2. 广西奇昌生物科技有限公司, 桂林 537000
2. Guangxi Qichang Biotechnology Co., Ltd., Guilin 537000, China
在现代化规模的养殖场中，采用早期隔离断奶技术[1]来提高母猪生产性能和经济效益的同时，也使断奶仔猪产生断奶应激综合征[2]，严重时导致仔猪死亡。自20世纪以来，广泛使用抗生素来缓解仔猪的断奶应激[3]，然而高剂量的抗生素导致耐药性增强[4]以及在畜产品和环境中残留量过高等问题；因此，药物饲料添加剂将在2020年全部退出中国畜牧行业，这加速了饲料领域减抗、禁抗的步伐[5]。
微波具有热效应和非热效应，可以利用微波这一特点来加热饲料原料，用于微波加热的频率一般为2 450 MHz[6]。对饲料原料进行微波加热具有众多优点：一方面，微波加热可以改变饲料原料中某些营养物质的化学结构；破坏纤维素的结构，促进木质纤维素的分解，降低半纤维素的含量[7]；可以发生糊化反应，提高淀粉的糊化度[8]，同时，在冷却的过程中，饲料原料中相邻的直链淀粉之间可因新氢键的形成而生成一定数量的抗性淀粉[9]；还可以使饲料原料中蛋白质的螺旋状结构发生变性作用，结构更加松弛，肽链更具韧性，促进蛋白质的消化吸收[10]。有研究表明，微波处理会增加稻谷中直链淀粉的含量，降低粗蛋白质(CP)和粗脂肪(EE)的含量[11]，形成可溶性蛋白[12]，提高蛋白质的消化率[13]以及肠道和瘤胃对淀粉的利用程度[14]，同时，可有效维持不饱和脂肪酸的稳定性[15]。另一方面，微波加热可以消灭附着在饲料原料表面的有害微生物[16]。因此，微波加热使饲料原料更易被畜禽消化吸收，能减少对断奶仔猪胃肠道的应激作用，从而减少抗生素的使用[17]。从艳霞等[18]研究表明，微波预处理能促进菜籽中硫葡萄糖甙的热降解。Zeng等[19]研究表明，对饲料原料进行微波加热后，在冷却的过程中会形成抗性淀粉。Stein等[20]研究表明，膨化豌豆有助于改善育肥猪的生长性能。因此，本试验旨在通过微波加饲料原料对断奶仔猪生长性能、营养物质消化率以及血清生化指标的影响来探究其替代抗生素的效果，并依据中华人民共和国农业农村部第2513号公告中允许的金霉素预混剂添加量设计了试验的正对照组(positive control group, PC组)，以期为饲料原料预处理技术在断奶仔猪饲粮中的推广应用提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料微波加热的饲料原料由广西某生物科技有限公司提供。微波加热是分批进行的，每批100 kg左右，功率为100 kW，加热时间是25~30 min，加热温度为80 ℃左右，加热设备由公司自行定制。
1.2 试验动物与饲养管理选择108头体况相近的28日龄健康“杜×长×大”三元杂交仔猪[初始体重(8.12±0.58) kg]，随机分为3组，每组6个重复，每个重复6头猪，公母各占1/2，各重复间初始体重差异不显著(P>0.05)。负对照组(negative control group, NC组)饲喂玉米-豆粕型基础饲粮，PC饲喂添加75 mg/kg金霉素的基础饲粮，微波加热组(microwave-heated group, MH组)饲喂用微波加热的玉米和豆粕完全等量取代基础饲粮中玉米豆粕的饲粮。饲粮的营养需要量符合NRC(2012)[21]的要求，基础饲粮组成及营养水平见表 1。断奶仔猪自由采食饮水，预试期3 d，正试期35 d，分为前期(第1~14天)和后期(第15~35天)2个阶段。试验开始前对猪舍进行全面清扫、消毒，按照常规的管理和免疫程序进行饲养管理。动物试验在中国农业大学农业农村部饲料工业中心动物试验基地进行，舍内温度由恒温控制仪自动调节。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(饲喂基础) Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets (as-fed basis) |
在正式试验开始后的第14和35天准确称量每一头仔猪的重量和每一栏剩余饲粮的重量，用于计算平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)。
1.3.2 腹泻率测定在试验的前14 d，每天2次观察并记录仔猪的腹泻状况，仔猪是否腹泻主要观察仔猪的尾部状态与塑料漏缝地板上的粪便痕迹为准。计算公式如下：
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在试验第12~14天和第33~35天进行粪样采集，每天从每个重复中收集粪样150 g，-20 ℃保存；将3 d的粪样充分混合均匀，一部分用于挥发性脂肪酸(volatile fatty acid，VFA)含量的测定，剩下的放入65 ℃的烘箱中处理72 h，回潮，样品粉碎过40目筛保存待测。
1.3.3.1 营养物质表观消化率的测定饲粮和粪便样品中的干物质(DM)、有机物(OM)、CP、EE、中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维(ADF)含量的测定分别按照GB/T 6435—2014、GB/T 6438—2007、GB/T 6438—2007、GB/T 6432—1994、GB/T 6433—2006、GB/T 20806—2006和NY/T 1459—2007的方法进行测定，饲粮与粪样中铬(Cr)含量则利用原子吸收光谱仪(Hitachi Z-5000, Tokyo, 日本)进行测定。营养物质表观消化率的计算公式如下：
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粪便在4 ℃下自然解冻后称取0.5 g于10 mL离心管内，用超纯水稀释至8 mL，超声振荡30 min，在4 000 r/min的条件下离心10 min，取上清液160 μL用超纯水稀释至8 mL。将稀释液用2 mm过滤器过滤后利用离子色谱分析仪(Ionpac AS11, 美国)进行VFA含量测定。
1.3.4 血样的采集、处理与测定分别在正试期第14天和第35天晨饲前，每个重复选择1头猪使用前腔静脉采血5 mL于采血管中，静置2 h，在3 000 r/min条件下离心10 min，将血清放在2 mL离心管中放在-20 ℃中保存，用于血清常规生化、抗氧化和免疫指标的测定。
血清谷草转氨酶(aspartate aminotransferase, AST)、谷丙转氨酶(alanine aminotransferase, ALT)活性，白蛋白(albumin, ALB)、总蛋白(total protein, TP)、尿素氮(urea nitrogen, UN)、肌酐(creatinine, CREA)、总胆血红素(total bilirubin, T-BIL)含量，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)活性、总抗氧化能力(total antioxidative capacity, T-AOC)和丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量等指标采用全自动生化分析仪(山东高密彩虹GF-D200型)和分光光度计(山东高密彩虹722)进行测定。
血清免疫球蛋白A(immunoglobulin A, IgA)、免疫球蛋白M(immunoglobulin M, IgM)、免疫球蛋白G(immunoglobulin G, IgG)、内毒素(endotoxin, ET)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor alpha, TNF-α)、白细胞介素-6(interleukin-6, IL-6)、白细胞介素-10(interleukin-10, IL-10)含量和二胺氧化酶(diamine oxidase, DAO)活性采用相应的购自南京建成生物工程研究所的试剂盒进行测定。
1.4 数据分析所有原始数据通过Excel 2010整理后，使用SAS 9.2统计软件对相关指标进行单因子方差分析(one-way ANOVA)和LSD多重比较，以P < 0.05为差异显著，以0.05≤P < 0.10为有变化趋势，结果用平均值和均值标准误表示。
2 结果 2.1 微波加热饲料原料对断奶仔猪生长性能和腹泻率的影响由表 2可知，在试验前期(第1~14天)，与PC组相比，MH组断奶仔猪的腹泻率趋于降低(P=0.07)；在饲粮中使用微波加热处理的饲料原料对断奶仔猪各阶段的ADG、ADFI以及F/G均无显著影响(P>0.05)。
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表 2 微波加热饲料原料对断奶仔猪生长性能和腹泻率的影响 Table 2 Effects of microwave-heated feedstuff on growth performance and diarrhea rate of weaned piglets |
由表 3可知，在试验前期(第1~14天)，与NC组和PC组相比，MH组断奶仔猪CP和EE的表观消化率显著提高(P < 0.05)；与PC组相比，MH组断奶仔猪NDF和ADF的表观消化率显著提高(P < 0.05)。在试验后期(第15~35天)，与NC组相比，PC组断奶仔猪DM和OM的表观消化率显著提高(P < 0.05)；与NC组和PC组相比，MH组断奶仔猪CP和ADF的表观消化率显著提高(P < 0.05)；与NC组相比，MH组和PC组断奶仔猪EE的表观消化率趋于提高(P=0.09)。
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表 3 微波加热饲料原料对断奶仔猪营养物质表观消化率的影响 Table 3 Effects of microwave-heated feedstuff on nutrient apparent digestibility of weaned piglets |
由表 4可知，在试验前期(第1~14天)，与NC组和PC组相比，MH组断奶仔猪血清中T-BIL的含量显著降低(P < 0.05)。在试验后期(第15~35天)，与NC组和PC组相比，MH组断奶仔猪血清中UN的含量显著降低(P < 0.05)；与NC组相比，MH组和PC组断奶仔猪血清中T-BIL的含量显著降低(P < 0.05)；与PC组相比，MH组断奶仔猪血清中ET的含量趋于降低(P=0.09)。微波加热饲料原料对断奶仔猪血清中ALT、AST、DAO的活性和TP、ALB、CREA的含量无显著影响(P>0.05)。
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表 4 微波加热饲料原料对断奶仔猪血清常规生化指标的影响 Table 4 Effects of microwave-heated feedstuff on serum conventional biochemical indices of weaned piglets |
由表 5可知，在试验前期(第1~14天)，与NC组相比，PC组和MH组断奶仔猪血清中SOD的活性显著提高(P < 0.05)；与NC组和PC组相比，MH组断奶仔猪血清中T-AOC显著提高(P < 0.05)。在试验后期(第15~35天)，与PC组相比，MH组断奶仔猪血清中T-AOC显著提高(P < 0.05)，血清中IgA(P=0.06)和IgG(P=0.09)的含量有增加的趋势。微波加热饲料原料对断奶仔猪血清中其他抗氧化和免疫指标无显著影响(P>0.05)。
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表 5 微波加热饲料原料对断奶仔猪血清抗氧化和免疫指标的影响 Table 5 Effects of microwave-heated feedstuff on serum antioxidant and immune indices of weaned piglets |
由表 6可知，与NC组和PC组相比，微波加热饲料原料可以提高前期断奶仔猪粪便中乙酸、丙酸、丁酸和总挥发性脂肪酸的含量，但是差异不显著(P>0.05)。
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表 6 微波加热饲料原料对断奶仔猪粪便中VFA含量的影响 Table 6 Effects of microwave-heated feedstuff on fecal VFA contents of weaned piglets |
Liu等[22]研究结果表明，在饲粮中添加膨化碎米可以提高仔猪的ADG和ADFI。Amornthewaphat等[23]研究结果表明，与对照组相比，在饲粮中添加48%的膨化玉米可以使仔猪的ADG增加5.79%。本试验结果表明，饲粮中使用微波加热的饲料原料使得断奶仔猪在整个保育阶段的ADG和ADFI略有降低，但是差异不显著，可能是因为微波加热处理后饲粮的水分含量减少，DM含量增加，增加了饱腹感，因此采食量略有降低，进而影响了日增重。牛春艳等[24]研究表明，利用微波-酶法可使玉米中抗性淀粉的产率达到28.4%，因此，本试验中添加微波加热的饲料原料使DM的表观消化率降低，是由微波加热生成的抗性淀粉吸收了一部分淀粉导致的。李燕燕[25]研究表明，采用酰化、微波及两者结合的方法可以提高大米中蛋白质的体外消化率，本试验中微波加热可提高饲粮中CP、EE、ADF和NDF的表观消化率，与前人的研究结果一致，这是因为微波加热可以破坏纤维素的结构，降低半纤维素的含量[7]；且相比于PC组，MH组断奶仔猪腹泻率有降低趋势，表明MH组仔猪具有较为完整的肠道微生物区系，更有利于NDF和ADF在盲肠和结肠中降解，从而有利于提高其表观消化率；同时，微波加热使蛋白质结构的某些键断裂发生变性作用，蛋白质结构更加松弛，增加了肽链的柔韧性，易于被蛋白酶接近并降解[10]，从而提高畜禽对饲粮中蛋白质的消化吸收，而断奶仔猪对EE表观消化率的提高可能是由于微波加热降低了饲料原料中EE的含量[11]导致的。因此，微波加热可改善断奶仔猪对饲粮营养物质的表观消化率，降低其采食量，但不影响生长性能。
在断奶早期，仔猪肠道微生物菌落尚未稳定和完善，微生物菌群处于不断变化的过程，易受到外界饲粮、环境等因素的干扰而发生腹泻。本试验结果表明，与NC组和PC组相比，微波加热饲料原料可以降低断奶仔猪的腹泻率。一方面，加热处理后的原料中淀粉[8]和蛋白质[10]的结构都发生改变，增加了饲粮的可消化性，降低了对肠道菌群的应激，有利于肠道微生物区系形成；另一方面，微波加热可以杀灭饲粮中大肠杆菌和霉菌等有害微生物[26]，保证饲料的卫生安全，消灭致病菌的潜在危害，从而降低了断奶仔猪的腹泻率。
3.2 微波加热饲料原料对断奶仔猪血清常规生化、抗氧化和免疫指标的影响血液生化指标可以反映出畜禽机体对营养物质消化吸收代谢水平、健康状态和生长性能等状况，也能反映出部分组织器官机能的变化[27]。血清中ALB的含量可以反映出体内蛋白质代谢和合成能力的强弱[28]，腹泻时造成的肝脏损伤可能降低血清中ALB的含量[29]，而血清中UN的含量能够说明蛋白质在动物体内的代谢情况；血清中TP的含量可反映肝脏蛋白质代谢及机体蛋白质的沉积状态，与免疫球蛋白含量之间存在相关性[30]。ALT主要存在于肝细胞中，血清中ALT和AST的活性高低是反映相应器官功能好坏的重要指标；CREA是动物肌肉分解的主要产物，用于评价肾脏功能的强弱；DAO是仔猪小肠黏膜上皮细胞内的特异性酶，可间接反映畜禽肠道屏障作用的损伤程度[31]。本试验结果表明，微波加热饲料原料可以降低断奶仔猪血清中ET、UN和T-BIL的含量，说明断奶仔猪肠道功能以及肝脏、肾脏等器官功能未造成损伤，可能是因为微波加热改变饲料的化学特性，使抗原蛋白等抗营养因子失活，降低对肠道的损伤，从而保护肠道屏障功能。
动物体内的各种细胞在健康的状况下都会代谢产生自由基，但是自由基过多会对机体产生一定的损害作用[32]，导致疾病的发生。T-AOC则能够反映机体酶及非酶促系统抗氧化水平的高低，SOD和GSH-Px是畜禽体内主要的酶类抗氧化剂，可以清除体内过量的自由基；MDA则是脂质过氧化物的最终产物[33]，反映机体的损伤程度。本试验的研究结果表明，微波加热饲料原料可以显著提高前期断奶仔猪血清中T-AOC和SOD的活性，表明微波加热饲料原料有提高断奶仔猪血清抗氧化能力的效果，其原因可能是微波加热的饲料原料更容易被断奶仔猪消化吸收，有利于促进仔猪肠道绒毛的发育，减少由于消化不良而对肠道造成的一系列氧化损伤，保持肠道的健康，从而提高机体的抗氧化能力和健康水平。
免疫球蛋白在幼龄动物机体免疫系统发生免疫作用具有重要的意义[34]，反映机体免疫能力强弱的重要指标，一般由IgM、IgG和IgA 3类球蛋白组成。IgM是机体防御初期产生的免疫球蛋白；IgA是非特异性免疫的重要组成部分，是机体的第1道防线[35]；IgG占血清中免疫球蛋白的75%[36]，能够抵御和清除抗原。TNF-α是由巨噬细胞和淋巴细胞等分泌的一种细胞因子，具有调节免疫应答、减少感染、修复组织、凋亡肿瘤细胞等功能[37]。关于微波加热饲料原料对畜禽的免疫功能的影响没有报道，本试验结果表明，MH组第35天时断奶仔猪血清中IgA和IgG的含量有增加的趋势，说明微波加热饲料原料能够增强机体的免疫机能，较少疾病的发生。
3.3 微波加热饲料原料对断奶仔猪粪便中VFA含量的影响仔猪的后肠道内大量的微生物形成了一个动态的微生态系统，能够发酵肠道中的膳食纤维形成多种VFA[38](如乙酸、丙酸和丁酸)，而VFA对肠道健康具有保护作用，能为结肠细胞提供所需能量的9%[39]，促进上皮细胞的增殖[40-41]，降低肠道的pH，抑制病原菌的定植。断奶仔猪粪便中VFA的含量可以间接反映肠道的健康程度。Zeng等[42]研究表明，给小鼠饲喂天然莲子抗性淀粉可以改变肠道微生物的菌群结构，增加粪便中VFA的含量。本试验结果表明，MH组断奶仔猪在第35天时粪便中VFA含量略有增加，差异不显著，可能是因为：一方面，微波加热饲料原料有利于肠道微生物的生长代谢，保障了畜禽肠道微生物结构的平衡，有利于后肠道中碳水化合物的发酵；另一方面，微波加热使玉米中一部分淀粉转化为抗性淀粉，为微生物发酵提供充足的底物，与高卫帅[43]的研究结果一致，玉米淀粉通过微波加热的方法可以制备抗性淀粉。
4 结论微波加热饲料原料可以提高断奶仔猪对饲粮营养物质的表观消化率，趋于降低断奶仔猪的腹泻率，增强血清抗氧化能力和免疫功能，降低断奶应激对肠道健康的损伤，对于改善断奶仔猪的生长性能具有一定的效果。
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