随着生活水平的提高，人们对肉食品的需求量日益增多。肉鸡因其耗料少、生长迅速、肉质鲜美和生长周期短等原因，养殖规模得到迅速发展。然而，随着规模化和集约化程度的提高，肉仔鸡在生长过程中会面临诸多应激原(不良环境因素、疾病因素及饲养管理不当等)，这些应激原能够直接或间接地引起机体免疫状态的改变，从而诱发机体产生免疫应激，对生产性能产生不利影响^[1]。所以，在生产中养殖者通常使用抗生素来维持畜禽生长性能和健康状况，而抗生素的使用会导致动物产生抗菌素耐药性和畜产品药物残留的问题^[2]。因此，饲料中“禁抗”呼声日益增强，而且我国从2020年7月1日起已明令禁止饲料生产企业生产含有促生长类药物饲料添加剂的商品饲料。所以，寻找安全有效的饲用抗生素替代品成为目前家禽行业亟需解决的重要课题之一。其中，黄酮类化合物因其天然属性和广泛的生物学作用，有望成为饲料添加剂中潜在的抗生素替代品。以往的众多研究已表明，黄酮类化合物不仅可以显著增加肉鸡饲料效率及平均日增重^[3]，而且在肉鸡生产中能够发挥抗菌、抗炎、抗氧化和免疫调节等多种生物学作用^[4]。然而，尽管黄酮类化合物已被反复证明具有较强的免疫调节特性^[5]，但尚未完全阐明该作用的确切机理。因此，本文旨在综述黄酮类化合物在肉鸡免疫应激过程中发挥的作用及其可能的作用机制，为今后黄酮类化合物作为饲料添加剂提供一定的理论参考。

1 免疫应激的产生及其在肉鸡生产中的危害

免疫应激又称免疫激发，是指机体处在亚健康状况或生长环境较差的肉鸡在生产过程中接种疫苗或受到病原侵袭出现体温升高、食欲减退、生长减缓的现象。当肉鸡受到病毒、细菌、寄生虫等因素的侵害就会产生免疫应激，进而导致免疫抑制性疾病的产生，比如临床常见的免疫抑制疾病包括传染性法氏囊病、马立克氏病和鸡传染性贫血等^[6]。应激条件下，家禽常表现为发烧、嗜睡、采食量下降等现象，而采食量的降低直接导致畜禽对营养物质摄入减少，从而造成生长减缓，其中最直接表现为运动迟缓，采食量、饲料转化率下降，严重时死亡率升高^[7]。研究表明，免疫应激容易造成机体自身系统的紊乱，导致原本可用于生产的养分转而用于合成免疫效应分子来抵抗炎性症状，最终引起机体蛋白质、脂肪等其他物质合成代谢减弱，分解代谢能力增强，对肉鸡生长状态产生不利影响^[8]。另外，免疫应激容易造成家禽免疫器官形态发生改变，引起免疫功能的多项指标如T细胞数量、自然杀伤(NK)细胞数量及细胞溶解活性、细胞因子分泌、淋巴细胞增殖等下降，导致家禽对疾病的易感性增加^[9]。因此，家禽在免疫应激时产生的调节因子对机体养分重分配、物质代谢和生长等影响具有全身效应，若不能及时有效防止机体在生产过程中产生应激，将对肉鸡养殖业造成极大的潜在危害。

2 黄酮类化合物在肉鸡生产中的免疫调节作用

研究者在摒弃了传统的饲用抗生素后，将更多的研究目光集中到了植物天然组成成分上。其中，黄酮类化合物是植物经光合作用产生的一大类低分子量的天然物质，广泛存在于植物的根、茎、叶、花和果实中^[10]。迄今为止，已9 000多种黄酮类化合物被发现，它们常以糖基化或酯化形式存在，由C6—C3—C6环组成，即通过三碳环C连接的环A和环B。而受B环连接位置及C环形状的不同，不同黄酮类化合物在发挥免疫和抗氧化作用时存在剂量差异性^[11]；但因其化学结构稳定而且具有广泛的生物学作用，可作为饲料添加剂原料用于生产实践，成为当今研究的热点之一。

2.1 黄酮类化合物对肉鸡免疫器官的影响

对畜禽而言，最主要的免疫器官包括胸腺、脾脏和法氏囊，而机体免疫力的强弱受免疫器官发育情况的影响。一般认为免疫器官指数升高能够增强免疫力，相反若是受免疫抑制的影响，免疫器官指数则降低。研究发现，饲粮中添加5 mg/kg的染料木黄酮或20 mg/kg的橙皮苷可提高肉鸡法氏囊、脾脏(21日龄)和胸腺(42日龄)的免疫器官指数^[12]；随后在肉鸡感染球虫的研究中也有类似的发现，胸腺和法氏囊指数剂量依赖性地随饲粮中柑橘乙醇提取物的增加而增大^[13]。胸腺作为T细胞产生、发育和成熟的主要场所，其组织形态的变化与体液免疫联系紧密，而受大豆异黄酮的影响后胸腺指数显著增加，这一结果证实了大豆异黄酮在家禽体内发挥的免疫调节机能^[14]。脾脏因分布着大量的淋巴细胞及淋巴小体，所以是畜禽重要的外周免疫器官，当饲粮中添加200 mg/kg黄岑黄酮后，肉仔鸡(35日龄)免疫器官指数得到显著改善；这一试验结果表明，黄岑黄酮能够促进肉鸡免疫器官的发育，并有效提高机体免疫能力^[15]。而且在随后的研究中发现，饲粮中添加1.6 g/kg的竹叶黄酮或1.0 g/kg的槲皮素均一定程度地改善肉鸡免疫器官指数，增强机体免疫能力^[16-17]。

2.2 黄酮类化合物对肉鸡体液免疫的影响

在畜禽养殖过程中，肉鸡不断遭受到各种应激，这不仅会降低生长性能，而且干扰及破坏免疫稳态，并抑制免疫相关基因的表达。免疫系统是一个遍布全身的网络，当外界有害物质入侵时可以自动抵抗。免疫系统的结构复杂，除免疫器官外，还包括免疫因子(非特异性免疫分子、特异性免疫分子和免疫相关分子)。免疫系统中的免疫因子在调节免疫反应中起着非常重要的作用。免疫球蛋白是类似于具有抗体活性或化学结构的抗体球蛋白，能够决定体液免疫程度^[18]。张鹏飞^[19]通过腹腔注射脂多糖(LPS)引起肉鸡免疫应激反应，造成血清中免疫球蛋白含量的增加，但饲粮中添加1 000 mg/kg的艾蒿水提物有效缓解了血清中免疫球蛋白G(IgG)含量的过度升高，使炎性症状得到缓解，这一情况的发生可能与艾蒿水提物中含有黄酮类化合物有关；随后，通过乙醇沉淀技术除去水提物中的多糖，利用剩余部分刺激体外培养的淋巴细胞，结果显著增加了淋巴细胞培养液中免疫球蛋白M(IgM)含量，这进一步证实了艾蒿黄酮对机体体液免疫具有促进作用。利用大肠杆菌攻毒能够引起肉鸡体液免疫的抑制，降低血液中免疫球蛋白A(IgA)含量，但在饲粮中添加40 mg/kg的染料木黄酮后，血液中淋巴细胞比例升高，提高了血液中IgA含量，从而增强了机体免疫力^[20]。其他黄酮类化合物作为饲料添加剂也有类似的作用被发现：饲粮中添加400 mg/kg的飞机草总黄酮可显著提高血清中IgM和IgG含量，增强机体补体激活、病毒中和等能力，提高肉鸡的免疫功能^[21]。另外，梁英等^[15]的研究表明，饲粮中添加10 mg/kg黄岑黄酮可显著增加肉鸡血清中IgA和IgG含量，有效抵御病原菌入侵呼吸道和肠道，显著改善肉鸡体液免疫。

2.3 黄酮类化合物对肉鸡细胞免疫的影响

由T淋巴细胞介导的细胞免疫是一个连续过程，通过特异性识别抗原，T细胞增殖分化并产生淋巴因子来响应外来抗原的攻击，从而放大免疫应答^[22]，因此是评价细胞免疫重要的指标。在肉鸡饲养过程中常因环境中菌群(大肠杆菌)的感染影响外周血单核细胞的吞噬能力，诱导其适应性T细胞反应发生变化，导致促炎因子白细胞介素(IL)-17A的分泌，同时使抗炎因子IL-10和干扰素-γ(IFN-γ)的分泌受阻^[23]，而且菌群感染还会诱导血液中白细胞转录组发生改变，造成白细胞的细胞因子受体表达增加，加重炎症反应，提高CD4、CD5、CD28免疫细胞的表达^[24]。Klaudia等^[25]通过腹腔注射LPS造成肉鸡脾脏CD3⁺、CD4⁺和CD8^-数量的增加，影响机体对病原菌的免疫应答反应，随后通过外周血淋巴细胞培养试验证实，大肠杆菌和LPS感染能够引起外周血淋巴细胞中CD3⁺和CD4⁺比例的增加，影响细胞免疫机能。但是饲粮中添加40 mg/kg的染料木黄酮后显著降低了大肠杆菌诱导的肉鸡外周血淋巴细胞CD3⁺、CD4⁺和CD8^-的升高，造成这一情况的原因可能是因为大豆异黄酮通过酪氨酸激酶抑制阻碍核因子-κB抑制因子α(IκBα)的降解，严重影响核因子-κB(NF-κB)及IL-17的产生^[26]。

外界不良因素会造成淋巴细胞形态学的改变，从而转化成非成熟母细胞，因此淋巴细胞转化率对机体免疫力具有显著调节作用。研究发现，饲粮中添加20 mg/kg元宝枫黄酮能够显著增加肉鸡脾脏T淋巴细胞转化率^[27]；而且饲粮中添加500和1 000 mg/kg的皂角刺黄酮同样引起肉鸡T、B淋巴细胞的转化率升高，但高水平的添加剂量(5 000 mg/kg)反而会引起淋巴细胞转化率的降低，这说明了黄酮化合物对提升肉鸡免疫机能是有效的，但要保证黄酮添加量的适宜性^[28]。

细胞因子作为评估机体细胞免疫能力另一重要指标，在免疫应答中发挥关键性作用^[29]。当外部条件不利于畜禽生长时会诱导机体产生炎症细胞因子(如IL-1、IL-6)进而诱发宿主的免疫应激。Wu等^[30]通过注射LPS建立肉鸡急性炎症模型，显著增加了炎性细胞因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-6、IL-1β和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的产生，而试验组中随花青素含量的增加促炎因子显著降低，同时促进了IL-4和IL-10的产生，造成这一结果的原因可能是花青素通过调节巨噬细胞活性，从而使促炎因子的分泌趋于正常，产生的抗炎因子能够拮抗IFN-γ并抑制炎症反应。家禽血清中IL-4的含量受到一系列条件的限制，例如饲养环境、冷/热应激和炎症反应，在免疫反应时IL-4通过与靶细胞表面的IL-4受体特异性结合而发挥相关作用。先前的试验表明，大豆异黄酮可通过增加磷酸酶-1的DNA活性来上调IL-4的表达，从而显著增加血清IL-4的含量^[31]。同样，在Yang等^[32]的研究中发现，槲皮素作为饲料添加剂(0.06%)显著增加了血清IL-4的含量，这一发现表明槲皮素可显著影响艾拔益加肉鸡中细胞因子的分泌。

3 黄酮类化合物对机体免疫调节作用的分子机制

多项研究表明，NF-κB被认为是免疫反应的关键调节剂，可以引发和放大炎症，而且在获得性免疫反应中发挥基础调节作用，并参与胚胎发育、淋巴细胞生成和骨形成的调控^[33]，因此，抑制NF-κB途径可能是治疗慢性炎症性疾病的有效靶点。许多参与免疫反应启动的免疫介质及细胞因子在转录水平上受到NF-κB的调控，如TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8等多种促炎因子以及iNOS和环氧合酶-2(COX-2)等。TNF-α和IL-1β的表达水平与免疫应激程度呈正相关，当受到NF-κB调控时，二者又进一步促进NF-κB的激活，促进其他炎性介质的释放，引起级联反应^[34]。李慧^[34]的研究表明，芹菜素和木犀草素对NF-κB下游调控的COX-2 mRNA的表达具有较好的抑制作用，该团队前期的研究发现，LPS处理肉鸡淋巴细胞后可以激活NF-κB信号通路，从而诱发炎性因子IL-1和TNF-α的过度表达。以上结果表明，黄酮类化合物通过NF-κB信号通路能够对炎性细胞因子的产生及基因表达具有显著影响。随后进一步的深入研究发现，NF-κB通过与核因子-κB抑制因子(IκB)形成复合物或发生解离来调控其转录活性。Jiang等^[35]通过蛋白印迹技术的研究发现，经LPS诱导能够引起巨噬细胞IκBα及NF-κB p65磷酸化，进而促进下游IFN-γ分泌，参与炎症的发生；然而，试验组黄芪黄酮对LPS诱导的IκBα的作用呈剂量依赖性抑制，同时限制了NF-κB p65的磷酸化和核移位，从而抑制了NF-κB途径，达到缓解炎症效果。Lee等^[36]用LPS诱导肉鸡产生炎症反应，但是饲粮中添加0.4%的樟芝粉后NF-κB信号通路被有效抑制，肝脏中IκBα和NF-κB的基因表达和蛋白表达水平显著降低，细胞因子IL-1β和IL-6的分泌减少，有效缓解了LPS诱导的炎症反应，而这一结果与樟芝粉中含有大量的黄酮化合物有着密切关系。当肉鸡生长过程中受到外界不良环境因素刺激时容易造成IκBα磷酸化程度增加，促进NF-κB进入细胞核中引起炎症反应，但饲粮中添加0.06%的槲皮素能够显著抑制肉鸡脾脏中IκBα基因表达，促进IFN-γ的分泌，从而增强机体免疫力^[32]。但是，IκB的降解是一个快速诱导信号，受核因子-κB抑制因子激酶(IKK)的磷酸化激活，而IKKβ在NF-κB信号通路经典途径的激活中发挥着不可取代的作用。迄今为止，关于黄酮类化合物抑制NF-κB信号通路的研究主要集中于下游靶点，而忽视了上游靶点IKKβ对NF-κB信号通路的调控作用^[37]。陈小妮^[38]研究发现，利用小干扰RNA(siRNA)慢病毒技术沉默IKKβ基因，可使信号通路上基因磷酸化水平受到影响，有效阻断NF-κB信号通路，造成下游相关炎性因子TNF-α和IL-8表达下调。由此可见，IKKβ基因在激活NF-κB信号转导时具有关键性作用。但在肉鸡生产中，黄酮类化合物对NF-κB信号通路的影响是否通过作用于IKKβ基因而达到，还有待进一步的研究，这也为下一步的研究方向提供了新思路。

而近年来的研究发现，黄酮类化合物可通过激活Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1-Nrf2-抗氧化反应元件(Keap1-Nrf2-ARE)抗氧化信号通路，一方面提高畜禽抗氧化能力，另一方面表现出优秀的免疫调节作用^[39]。Yao等^[40]的研究证实，汉黄芩素不仅能够抑制LPS诱导的单核巨噬细胞中IκB、IKKβ磷酸化，进而抑制NF-κB的核移位，而且能够显著提高Nrf2的活化程度，当对Nrf2基因沉默时，汉黄芩素的抗炎活性也显著降低，这也验证了Nrf2信号通路在免疫调节方面有着重要作用。鸡毒支原体感染容易引起肉鸡呼吸道炎症反应，严重时造成免疫器官及淋巴细胞的衰竭，而在Ishfaq等^[41]的研究中发现，饲粮中添加450 mg/kg的黄芩苷显著增加了肉鸡脾脏中Nrf2 mRNA和蛋白表达水平，激活Nrf2信号通路，并抑制NF-κB和促炎因子，从而增强了肉鸡对病原体的防御机制。随后Wang等^[42]对肉鸡的研究发现，黄曲霉素能够诱导肉鸡肝损伤，下调Nrf2及下游基因mRNA表达水平；此外，经蛋白印迹分析表明，黄曲霉素组的Nrf2、谷胱甘肽硫转移酶mu 2(GSTM2)及谷胱甘肽硫转移酶mu 3(GSTM3)蛋白表达水平显著降低，然而，饲粮中添加5.0 mg/kg的姜黄素可以剂量依赖性的减轻由黄曲霉素诱导的肉鸡肝损伤，缓解Nrf2及下游基因mRNA表达水平的降低，从而表现出对炎性症状的缓解作用。另外一些研究发现经Nrf2信号通路产生的抗炎作用离不开NF-κB信号通路的共同参与，Lee等^[43]首次发现，IKKβ可与解离后的受体蛋白Keap1结合促进IKKβ泛素化降解，进而降低对IκB的激活，由此推测Keap1-Nrf2信号通路可以缓解炎性因子的产生，这一作用可能是通过抑制NF-κB信号通路上游调节器IKKβ所致。随后，人们发现IKKβ通过与Keap1结合能够有效抑制人巨噬细胞的炎症反应^[44]。李秀英^[45]在支气管上皮细胞的研究中发现，添加抗氧化剂可促进Nrf2的表达，同时伴有IKKβ、NF-κB和IL-8表达的显著降低；而Nrf2的表达被抑制后，同时伴有IKKβ、NF-κB和IL-8表达的显著提高，这些变化在转录和翻译水平是一致的，这一结果更好的诠释了Nrf2在机体抗炎作用中的重要作用，但是在肉鸡方面IKKβ是否同样作用于Nrf2信号通路进而发挥抗炎效果仍有待一步的深入研究。

4 小结

近年来，国内外学者从组织、细胞和基因/蛋白分子水平深入研究了黄酮类化合物在肉鸡生产中的免疫调节作用及其机制，综合前人研究结果可知，黄酮类化合物在缓解免疫应激方面具有显著作用，而且对肉鸡的免疫器官、体液免疫和细胞免疫均有不同程度的影响，其作用机理更多的是与NF-κB信号通路和Nrf2信号通路有关。但是，由于黄酮类化合物种类繁多、结构复杂、作用靶点多等原因，其更确切的作用机制仍需进一步研究探索。