计筛选的最佳发酵条件，添加菌酶复合制剂，并将水分含量调节至60%~65%，装入33 cm×40 cm聚乙烯袋内，每袋1 kg，用真空包装机(AT-620)抽真空并封口，室温下(25~32 ℃)发酵19 d。发酵验证试验设置3个重复，开封后用于样品测定。

1.3 指标测定 1.3.1 常规营养成分含量的测定

酸性洗涤木质素(ADL)、中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维(ADF)含量参考范氏洗涤纤维分析法^[9]测定。常规营养成分含量参照《饲料分析及饲料质量检测技术》^[10]测定。试验中中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维降解率按以下公式计算：

式中：m₁为空袋质量；m为样品质量；m₂为提取处理后样品残渣+滤袋质量；c₁为空白袋子校正系数(烘干后质量/原来质量)。

1.3.2 发酵秸秆感官评定

开封后立即称取发酵秸秆样品20 g，加入180 mL蒸馏水，用均质器拍打90 s使其充分混匀，再进行过滤，滤液用于测定饲料pH及有机酸。按青贮饲料质量评定标准进行感官评定，分别从气味、色泽、质地、含水率、pH进行综合评定^[11]。100分分配：pH为25分，含水量为20分，色泽为20分，气味为25分，质地为10分。75~100分为优等，51~76分为良好，26~50为一般，25分及以下为劣质。

1.3.3 有机酸和氨态氮(NH₃-N)浓度的测定

有机酸浓度采用安捷伦1200型高效液相色谱仪测定：有机酸专用色谱柱300 mm×7.8 mm，折光检测器，柱温为55 ℃，压力为32 bar，流速为0.55 mL/min；流动相为0.1%硫酸水溶液。取经低速离心后的秸秆滤液5 mL加25%的偏磷酸1 mL混匀，取混合液体1 mL在4 ℃、12 000 r/min离心15 min，将上清液用0.22 μm水膜缓慢过滤后，即刻用注样器上机测定有机酸浓度，上样量为5 μL，通过外标法计算。氨态氮浓度参照冯宗慈等^[12]的方法测定。

1.4 数据处理

试验数据使用Excel 2016软件整理，采用DPS V7.05软件的均匀设计模块对数据进行多元二次逐步回归分析。最佳发酵条件验证试验运用SPSS 19.0统计软件的独立样本t检验方法，试验数据用平均值±标准误表示。

2 结果与分析 2.1 回归方程的建立

中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维降解情况见表 2。以纤维素酶(X₁)、木聚糖酶(X₂)、黄孢原毛平革菌(X₃)、发酵天数(X₄)作为自变量，以中性洗涤纤维降解率(Y₁)、酸性洗涤纤维降解率(Y₂)作为因变量，利用多元二次逐步回归建立回归方程。

中性洗涤纤维降解率的回归方程：

式中：Y₁为中性洗涤纤维降解率(%)；X₁为纤维素酶添加量(g/kg)；X₂为木聚糖酶添加量(g/kg)；X₃为黄孢原毛平革菌接种量(%)；X₄为发酵天数(d)。

经优化后的发酵条件分别为X₁=0.20、X₂=0.12、X₃=20、X₄=19.07，在优化条件下预测中性洗涤纤维降解率为22.59%。

酸性洗涤纤维降解率的回归方程：

式中：Y₂为酸性洗涤纤维降解率(%)；X₁为纤维素酶添加量(g/kg)；X₂为木聚糖酶添加量(g/kg)；X₃为黄孢原毛平革菌接种量(%)；X₄为发酵天数(d)。

经优化后的发酵条件分别为X₁=0.20、X₂=0.13、X₃=20.01、X₄=19.24，在优化条件下预测酸性洗涤纤维降解率为20.80%。

由表 3可知，F₁，F₂>F₄²=6.94(α=0.05)，P＜0.05，回归方程具有显著意义。理论最佳发酵条件为：纤维素酶添加量0.2 g/kg，木聚糖酶添加量0.1 g/kg，黄孢原毛平革菌接种量20%，发酵天数19 d。

2.2 最佳发酵条件验证

为了验证试验模型的准确性，在上述优化条件下进行发酵结果验证。并继续探究菌酶复合制剂发酵秸秆的发酵品质。采用上述最佳发酵条件，实际测得观测值如表 4所示。菌酶复合制剂发酵秸秆的粗蛋白质、干物质含量分别较未发酵秸秆提高了60.00%和3.75%(P＜0.05)，酸性洗涤木质素含量较未发酵秸秆降低了6.95%(P＜0.05)；菌酶复合制剂发酵秸秆的中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维含量分别较未发酵秸秆降低了23.47%、20.13%(P＜0.05)，与预测值(22.59%和22.80%)差距不大，试验相对误差分别为3.91%、3.22%，相对误差较小，可以较好地反映发酵效果，为以后大规模发酵提供理论依据。

2.3 发酵品质的验证

由表 5可知，菌酶复合制剂发酵秸秆pH显著低于未发酵秸秆(P＜0.05)，表明添加菌酶制剂可有效降低发酵物的pH；在色泽、气味、质地感官评价方面，发酵秸秆品质明显优于未发酵秸秆，接近优质发酵。

2.4 有机酸和氨态氮含量

由表 6可知，菌酶复合制剂发酵秸秆，乳酸含量显著高于未发酵秸秆(P＜0.05)，氨态氮含量显著低于未发酵秸秆(P＜0.05)，乙酸、丙酸含量差异不显著(P>0.05)，丁酸未检出。

3 讨论

均匀设计法只考虑试验点在试验范围内均匀分布，与正交试验相比，可大大减少试验次数，从而节约时间、节约资源，适合用来优化工艺筛选条件。本试验采用均匀设计法对菌酶复合制剂的最优发酵条件进行试验，通过逐步回归分析得到菌酶复合制剂的最佳组合，经验证试验得到的中性洗涤纤维降解率、酸性洗涤纤维降解率与预测值相符。

发酵饲料成功的关键在于提供适宜的条件。为创造厌氧环境要把原料压实，而水分含量过低，不易压实，所以一般将发酵饲料适宜的水分含量调整为65%~70%^[13]。本试验通过黄孢原毛平革菌固体发酵所产生的3种酶系破坏木质素的复杂结构^[6]，酸性洗涤木质素含量降低6.95%，可释放出纤维素和半纤维素，再利用酶制剂的高效性对纤维素和半纤维素进行降解，以期提高玉米秸秆的营养价值。发酵结束后玉米秸秆的感官评定和营养成分含量的变化表明，添加菌酶复合制剂可以显著提高发酵饲料的品质。与未发酵秸秆相比，发酵后秸秆均具有酸香味、松散不黏手且呈淡黄色。同时，粗蛋白质和干物质含量均有所提高，pH、中性洗涤纤维与酸性洗涤纤维含量降低。Song等^[14]通过纤维素酶-木聚糖酶共同处理使玉米秸秆转化率达到48.5%，并且证实了纤维素酶-木聚糖酶的协同作用高于单一酶处理。毛建红^[15]通过添加纤维素酶、果胶酶、布什乳酸杆菌发酵玉米秸秆后，中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、纤维素、半纤维素含量显著降低，改善了秸秆营养品质。张仲卿等^[16]用拟康宁木霉和黄孢原毛平革菌混合发酵玉米秸秆，试验表明混合发酵均高于单一菌株发酵，其纤维素和木质素降解率分别达到36.80%和28.87%。本试验结果与上述相关研究结果一致。具有不同降解功能的微生物之间存在互生和共生的关系^[17]，将其进行适当比例的组合可能会取得更好的应用效果。一般认为，pH在4.0以下为优质发酵饲料。薛艳林等^[18]在秸秆发酵中添加生物制剂可有效提高发酵饲料品质，迅速降低pH，抑制有害微生物的增殖，减少饲料营养物质的损失，使发酵饲料留存更多的营养物质。郭萌萌^[19]通过添加乳酸菌、酵母菌、芽孢杆菌等复合菌发酵玉米秸秆，将发酵环境中pH降低至适宜的pH，从而控制有害菌的增长。在本研究中，添加黄孢原毛平革菌和纤维素酶后，pH迅速降低，且未出现增高现象，使得发酵品质得到明显改善。

本试验中，发酵秸秆乳酸含量显著高于未发酵秸秆，乳酸的产量与发酵饲料的品质有直接影响，乳酸的产生可有效抑制其他腐败菌的生长。菌酶复合制剂发酵秸秆较高的乳酸含量可能由于纤维素酶和黄孢原毛平革菌共同分解植物细胞壁，从而增加降解菌可利用的发酵底物，将碳水化合物进行生物降解，转化为有机酸。与未发酵秸秆相比，在整个发酵过程中菌酶复合制剂发酵秸秆的pH较低，这可能导致发酵秸秆氨态氮含量降低。本试验结果与在玉米秸秆青贮中添加乳酸菌及纤维素酶混合发酵改善青贮发酵品质的结果一致^[20-21]。

杨世帆等^[22]研究表明，乙酸含量产生与青贮品质呈负相关，对黄贮也是如此，乙酸会使发酵饲料产生酸味，降低适口性，并产生刺鼻的气味。丁酸是发酵中应尽量避免出现的有机酸，丁酸是源自含氮化合物的分解，使蛋白质分解，并降低其营养价值。本试验中，丙酸和乙酸含量与未发酵秸秆相比均无显著差异，发酵前后均未检测出丁酸，说明添加黄孢原毛平革菌和纤维素酶可提高玉米秸秆的发酵效果，且无有害酸产生。

贾晶霞等^[23]在研究玉米秸秆发酵过程中粗蛋白质含量呈上升趋势，这是因为微生物大量利用原料中的可溶性糖，而利用其蛋白质较少，从而使粗蛋白质相对含量升高。李川东等^[24]认为，在发酵过程中微生物的相互竞争死亡所产生出的菌体蛋白，增加了蛋白质含量。岳丽等^[25]通过添加黑曲霉和产朊假丝酵母发酵甜高粱秸秆，将粗蛋白质含量提高至18.79%^[26]。混合发酵可产生酶系互补的作用，且对合成一系列酶过程具有一定的反馈调节作用，从而增加蛋白酶和纤维素酶的活性。本试验中，发酵秸秆的粗蛋白质含量显著高于对照组，可能是黄孢原毛平革菌通过对木质素结构的破坏释放出来的纤维素和半纤维被纤维素酶分解为单糖，促进菌丝的生长，增加菌体蛋白，从而提高了发酵秸秆中粗蛋白质的含量。玉米秸秆具有一定的营养价值，但木质素、纤维素含量过高，严重影响其利用价值^[27]。本研究中，发酵秸秆的酸性洗涤木质素、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维含量显著低于未发酵秸秆，提高了秸秆的利用价值。在色泽、气味、质地感官评价方面，发酵秸秆品质明显优于未发酵秸秆，接近优质发酵。

4 结论

通过均匀设计筛选出最佳发酵条件为：纤维素酶添加量0.2 g/kg、木聚糖酶添加量0.1 g/kg、黄孢原毛平革菌接种量20%、发酵天数19 d，此条件下中性洗涤纤维降解率为23.47%，酸性洗涤纤维降解率为20.13%。在最佳发酵条件下，该菌酶复合制剂发酵玉米秸秆可显著提高秸秆的发酵品质和营养价值。