肠道不仅是营养物质消化吸收的主要场所，也是机体重要的免疫器官，在抵御病原入侵、维持机体内环境的稳定中发挥着重要作用[1]。肠上皮细胞在营养物质的消化吸收和免疫功能中起着重要作用[2]。当机体受到外来细菌、病毒等病原微生物的刺激时，可引起炎症信号相关通路的激活，诱导炎性细胞因子如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1(IL-1)等的产生，造成肠道结构和功能损伤[3]。因此，建立相应的肠细胞损伤模型，对于研究肠道的保护机制有十分重要的意义。
TNF-α作为重要的炎性细胞因子，在机体抵御外来病原入侵时发挥着重要的作用。正常情况下，低浓度的TNF-α能起到保护机体免受病原感染的作用[4]。但是，当机体内的TNF-α过量产生或释放时，可引发炎症信号通路的激活，进一步诱导炎性细胞因子大量产生，诱发肠道损伤[5-6]。过度的炎症反应会激活机体的负调控因子，如单免疫球蛋白白细胞介素-1受体相关蛋白(SIGIRR)和细胞因子信号转导抑制因子1(SOCS1)，达到抑制炎性反应的目的[7-8]。本课题组前期的研究也发现，肠道中TNF-α浓度与肠道损伤密切相关，TNF-α浓度越高，肠道组织损伤越严重[9]。Mankertz等[10]研究发现，TNF-α刺激导致HT-29/B6细胞的通透性增大，引起跨膜电位改变，使细胞对细菌、病毒、霉菌毒素等的屏障作用减弱。Al-Sadi等[11]和Field等[12]研究发现，TNF-α刺激导致Caco-2细胞的通透性增大，使细胞对营养物质的利用率下降。TNF-α可促进内皮细胞和中性粒细胞的促炎反应，增加内皮细胞的通透性，最终导致细胞损伤和多器官功能障碍[13]。本试验以IPEC-1细胞为研究对象，探究不同TNF-α浓度和不同刺激时间对IPEC-1细胞的影响，旨在选取TNF-α的合适浓度和刺激时间，建立IPEC-1细胞损伤模型。
1 材料与方法 1.1 试验材料TNF-α，购于Prospec公司；IPEC-1细胞，购于德克萨斯农工大学；一抗抗体闭合蛋白-1(Claudin-1)(猪源)，型号519000，购于Invitrogen公司；二抗抗体辣根过氧化物酶标记羊抗兔免疫球蛋白G(HRP-Goat Anti-Rabbit IgG)(ANT020)，购于武汉安特捷生物技术公司；CCK8试剂盒(CK04)、β-肌动蛋白(β-actin)抗体(A2228)，购于武汉安特捷生物技术公司；凯基全蛋白抽提试剂盒和BCA蛋白浓度测定试剂盒，购于江苏凯基生物技术股份有限公司；DMEM/F-12培养基，购于美国Hyclone公司；乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒，购于南京建成生物工程研究所。
1.2 完全培养基的配制在DMEM/F-12培养基中，按比例加入5%的胎牛血清、1%的双抗、1%的谷氨酰胺、1‰的ITS-X、0.5‰的EGF(均购于Gibco公司)，配制成完全培养基，待用。
1.3 细胞培养将冻存的IPEC-1细胞复苏，在恒温培养箱中进行细胞培养，培养条件5% CO2、37 ℃。当贴壁细胞量达到90%~95%，即细胞量达到可消化的程度，此时用胰蛋白酶进行消化。消化后，将得到的细胞进行适当稀释、铺板。
1.4 指标测定 1.4.1 细胞活力将经过胰蛋白酶消化后的细胞接种到96孔板中进行培养。观察贴壁细胞量，当贴壁细胞量达到60%时，用含有不同浓度[0(对照)、10、20、40、50 ng/mL]TNF-α的培养液刺激细胞，分别刺激12、24、48 h，每个处理8个重复。在刺激结束时，换上含有CCK8的培养基(CCK8和完全培养基按1 : 9配制)，在恒温培养箱中静置1 h，注意避光，再用酶标仪在波长450 nm处进行检测读数。
1.4.2 LDH活性将经过胰蛋白酶消化后的细胞接种到12孔板中进行培养。观察贴壁细胞量，待贴壁细胞量达到60%~70%时，用含有不同浓度[0(对照)、10、20、40、50 ng/mL]TNF-α的培养液刺激细胞，分别刺激12、24、48 h，每个处理4个重复。在刺激结束时，收集细胞培养液，采用LDH试剂盒对LDH活性进行检测。
1.4.3 紧密连接蛋白和炎症相关基因mRNA表达量将经胰蛋白酶消化后的细胞接种到12孔板中培养，当贴壁细胞量达到60%~70%时，用含有不同浓度[0(对照)、10、20、40、50 ng/mL]TNF-α的培养液分别刺激细胞，之后分别在12、24、48 h用RNA裂解后收取细胞，每个处理4个重复，用于紧密连接蛋白和炎症相关基因mRNA表达量的测定。按照TRIzol试剂(美国Invitrogen公司)的说明，裂解后的样品经过提取、沉淀清洗、溶解等步骤，提取得到总RNA。之后，反转得到cDNA，反转步骤按照反转试剂盒说明书进行。实时荧光定量PCR按照SYBRⓇ Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)试剂盒[宝生物工程(大连)有限公司]说明书完成。反应体系为20 μL，由10.0 μL SYBRⓇ Premix Ex TaqTM (2×)、0.4 μL ROX reference dyeⅡ (10×)、2.0 μL cDNA、6.8 μL RNase free dH2O、0.4 μL上游引物(10 μmol/L)、0.4 μL下游引物(10 μmol/L)组成。使用ABI 7 500 Real-time PCR仪(Applied Biosystems公司)进行扩增，PCR反应条件为：95 ℃ 30 s，随后95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，进行40个循环。以β-actin为内参进行数据分析，采用Livak等[14]的2-ΔΔCt法计算目的基因mRNA表达量。相关基因的引物序列见表 1。
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表 1 相关基因的引物序列 Table 1 Primer sequences of related genes |
贴壁细胞经过胰蛋白酶消化，稀释至合适浓度后，接种到小皿(60 mm)中进行培养。待贴壁细胞长至60%~70%，分别用含有不同浓度[0(对照)、10、20、40、50 ng/mL]TNF-α的培养液刺激细胞，每个处理4个重复，48 h后弃培养液，用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗2遍，随后在每个培养皿中加入蛋白提取液[按照1 mL Lysis Buffer、10 μL磷酸酶抑制剂、1 μL蛋白酶抑制剂、5 μL 100 mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)配制]，收集样品，提取蛋白样品。采用Western Blot的方法，得到蛋白条带。试验以β-actin为内参，采用Alpha Innotech成像系统显色，最终按照Claudin-1和β-actin的光密度值的比值进行相关数据的分析。
1.5 统计分析采用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，并采用Duncan氏法进行组间多重比较，结果以平均值±标准误表示，以P≤0.05为差异显著性标准，0.05 < P≤0.10为具有显著性趋势。
2 结果与分析 2.1 不同浓度TNF-α对IPEC-1细胞活力的影响由图 1可知，与对照组相比，当刺激时间为12 h时，不同浓度(10、20、40、50 ng/mL)的TNF-α对细胞活力均无显著影响(P>0.05)。当刺激时间为24 h时，不同浓度的TNF-α均导致细胞活力显著下降(P < 0.05)。当刺激时间为48 h时，仅40和50 ng/mL的TNF-α导致细胞活力显著下降(P < 0.05)。
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数据柱标注相同字母或无字母表示差异不显著(P>0.05)，不同字母表示差异显著(P < 0.05)。下图同。 Date columns with the same or no letters mean no significant difference (P>0.05), while with different small letters mean significant difference (P < 0.05). The same as below. 图 1 不同浓度TNF-α对IPEC-1细胞活力的影响 Fig. 1 Effects of different concentrations of TNF-α on viability of IPEC-1 cells |
由图 2可知，与对照组相比，当刺激时间为12 h时，不同浓度的TNF-α对LDH活性均无显著影响(P>0.05)。当刺激时间为24 h时，50 ng/mL的TNF-α导致LDH活性显著上升(P < 0.05)。当刺激时间为48 h时，仅40和50 ng/mL的TNF-α导致LDH活性显著上升(P < 0.05)，且随着TNF-α浓度和刺激时间的增加，LDH活性上升的幅度变大。
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图 2 不同浓度TNF-α对IPEC-1细胞培养液LDH活性的影响 Fig. 2 Effects of different concentrations of TNF-α on LDH activity in culture medium of IPEC-1 cells |
由表 2可知，与对照组相比，当刺激时间为12和48 h时，不同浓度的TNF-α对闭合小环蛋白-1(ZO-1)、Claudin-1和咬合蛋白(Occludin)的mRNA表达量均无显著影响(P>0.05)。当刺激时间为24 h时，40和50 ng/mL的TNF-α导致ZO-1、Claudin-1和Occludin的mRNA表达量显著上升(P < 0.05)。由图 3可知，与对照组相比，当刺激时间为48 h时，不同浓度的TNF-α对Claudin-1的蛋白表达量均无显著影响(P>0.05)。
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表 2 不同浓度TNF-α对IPEC-1细胞紧密连接蛋白mRNA表达量的影响 Table 2 Effects of different concentrations of TNF-α on mRNA expression levels of tight junction proteins of IPEC-1 cells |
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图 3 不同浓度TNF-α刺激IPEC-1细胞48 h对Claudin-1蛋白表达的影响 Fig. 3 Effects of different concentrations of TNF-α on Claudin-1 protein expression of IPEC-1 cells at stimulation for 48 h |
由表 3可知，与对照组相比，当刺激时间为12 h时，不同浓度的TNF-α均导致TNF-α的mRNA表达量显著上升(P < 0.05)。当刺激时间为24和48 h时，不同浓度的TNF-α均导致TNF-α和白细胞介素-8(IL-8)的mRNA表达量显著上升(P < 0.05)，且随着TNF-α浓度和刺激时间的增加，其mRNA表达量增加的幅度变大。当刺激时间为12、24和48 h时，不同浓度的TNF-α对SOCS1和SIGIRR的mRNA表达量均无显著差异(P>0.05)。
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表 3 不同浓度TNF-α对IPEC-1细胞炎症相关基因mRNA表达的影响 Table 3 Effects of different concentrations of TNF-α on mRNA expression of genes related to inflammation of IPEC-1 cells |
肠道在机体的生长发育过程中扮演着十分重要的角色，不仅能够满足机体的营养需要，还是抵御各种内源或外源感染的有效屏障。环境中细菌、病毒、霉菌毒素等极易造成肠道结构和功能的损伤。这些不利因素可导致肠黏膜损伤和功能障碍，最终危害人和动物健康。因此，本试验采用不同浓度TNF-α刺激IPEC-1细胞，建立肠细胞损伤模型。
本试验中测定的指标包括细胞活力、LDH活性、炎症相关基因mRNA表达以及紧密连接蛋白mRNA或蛋白表达。其中，细胞的损伤情况可以通过显微镜观察，以细胞活力作为衡量细胞损伤的指标[15]。通过定量LDH的释放量，测定TNF-α对IPEC-1细胞的细胞毒性[16]。LDH主要存在于细胞内，当细胞损伤时，会被释放到培养液中。通过测定培养液LDH的活性，可以检测细胞的受损情况[17]。本试验发现，TNF-α刺激导致IPEC-1细胞活力显著下降，LDH的活性显著上升，表明TNF-α刺激诱导了IPEC-1细胞损伤。与本试验结果类似，Zhang等[18]研究发现，TNF-α刺激导致肠道Caco-2细胞损伤。此外，TNF-α也可诱导其他细胞的损伤。如Mcclain等[19]研究报道，大量的TNF-α产生造成肝细胞死亡。TNF-α是主要的细胞因子，在刺激炎症级联反应中具有重叠和协同作用，TNF-α可促进内皮细胞和中性粒细胞的促炎反应，增加内皮细胞的通透性，最终导致细胞损伤和多器官功能障碍[13]。倪虹等[20]研究表明，TNF-α刺激会导致胰腺细胞的细胞活力下降，使培养液中LDH的活性上升。TNF-α能够上调肌球蛋白轻链激酶(MLCK)蛋白表达及诱导核转录因子-κB(NF-κB)的启动，MLCK作为一种Ca2+/钙调蛋白依赖的丝氨酸/苏氨酸激酶，活化后可诱导MLCK1募集以及下游肌球蛋白轻链(MLC)磷酸化，最终引起肠上皮的通透性增加。
肠上皮细胞通过细胞间紧密连接蛋白(包括ZO-1、Occludin和Claudin-1等)紧密结合在一起，该蛋白调节细胞旁通透性，对于上皮屏障的完整性至关重要。肠上皮细胞在营养物质的消化吸收和免疫功能中起着重要作用[21]。肠道屏障功能的完整性是由基底膜、上皮细胞层和黏液层构成，在抵抗病原入侵中发挥着重要的作用[22]。炎症反应是一种防御机制，保护宿主免受感染，促进组织修复和伤口愈合[23]。炎性细胞因子TNF-α会影响肠上皮细胞的完整性，损伤肠黏膜屏障[24-25]。本试验中，在刺激时间为24 h时，40和50 ng/mL的TNF-α刺激导致ZO-1、Occludin和Claudin-1的mRNA表达量显著上升，但对Claudin-1的蛋白表达量无显著影响。与本试验结果相似，Xiao等[26]研究发现，TNF-α刺激对Claudin-1的蛋白表达量无显著影响。但是，宋红丽等[27]研究发现，采用TNF-α刺激24 h，肠细胞中ZO-1的mRNA表达量显著下降。我们猜测，可能是TNF-α损伤了IPEC-1细胞的屏障功能，IPEC-1细胞通过负反馈调节促进紧密连接蛋白的mRNA表达，从而防止IPEC-1细胞的屏障功能进一步损伤。
TNF-α是一种促炎细胞因子，能够诱导细胞产生炎症反应，引起细胞内炎性因子水平上调[28]。本试验中，TNF-α刺激导致TNF-α和IL-8的mRNA表达量显著上升，表明TNF-α诱导了IPEC-1细胞的炎症反应。与本试验结果类似，Zhu等[29]研究发现，炎性细胞因子如TNF-α和IL-8的大量产生，会导致肠道结构与功能的损伤。Xiao等[26]的研究显示，在培养基中加入浓度为20 ng/mL的TNF-α可降低IPEC-J2细胞中Occludin和ZO-1的蛋白表达量。在细胞方面，Mankertz等[10]研究发现，TNF-α刺激导致HT-29/B6细胞的通透性增大，引起跨膜电位改变，使细胞对细菌、病毒、霉菌毒素等的屏障作用减弱。Al-Sadi等[11]的研究也显示，TNF-α刺激导致Caco-2细胞紧密连接蛋白ZO-1和Occludin的mRNA表达量下降。
大量证据表明，促炎细胞因子TNF-α与包括肠上皮细胞在内的各种细胞类型的肠屏障功能障碍有关。TNF-α导致细胞膜的通透性增大，使细胞对病原的抵抗力下降，病原入侵机体后，不仅会降低肠道对营养物质的利用率，还会引起肠道疾病的发生。因此，建立肠上皮细胞损伤模型，并探究肠道细胞受损后的分子机制，不仅对改善动物的肠道健康具有重要的参考价值，还可为人类炎症性肠病的治疗提供理论依据。
4 结论TNF-α可导致IPEC-1细胞活力下降，LDH活性上升，炎性细胞因子IL-8和TNF-α的mRNA表达量显著升高。综合考虑各指标，可采用40 ng/mL TNF-α刺激IPEC-1细胞48 h构建IPEC-1细胞损伤模型。
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