2. 华南农业大学兽医学院, 广州 510642
2. College of Veterinary Medicine, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China
B族维生素作为多种辅酶的重要组成成分，参与脂肪、蛋白质、碳水化合物等代谢过程，在维持动物健康生长中具有重要作用[1-5]。B族维生素一般不能由动物机体合成，除了饲粮摄入，肠道微生物合成是机体B族维生素的主要来源[6]。作为肠道微生物的重要代谢产物，B族维生素是肠道微生物与宿主肠道互作的重要载体，在肠道发育、免疫调控及营养代谢中发挥着重要作用。因此，准确掌握B族维生素含量在肠道内的动态变化具有重要意义[7]。B族维生素含量的测定方法如高效液相色谱法(HPLC)[8-9]、高效毛细管电泳法[10]、微生物法[11-12]、分光光度法[13]等，这些方法大多是单项或少数几项B族维生素含量的检测方法，存在耗时长、前处理繁杂、检出限高、特异性低等问题。目前，这些方法主要应用于检测B族维生素含量较高的食品、保健品及饲料预混料。然而，肠道内容物及粪便的成分复杂且部分B族维生素含量极低，传统检测方法难以准确定量肠道中B族维生素含量，导致B族维生素含量动态变化调控肠道健康的研究受到严重限制。最新研究发现，超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)结合多选择反应监测(multiple reaction monitoring, MRM)技术开展靶向代谢组学研究，可以对低含量生物样品进行高效定量测定[12-13]。同时，梁敏慧等[14]建立了UPLC-MS/MS-MRM技术测定食品中叶酸、烟酸、生物素和泛酸含量的方法，王任等[15]通过试验建立了UPLC-MS/MS-MRM技术分析复合维生素片中叶酸和生物素含量的方法。但是，关于高效定量测定猪肠道内容物和粪便中多种B族维生素含量的方法尚缺乏。因此，本研究利用UPLC-MS/MS-MRM技术开展靶向代谢组学分析，通过优化样品前处理步骤和试验条件，高效、定量地检测猪盲肠内容物和粪便中8种B族维生素含量，以期为畜禽肠道B族维生素功能研究提供技术基础。
1 材料与方法 1.1 试剂与仪器甲酸(Sigma-Aldrich, 94318, 美国)、甲醇(Fisher Chemical, A452-4, 美国)、乙腈(Sigma-Aldrich, 34851-4L, 美国)、异丙醇(Fisher Chemical, A461-4, 美国)、B族维生素标准品(Sigma-Aldrich, 美国)，试验用水均为超纯水。
5500 QTRAP质谱仪(AB SCIEX, 美国)、超高效液相色谱系统(Waters ACQUITY UPLC I-Class, 美国)、色谱柱(HSS T3 2.5 μm, 2.1 mm×100 mm, 美国)、低温高速离心机(Eppendorf, 5430R, 美国)。
1.2 仪器条件 1.2.1 超高效液相色谱条件样品采用Waters ACQUITY UPLCI-Class系统进行分离。色谱柱：Waters，HSS T3(2.5 μm, 2.1 mm×100 mm)；柱温：45 ℃；流动相：A液为0.3%甲酸水溶液，B液为甲醇。样品置于8 ℃自动进样器中，流速为300 μL/min，进样量为5 μL。相关液相梯度如下：0~2.0 min，B液为0；2.0~3.0 min，B液从0线性变化到50%；3.0~4.5 min，B液从50%线性变化到100%；4.5~5.5 min，B液从100%线性变化到0；6~11 min，B液为0。
1.2.2 质谱分析条件采用5500 QTRAP质谱仪(AB SCIEX)在正离子模式下进行质谱分析。离子化模式：ESI+，离子喷雾电压:+4 500 V，离子源温度：550 ℃，气帘气(CUR)40.00 psi，雾化气(GS1)55.00 psi，辅助气(GS2)55.00 psi，采用MRM模式检测待测离子对，MRM条件见表 1。
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表 1 MRM条件 Table 1 Conditions of MRM |
取标准品，用水溶液稀释为系列梯度含量的标准工作溶液。维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素B9标准品配制含量依次为0.10、0.25、0.50、1.00、2.50、5.00、10.00、25.00、100.00 ng/mL；烟酰胺和烟酸标准品配制含量依次为5.0、12.5、25.0、50.0、125.0、250.0、500.0、1 250.0、5 000.0 ng/mL；维生素B12标准品配制含量依次为0.50、1.25、2.50、5.00、12.50、25.00、50.00、125.00、500.00 ng/mL；烟酰胺-13C6含量为500 ng/mL。吡哆醛-D3、叶酸-13C5含量均为20 ng/mL。
1.3.2 标准曲线的制作取150 μL标准品工作溶液于1.5 mL离心管中，600 μL甲醇/乙腈(体积比1 : 1)溶液，10 μL内标液，涡旋混匀制备成标准曲线溶液，用同位素内标法建立标准曲线。
1.4 样品采集及处理 1.4.1 样品采集在广东省农业科学院动物科学研究所试验基地，选择24头35日龄断奶仔猪采集粪便样本和盲肠内容物各24份，选择24头63日龄猪采集盲肠内容物样本和粪便样本各24份，样本具体信息见表 2。本试验中所有仔猪21日龄断奶，所有仔猪饲喂猪场统一饲粮。
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表 2 样本基本信息 Table 2 Sample basic information |
称取盲肠内容物和粪便样本200 mg，750 μL甲醇/乙腈/水(体积比2 : 2 : 1)溶液，10 μL内标液，匀浆涡旋混合。
1.5 样品检测将经前处理得的样品溶液利用Eppendorf-5430R低温高速离心机14 000 r/min，4 ℃离心15 min；取500 μL上清液过Ostro板后，37 ℃氮气吹干；加入100 μL 0.3%甲酸水溶液进行复溶，14 000 r/min，4 ℃离心10 min；取上清液至进样小瓶中按上述色谱条件进行分析。样本队列中每间隔一定数量的试验样本设置1个质控样本，用于检测和评价系统的稳定性及重复性。
1.6 数据处理采用Multiquant软件提取色谱峰面积及保留时间。根据标准曲线，计算样品中B族维生素的含量。
2 结果与分析 2.1 B族维生素标准品的提取离子流色谱图(extracted ion chromatogram, XIC)B族维生素的标准品XIC图见图 1，从图中可见各B族维生素的色谱分离较好，峰形尖锐对称，能够对各代谢物进行质谱定量。
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VB1:维生素B1 vitamin B1; Niacin acid:烟酸; Nicotinamide:烟酰胺; Pyridoxal:吡哆醛; VB12:维生素B12 vitamin B12; Pyridoxine:吡哆醇; VB9:维生素B9 vitamin B9; VB2:维生素B2 vitamin B2。 图 1 标准品混合物XIC图谱 Fig. 1 XIC spectrum of standard mixture |
以B族维生素各标准含量为横坐标(X)，以峰面积为纵坐标(Y)做标准曲线后，得到线性回归方程。各待测物含量在线性范围内的线性良好，相关系数r均大于0.995，满足检测需要。方法的线性回归方程、相关系数及线性范围见表 3。
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表 3 8种B族维生素的线性回归方程、相关系数及线性范围 Table 3 Linear regression equation, correlation coefficient and linear ranges of 8 kinds of B vitamins |
维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素B9添加0.4、2.0、20.0 ng/mL标准品溶液进行回收率试验，维生素B3添加80、400、4 000 ng/mL标准品溶液进行回收率试验，维生素B12添加1.6、8.0、80.0 ng/mL标准品溶液进行回收率试验。将所有样品等量混合制备成为质控样本，采用质控样本对检测过程的稳定性进行考察。由表 4可以看出，其平均回收率>89%，RSD值< 18%，说明试验数据稳定可靠。
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表 4 回收率和精密度 Table 4 Recovery rate and precision (n=8) |
将24份35日龄仔猪的粪便样本、24份63日龄仔猪的粪便样本用此方法进行B族维生素含量的测定，样品检出结果如表 5。由表可知，仔猪粪便中烟酸的含量最高，平均值为19 619.99 ng/g，35日龄仔猪粪便中烟酸含量测得的平均值为20 315.60 ng/g，最大值为58 093.78 ng/g，最小值为6 268.05 ng/g；63日龄仔猪粪便中烟酸含量测得的平均值为18 924.38 ng/g，最大值为55 388.18 ng/g，最小值为8 222.01 ng/g。仔猪粪便中维生素B12含量最低，平均值为18.37 ng/g，35日龄仔猪粪便中维生素B12含量测得的平均值为10.92 ng/g，最大值为17.06 ng/g，最小值为8.95 ng/g。63日龄仔猪粪便中维生素B12含量测得的平均值为24.46 ng/g，最大值为82.59 ng/g，最小值为9.17 ng/g。随着日龄的增长，仔猪粪便中的B族维生素除维生素B12外测得的含量均有不同程度的减少。
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表 5 粪便样品检出结果 Table 5 Results of feces samples |
将18份35日龄仔猪的盲肠内容物样本、24份63日龄仔猪的盲肠内容物样本等用此方法进行B族维生素含量的测定，样品检出结果如表 6。由表可知，仔猪盲肠内容物中烟酸含量最高，平均值为15 058.25 ng/g，35日龄仔猪盲肠内容物中烟酸含量测得的平均值为12 095.51 ng/g，最大值为27 791.28 ng/g，最小值为7 158.77 ng/g；63日龄仔猪盲肠内容物中的烟酸含量测得平均值为17 280.31 ng/g，最大值为43 840.81 ng/g，最小值为3 608.92 ng/g。仔猪盲肠内容物中维生素B12含量最低，平均值为13.40 ng/g，35日龄仔猪盲肠内容物中维生素B12含量测得的平均值为12.55 ng/g，最大值为30.11 ng/g，最小值为9.40 ng/g；63日龄仔猪盲肠内容物中维生素B12含量测得的平均值为14.00 ng/g，最大值为38.12 ng/g，最小值为9.30 ng/g。随着日龄的增长，仔猪盲肠内容物中的B族维生素除维生素B1、维生素B6外测得的含量均有不同程度的增加；仔猪粪便中的维生素B1、维生素B6含量随着日龄的增加而减少。
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表 6 盲肠内容物检出结果 Table 6 Results of cecal contents |
B族维生素是肠道微生物的重要代谢产物，也是动物必需的微量营养物质，在维持肠道菌群平衡及肠道免疫稳态中发挥重要作用[16-21]。猪肠道内容物及粪便中B族维生素含量动态检测是研究B族维生素与肠道免疫及肠道微生物互作的必要步骤。目前B族维生素含量检测方法主要应用于B族维生素含量较高的食品、饮料、药品、复合维生素片等[22-24]。食品、饲料中B族维生素含量的标准方法一般首选微生物法，因为微生物法具有干扰小、灵敏度较高、仪器设备要求低等优点，所以被广泛应用，但操作过程繁琐、检测周期较长[25-26]。UPLC-MS/MS-MRM技术具有特异性强、灵敏度高、准确性高等优势，广泛应用于蛋白质组学及代谢组学的研究[27-29]，在食品B族维生素含量检测中也有应用。本研究利用UPLC-MS/MS-MRM技术高效定量地检测出猪肠道内容物及粪便中8种B族维生素的含量。董爽等[30]利用微生物法检测饲料中的烟酸含量，平均回收率98.75%，RSD < 10%，测定结果有效范围为25~500 ng，检测周期1~2 d。本研究测得烟酸的平均回收率为104%，RSD < 5%，回收率、准确度与微生物法基本一致，但检出限更低(0.01~0.10 ng/mL)，检测周期缩短至40 min。Fan等[31]利用HPLC-FLD技术检测茶叶中维生素B3和维生素B7的含量，检测限为2.22~2.56 ng/mL，检测周期2 h。Schmidt等[32]使用HPLC法检测牛奶中维生素B6和维生素B2的含量，平均回收率为91.1%~111.2%，RSD≤6.7%，样本分离时间6 min，检测周期45 min，而本方法维生素B6平均回收率97%~108%，RSD<9.6%，维生素B2平均回收率为108%，RSD < 17.5%。梁敏慧[14]利用UPLC-MS/MS技术分别检测食品中叶酸、烟酸的含量，平均回收率为92.1%~118.1%，RSD为1.49%~5.99%，检测限为0.04~0.40 ng/mL。王任等[15]使用HPLC-MS法测定复合维生素片中维生素B9的平均回收率为99.9%~108.7%，RSD为1.0%，检出限为0.33 μg/g。本方法测得维生素B9平均回收率为103%，RSD为6.81%。目前已报道的B族维生素含量检测方法，多为单项或少数几项B族维生素含量的检测[31-34]。本方法能够高通量检测8种B族维生素含量，回收率与微生物法或液相法回收率基本一致，检出下限较其他方法低。然而，该方法较其他B族维生素含量检测方法对试验仪器设备的要求较高，且部分B族维生素(维生素B1和维生素B2)质控样本RSD略高于其他方法，可能是粪便和肠道内容物中的小分子代谢产物多、成分复杂以及B族维生素衍生物干扰影响了检测结果的准确性。
4 结论本研究采用超高效液相色谱法，以0.3%甲酸水溶液-甲醇为流动相进行梯度洗脱，结合MS在正离子模式下进行质谱分析，MRM模式检测离子对，建立了一种高效、定量检测猪肠道内容物和粪便中8种B族维生素含量的方法，分析时间小于7 min，整个样本检测过程可在40 min内完成，检出下限低(0.01~0.10 ng/mL)，回收率为88.0%~110.0%，质控样本RSD < 18%。本试验建立的猪肠道内容物和粪便中B族维生素含量的检测方法，有利于B族维生素与肠道微生物的互作研究，为畜禽生产中合理应用B族维生素提供技术基础。
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