动物营养学报    2020, Vol. 32 Issue (9): 4205-4211    PDF    
布拉迪酵母壁多糖对早期断奶羔羊腹泻及肠道黏膜免疫的影响
刘孟健 , 张文举 , 姚峻     
石河子大学动物科技学院, 石河子 832000
摘要: 本研究旨在探讨饲粮中添加布拉迪酵母壁多糖对早期断奶羔羊粪样指数、腹泻频率及肠道黏膜免疫的影响。采用单因素试验设计,选取60只15~17日龄的健康羔羊,按同质原则分为5组,每组3个重复,每个重复4只羔羊。5组试验羔羊分别饲喂代乳料(Ⅰ组)、代乳料+0.005%庆大霉素(Ⅱ组)、代乳料+0.1%布拉迪酵母壁多糖(Ⅲ组)、代乳料+0.3%布拉迪酵母壁多糖(Ⅳ组)、代乳料+0.5%布拉迪酵母壁多糖(Ⅴ组)。试验期共44 d,其中过渡期8 d,预试期7 d,正试期29 d。结果显示:1)Ⅳ组和Ⅴ组的粪样指数和腹泻频率较Ⅰ组分别显著降低了20.73%、15.85%和31.34%、23.75%(P < 0.05)。2)Ⅳ组和Ⅴ组结肠黏膜中分泌型免疫球蛋白A(sIgA)含量较Ⅰ组分别显著提高了14.49%和17.77%(P < 0.05);Ⅲ组结肠黏膜中免疫球蛋白A(IgA)含量较Ⅰ组显著提高了5.81%(P < 0.05);Ⅳ组和Ⅴ组结肠黏膜中白细胞介素-1(IL-1)含量较Ⅰ组分别显著降低了7.93%和10.58%(P < 0.05);Ⅳ组结肠黏膜中白细胞介素-10(IL-10)含量较Ⅰ组显著提高8.05%(P < 0.05);此外,Ⅳ组和Ⅴ组结肠黏膜中免疫球蛋白G(IgG)含量有所降低且肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、γ-干扰素(IFN-γ)含量有所提高,但与Ⅰ组的差异未达显著水平(P>0.05)。由此可见,代乳料中添加0.3%~0.5%的布拉迪酵母壁多糖能在一定程度上降低早期断奶羔羊的腹泻频率,提高其肠道黏膜免疫水平。
关键词: 布拉迪酵母壁多糖    腹泻频率    肠道免疫    早期断奶羔羊    
Effects of Saccharomyces boulardii Cell Wall Polysaccharides on Diarrhea and Intestinal Mucosal Immunity of Early-Weaned Lambs
LIU Mengjian , ZHANG Wenju , YAO Jun     
College of Animal Science and Technology, Shihezi University, Shihezi 832000, China
Abstract: This experiment was conducted to determine the effects of Saccharomyces boulardii cell wall polysaccharides on diarrhea and intestinal mucosal immunity of early-weaned lambs. A single factor random experiment design was used and 60 lambs with similar health condition, parity and body weight which weaned at 15 to 17 days of age were randomly allotted to 5 groups with 3 replicates in each group and 4 lambs in each replicate. Lambs in the 4 groups were fed milk replacer (group Ⅰ), milk replacer+0.005% gentamicin (group Ⅱ), milk replacer+0.1% Saccharomyces boulardii cell wall polysaccharide (group Ⅲ), milk replacer+0.3% Saccharomyces boulardii cell wall polysaccharide (group Ⅳ) and milk replacer+0.5% Saccharomyces boulardii cell wall polysaccharide (group Ⅴ), respectively. The experiment lasted for 44 days, including transition period, preliminary period and test period, and they were designed to 8, 7 and 29 days, respectively. The results showed as follows:1) the fecal index of groups Ⅳ and Ⅴ was significantly lower than that of group Ⅰ by 20.73% and 15.85% (P < 0.05), respectively; the diarrhea rate of groups Ⅳ and Ⅴ was significantly lower than that of group Ⅰ by 31.34% and 23.75% (P < 0.05). 2) The secreted immunoglobulin A (sIgA) content in colonic mucosa of groups Ⅳ and Ⅴ was significantly higher than that of group Ⅰ by 14.49% and 17.77% (P < 0.05), respectively; the immunoglobulin A (IgA) content in colonic mucosa of group Ⅲ was significantly higher than that of group Ⅰ by 5.81% (P < 0.05); the interleukin-1 (IL-1) content in colonic mucosa of groups Ⅳ and Ⅴ was significantly lower than that of group Ⅰ by 7.93% and 10.58% (P < 0.05), respectively; the interleukin-10 (IL-10) content in colonic mucosa of group Ⅳ was significantly higher than that of group Ⅰ by 8.05% (P < 0.05). Moreover, the immunoglobulin G (IgG) content increased and the tumor necrosis factor-α (TNF-α) and interferon-γ (IFN-γ) decreased in colonic mucosa of groups Ⅳ and Ⅴ compared with group Ⅰ, but the differences were not significant (P>0.05). The above results indicate that adding 0.3% to 0.5% Saccharomyces boulardii cell wall polysaccharide in the milk replacer can decrease the diarrhea rate of early-weaned lambs in a certain degree, and enhance the intestinal mucosal immune level.
Key words: Saccharomyces boulardii cell wall polysaccharide    diarrhea rate    intestinal immunity    early-weaned lambs    

我国北方牧区因冬春换季导致温度波动较大,加之生产水平较低,常会引起早期断奶羔羊的应激反应和消化道功能紊乱,导致羔羊营养不良、免疫能力低下、腹泻、脱水甚至死亡,严重影响当地养羊业的发展[1]。虽然抗生素价格便宜见效快,但是也埋下了耐药性增加、肠道菌群破坏及药物残留等隐患,在我国无抗养殖的大趋势下,急需找到具有全部或部分抗生素效用的天然绿色添加剂[2]

布拉迪酵母壁多糖是布拉迪酵母的主要生物活性成分,有提高免疫、改善肠道菌群结构、吸附毒素等生理功能,对机体的消化系统疾病具有一定程度的预防作用[3-4]。布拉迪酵母壁多糖一般不被机体分解,并以抗原或免疫佐剂的形式,通过病原相关分子模式的机制直接作用肠道黏膜上皮细胞以提高机体免疫力;也能通过吸附病原菌毒素及调节肠道内菌群结构和其代谢产物的方式间接发挥其生物学功能[5]。另外,布拉迪酵母壁多糖具有来源广泛、化学性质稳定、无耐药、无残留等特点,不存在配伍禁忌,并能与益生菌制剂配合使用,具有广泛的研究和应用前景[6]。因此,本试验以早期断奶羔羊为研究对象,通过饲喂一定比例的布拉迪酵母壁多糖以观测羔羊的腹泻情况是否得到改善,并探讨布拉迪酵母壁多糖对羔羊肠道黏膜免疫的影响,推测其在早期断奶羔羊代乳料中的最适添加量。

1 材料与方法 1.1 试验材料

布拉迪酵母壁多糖来源于石河子大学动物科技学院,通过布拉迪酵母的发酵、粗提、纯化、冻干等工艺获得,经检验,其主要成分含量如下:多糖≥83%,粗蛋白质≤8%,水分≤6%,粗灰分≤1%。

1.2 试验动物和分组设计

选取遗传背景相近、胎次与体重相近和健康状况良好的15~17日龄羔羊60只[为方便计算均按17日龄计算,平均初始重为(6.49±1.71) kg],试验羔羊品种为萨福克羊×(阿勒泰羊♀×哈萨克羊),其中公羔45只,母羔15只。采用单因素试验设计,按同质原则将试验羔羊分为5组,每组3个重复,每个重复4只羔羊,所有试验羔羊均于32日龄强制断奶。5组试验羔羊分别饲喂代乳料(Ⅰ组,空白对照组)、代乳料+0.005%庆大霉素(Ⅱ组,阳性对照组)、代乳料+0.1%布拉迪酵母壁多糖(Ⅲ组)、代乳料+0.3%布拉迪酵母壁多糖(Ⅳ组)、0.5%布拉迪酵母壁多糖+代乳料(Ⅴ组)。

1.3 代乳粉

参照NRC(2007)体重20 kg、日增重300 g绵羊的营养需要量标准配制羔羊代乳料,其组成及营养水平见表 1

表 1 代乳料组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of milk replacers (air-dry basis) 
1.4 饲养管理

本试验开展于2019年11月23日至2020年1月8日,试验场地位于新疆昌吉庙尔沟和谐村,羊舍为半封闭式,内设羔羊保育舍,按照养殖场管理措施对圈舍进行打扫,并按惯例程序对羔羊进行饲喂及免疫措施。试验分为3个阶段,过渡期(8 d)、预试期(7 d)和正试期(29 d),合计44 d,详见表 2。过渡期羔羊与母羊共同圈养,羔羊主要吸吮母羊奶水,人工训练羔羊采食代乳料(粉状,粉碎机过1.0 mm筛片);在预试期逐渐降低羔羊吸吮的次数和时间,自由采食代乳料;在正试期进行强制断奶,羔羊自由采食代乳料。代乳料在饲喂前以料:水=1 : 4的比例用50 ℃温开水搅拌均匀,每日饲喂4次,饲喂时间分别为08:00、13:00、18:00和23:00,自由饮水。

表 2 羔羊饲喂周期及不同阶段饲粮种类 Table 2 Feeding period and diet type of lambs
1.5 样品采集及处理

于试验结束的第2天10:00,随机从每个重复中选取1只羔羊,肌肉注射4%戊巴比妥钠溶液对其麻醉,待完全昏迷后,通过颈部放血处死。用手术刀沿腹线划开腹腔,用手术剪截取结肠段,并用0.9%氯化钠溶液冲洗结肠,重复3次,将结肠内容物冲洗干净后,用样品袋包被后迅速置于液氮中冷冻,用于羔羊结肠黏膜中免疫球蛋白及细胞因子含量的检测。

1.6 指标测定 1.6.1 粪样指数与腹泻频率的测定

从正试期开始,每日2次于固定时间观察并记录羔羊粪便情况,准确记录每日腹泻羔羊只数,统计粪样指数。根据粪便评分标准(表 3),每日2次于固定时间对羔羊粪便进行评分,当粪便评分≥3时,记录1次腹泻天数,1天内1只羔羊出现腹泻就记录1次腹泻只数,试验结束计算腹泻频率。粪样指数与腹泻频率公式如下:

表 3 羔羊粪便评分标准 Table 3 Scoring standards of lamb faeces

式中:SF为粪便评分之和;SB为供试羊总只数;DB为腹泻只数;DT为腹泻天数;SB为供试羊总只数;ED为试验天数。

1.6.2 结肠黏膜免疫指标的测定

将液氮中的结肠样品解冻,准确称取1.0 g,用滤纸吸干水分后,加入2.0 mL 0.9%氯化钠溶液研磨20 min,再将研磨液放入离心机以5 000 r/min离心5 min,取上清,重复2次,合并2次上清液,pH调至7.4,-20 ℃保存。结肠黏膜分泌型免疫球蛋白A(sIgA)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)、白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-5(IL-5)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、γ-干扰素(IFN-γ)含量均参照文献[7]的方法,按照试剂盒中说明进行测定。

1.7 数据处理与统计分析

用Excel 2016对原始数据进行统计和简单处理,运用SPSS 18.0统计软件中的one-way ANOVA过程进行单因素方差分析,并采用Duncan氏法进行多重比较检验,结果用平均值±标准差表示,P<0.05为差异显著性判断标准。

2 结果与分析 2.1 布拉迪酵母壁多糖对早期断奶羔羊腹泻频率的影响

表 4可知,Ⅱ组的粪样指数最低,为2.09,显著低于其他各组(P<0.05),其次为Ⅳ组和Ⅴ组,分别为2.60和2.76,Ⅳ组和Ⅴ组较Ⅰ组分别显著降低了20.73%和15.85%(P<0.05);Ⅱ组的腹泻频率最低,为21.83%,显著低于其他各组(P<0.05),其次为Ⅳ组和Ⅴ组,分别为25.06%、27.83%,Ⅳ组和Ⅴ组较Ⅰ组分别显著降低了31.34%和23.75%(P<0.05)。由此表明,添加0.005%的庆大霉素对早期断奶羔羊的腹泻有显著的防治效果,添加0.3%~0.5%的布拉迪酵母壁多糖对早期断奶羔羊腹泻也有显著的抑制作用。

表 4 布拉迪酵母壁多糖对羔羊粪便指数及腹泻频率的影响 Table 4 Effects of BYWP on fecal index and diarrhea rate of lambs
2.2 布拉迪酵母壁多糖对早期断奶羔羊结肠黏膜免疫指标的影响

表 5可知,Ⅴ组的结肠黏膜sIgA含量最高,为20.81 mg/g,显著高于Ⅰ组和Ⅱ组(P<0.05),Ⅳ组和Ⅴ组较Ⅰ组分别显著提高了14.49%和17.77%(P<0.05)。Ⅲ组的结肠黏膜IgA含量最高,为36.77 mg/g,较Ⅰ组显著提高了5.81%(P<0.05)。Ⅱ组的结肠黏膜IL-1含量最低,为3.12 mg/g,Ⅳ组和Ⅴ组较I组分别显著降低了7.93%和10.58%(P<0.05)。Ⅳ组的结肠黏膜IL-10含量最高,为4.43 mg/g,较Ⅰ组显著提高了8.05%(P<0.05)。添加布拉酵母壁多糖在一定程度上提高了结肠黏膜IgG含量(P>0.05),Ⅳ组和Ⅴ组的结肠黏膜TNF-α、IFN-γ含量低于Ⅰ组,但差异均不显著(P>0.05)。此外了,0.005%庆大霉素除了显著降低了结肠黏膜IL-1含量(P<0.05)外,对其他被测免疫指标的影响不显著(P>0.05)。由此表明,添加0.3%~0.5%布拉迪酵母壁多糖对早期断奶羔羊的肠道黏膜免疫水平有提高作用。

表 5 布拉迪酵母壁多糖对羔羊结肠黏膜中免疫球蛋白和细胞因子含量的影响 Table 5 Effects of BYWP on immune globulin and cytokine contents in colonic mucosa of lambs 
3 讨论 3.1 布拉迪酵母壁多糖对早期断奶羔羊腹泻的影响

在规模化养殖生产中,羔羊早期断奶技术为进一步提升羔羊生产和母羊繁殖效率提供了可能[8]。然而,早期断奶羔羊消化系统和免疫系统尚未发育完全,常会导致腹泻的发生,严重影响羊业的发展[9]。本研究结果显示,0.005%庆大霉素对早期断奶羔羊腹泻有显著的抑制效果,但抗生素的长期摄入可能会带来肠道菌群破坏、耐药性及药物残留的风险。相比较而言,添加0.3%和0.5%的布拉迪酵母壁多糖显著降低了羔羊的粪样指数和腹泻频率,使腹泻频率降分别低了31.34%和和23.75%,由此表明布拉迪酵母壁多糖能从表观上缓解早期断奶羔羊的腹泻症状,推测其原因可能有以下3点:1)布拉迪酵母壁多糖不易被消化道分解,刺激了肠道内消化酶的分泌和绒毛高度与隐窝深度的增加,从而提高了机体对代乳料的消化吸收率,降低了营养性腹泻的可能;2)布拉迪酵母壁多糖加快了肠道黏膜免疫的成熟,降低了因外界抗原引起炎症反应的次数和程度,从而减少了腹泻发生的可能;3)布拉迪酵母壁多糖帮助机体快速建立肠道内生物屏障,有利于益生菌的繁殖并减少有害菌的生长,从而降低了腹泻发生的可能。Czerucka等[10]在布拉迪酵母对肠道保护机制的研究中发现,布拉迪酵母在肠道内的靶标主要为肠道上皮、肠道菌群和病原体,而其主要的作用机制为促进肠道黏膜发育和调节上皮细胞的紧密连接蛋白,同时改善肠道菌群结构并激活固有免疫。Jin等[11]在布拉迪酵母对小鼠肠道黏膜屏障保护作用的研究中发现,布拉迪酵母改善了肠道黏膜微绒毛和细胞的空间构成,并降低了促炎因子的表达,具有抗炎和保护黏膜机械屏障的作用,且布拉迪酵母还显著提高了拟杆菌门并显著减低了厚壁菌门的数量,改变了肠道内的菌群结构。Hudson等[12]在布拉迪酵母对致病菌攻毒小鼠肠道黏膜免疫系统的研究中发现,布拉迪酵母对小鼠肠道黏膜免疫反应进行了良性诱导,如提高抗原细胞的呈递效率、减少肠道组织损伤、减少致病细菌易位、维持上皮的完整性,最终提高了小鼠的成活率。这些试验结论与本试验的推测一致。

3.2 布拉迪酵母壁多糖对早期断奶羔羊肠道黏膜免疫的影响

肠道黏膜免疫是机体抵御外界抗原入侵的第1道防线,其对断奶羔羊的消化系统和免疫系统有着重要意义[13]。sIgA不仅对各种内源及外源病原菌有抵抗作用,还能维持生物屏障的完整性,从而降低系统炎性反应的发生,在肠道黏膜免疫中起到主要作用[14]。IgA与IgG是存在于血清中的主要抗体,能附着在肠道黏膜表面,对大多数致病菌和病毒都具有抗体活性,是肠道黏膜生物屏障的重要组成部分[15]。IL-1、TNF-α和IFN-γ为肠道黏膜免疫中的促炎因子,其在外界抗原入侵机体或机体出现感染的情况下,迅速激活适应性免疫系统,抵御外界抗原的侵染,但其过多表达常会造成不必要的炎症反应,使血管通透性增加、细胞损伤,影响动物的健康[16]。IL-10是由T辅助细胞2(Th2细胞)分泌的抑炎因子,其能抑制自然杀伤细胞(NK细胞)的杀伤能力,其还能抑制炎性因子的释放,降低免疫反应的程度[17]。此外,IL-10还能抑制单核巨噬细胞的抗原呈递作用,降低适应性免疫反应,同时刺激单核细胞的吞噬能力,增加机体固定性免疫的能力,从而加强机体的免疫耐受能力[18]。本研究结果显示,添加0.3%~0.5%的布拉迪酵母壁多糖能显著提高早期断奶羔羊结肠黏膜中sIgA的含量,还能一定程度地提高结肠黏膜中IgA和IgG的含量,表明其能提高肠道黏膜中的抗体水平,增加生物屏障的完整性。同时,添加0.3%~0.5%的布拉迪酵母壁多糖还能显著降低结道黏膜中IL-1的含量、提高IL-10含量,表明其能降低肠道黏膜的炎性反应,提高固定性免疫水平,有助于减少早期断奶羔羊出现断奶应激、肠道炎症的可能。添加0.005%庆大霉素除了显著降低结道黏膜中IL-1的含量以外,对其他结道黏膜中其他免疫指标的影响均不显著,但在一定水平上降低了结道黏膜中IL-10和sIgA的含量,表明庆大霉素降低了肠道黏膜免疫的耐受水平,同时对早期断奶羔羊生物屏障的建立和完整性产生了不利影响。此外,根据此结果还可进行进一步假设,长期摄入庆大霉素的早期断奶羔羊在停药后,其自身免疫防线难以应对外界致病菌等抗原的入侵,可能会导致腹泻等肠道疾病的发生。徐杰等[19]以添加0.1%酵母壁多糖的饲粮饲喂仔猪,结果发现仔猪血清免疫球蛋白M(IgM)含量提高,同时猪瘟和蓝耳抗体水平有上升趋势。杨地坤[20]用添加酵母甘露寡糖的饲粮饲喂羔羊,结果发现羔羊血清中IgA、IgG及白细胞介素-2(IL-2)的含量显著提高。贺琴[21]用添加0.3%酵母壁多糖的饲粮饲喂21日龄仔猪,结果发现仔猪血清中IgA、IgG和IL-10含量显著提高,且IFN-γ的含量有所降低。本试验结果与这些结论一致,下一步应该通过转录组学与蛋白质组学研究布拉迪酵母壁多糖在肠道黏膜免疫的免疫受体与免疫通路,以揭示其免疫机制。

综合来看,虽然抗生素在早期断奶羔羊防治腹泻方面起到了较好的效果,但其对早期断奶羔羊肠道黏膜免疫的建立和稳态产生了不利影响。与其相比,布拉迪酵母壁多糖在降低早期断奶羔羊腹泻的同时,还提高了其肠道黏膜免疫水平。

4 结论

本试验条件下,代乳料中添加0.3%~0.5%的布拉迪酵母壁多糖能在一定程度上降低早期断奶羔羊的腹泻频率,提高其肠道黏膜免疫水平。

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