2. 监利温氏畜牧有限公司, 荆州 434000
2. Jianli Wenshi Livestock Co., Ltd., Jingzhou 434000, China
在现代商业化养殖模式下，各种应激源、营养失衡和持续高产等因素都会对蛋鸡输卵管造成氧化损伤[1-2]。输卵管氧化损伤随着时间在蛋鸡体内不断累积，对生产性能、蛋品质和免疫性能等造成不良影响[3-4]。同时，输卵管氧化损伤也是导致蛋鸡输卵管炎症的潜在诱因，严重威胁蛋鸡的生殖健康[5]。淫羊藿苷是传统中草药淫羊藿的主要活性成分，被《中国药典》选为淫羊藿的质量控制成分[6]。淫羊藿苷已被证明具有骨保护、调节生殖功能、神经保护、免疫保护和抗氧化等药理作用[7]。由于其抗氧化特性，淫羊藿苷对各种与氧化应激有关的疾病表现出良好的缓解与治疗作用[8-10]。同时，淫羊藿苷通过参与调节炎症反应，可缓解机体氧化损伤[11-12]。淫羊藿苷还被发现可以改善卵泡发育，部分恢复衰老小鼠卵巢功能并增强其生育能力[13-14]。之前的研究已经发现淫羊藿苷有利于老年蛋鸡的骨骼健康[15]，但关于其对蛋鸡生产性能、蛋品质、输卵管氧化还原状态和炎性细胞因子的影响还未见报道。因此，本试验旨在研究淫羊藿苷对蛋鸡生产性能、蛋品质、输卵管氧化还原状态和炎性细胞因子基因表达的影响，以期为淫羊藿苷在产蛋鸡生产中的应用提供参考依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料试验所用淫羊藿苷由陕西某有限公司提供，淫羊藿单苷含量为60.12%，其余成分为淫羊藿双苷和淫羊藿黄酮。
1.2 试验设计与饲养管理试验于2018年10月至2019年1月在湖北省武汉市新洲区荷香水美生态农业有限公司进行。采用单因素完全随机分组设计，选取54周龄、生产性能相近的健康罗曼粉蛋鸡216只，随机分为3组，每组6个重复，每个重复12只鸡。对照组饲喂基础饲粮，试验Ⅰ组和试验Ⅱ组分别饲喂在基础饲粮中添加0.05%和0.20%淫羊藿苷(以鲜重为基础)的试验饲粮。预试期1周，正试期12周。
基础饲粮为玉米-豆粕型饲粮，由某饲料公司提供，其组成及营养水平见表 1。试验蛋鸡饲养在5层阶梯式金属产蛋鸡笼内，鸡笼规格为80 cm×80 cm×40 cm，每笼6只。试验期间，蛋鸡自由采食和饮水，温度控制在22 ℃，采用自然光照加人工补光，恒定光照时间为16 h/d。每日饲喂3次(07:00、14:00和19:00)，确保料槽中料量均匀。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) |
试验结束后，每组每个重复随机选取1只蛋鸡进行屠宰，分离出输卵管组织，并用生理盐水冲洗干净，滤纸吸干，锡箔纸包裹后立即放入液氮中，之后于-80 ℃冰箱中冻存。
1.4 测定指标及方法 1.4.1 生产性能每天定时(13:00)收蛋，以重复为单位记录产蛋数和蛋重。以周为单位计算产蛋率、平均蛋重、平均日采食量和料蛋比。
1.4.2 蛋品质于58、62和66周龄时，每组每个重复随机挑选2个鸡蛋进行蛋品质测定。使用蛋壳强度测定仪(Robotmation，日本)测定蛋壳强度，将鸡蛋钝端向上、锐端朝下放到蛋壳强度测定仪上，探头向下移动，当蛋壳出现第1道裂纹时即为蛋壳强度。利用螺旋测微器测定蛋壳厚度，分别取鸡蛋钝端、赤道和锐端的蛋壳进行测定，取三者的平均值作为蛋壳厚度。利用多功能蛋品质分析仪(Robotmation，日本)测定蛋白高度、蛋黄颜色和哈氏单位，具体方法参照文献[16]。
1.4.3 输卵管氧化还原指标剪取部分输卵管组织样品进行研磨，称取1.0 g研磨后样品，用预冷生理盐水稀释成10%的组织匀浆，使用低温离心机2 500 r/min离心15 min，取上清分别测定输卵管组织中的丙二醛(MDA)含量、总抗氧化能力(T-AOC)及总超氧化物歧化酶(T-SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性，上述指标测定所用分析试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。
1.4.4 输卵管炎性细胞因子mRNA相对表达量剪取部分输卵管组织样品于研钵中，进行液氮研磨，取约100 mg研磨后样品于1.5 mL Eppendorf管中，并加入1 mL Trizol(湖南艾科瑞生物工程有限公司)提取总RNA。cDNA合成使用ABScript ⅡRT Master Mix(武汉爱博泰克生物科技有限公司)。反转录得到的cDNA原液需要稀释15倍使用。用实时荧光定量PCR法测定输卵管组织中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素-γ(IFN-γ)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-6(IL-6)和白细胞介素-10(IL-10)的mRNA相对表达量。PCR使用10 μL扩增体系：4.4 μL cDNA，5 μL SYBR MIX(上海星汉生物科技有限公司)，0.3 μL上游引物，0.3 μL下游引物。反应程序为：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸30 s，40个循环，55~95 ℃，每10 s升0.5 ℃作熔解曲线。以β-肌动蛋白(β-actin)为内参基因，目的基因的mRNA相对表达量用2-△△Ct法进行计算，每个样品进行3次平行PCR。通过primer 6.0设计引物序列，引物由生工生物工程股份有限公司(武汉合成部)合成，各引物序列见表 2。
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表 2 引物序列 Table 2 Primer sequences |
所有数据经Excel 2010整理后，使用SPSS 22.0统计软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，Bonferroni法进行多重比较。结果以平均值和集合标准误(SEM)表示，P＜0.05表示差异显著。
2 结果 2.1 淫羊藿苷对蛋鸡生产性能的影响由表 3可知，与对照组相比，试验Ⅱ组蛋鸡的平均蛋重显著提高(P＜0.05)。各组间的产蛋率、平均日采食量和料蛋比均无显著差异(P＞0.05)。
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表 3 淫羊藿苷对蛋鸡生产性能的影响 Table 3 Effects of icariin on performance of laying hens |
由表 4可知，与对照组相比，试验Ⅱ组在蛋鸡66周龄时的蛋白高度显著提高(P＜0.05)。各组间的蛋壳厚度、蛋壳强度、蛋黄颜色和和哈氏单位均无显著差异(P＞0.05)。
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表 4 淫羊藿苷对蛋鸡蛋品质的影响 Table 4 Effects of icariin on egg quality of laying hens |
由表 5可知，与对照组相比，试验Ⅱ组蛋鸡输卵管组织中的MDA含量显著降低(P＜0.05)。各组间输卵管组织中的T-AOC和T-SOD、GSH-Px活性均无显著差异(P＞0.05)。
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表 5 淫羊藿苷对蛋鸡输卵管氧化还原状态的影响 Table 5 Effects of icariin on redox status in oviduct of laying hens |
由表 6可知，试验Ⅰ组和试验Ⅱ组蛋鸡输卵管组织中IFN-γ、IL-4和IL-6的mRNA相对表达量显著低于对照组(P＜0.05)；试验Ⅰ组输卵管组织中IL-10的mRNA相对表达量显著低于对照组(P＜0.05)；试验Ⅱ组输卵管组织中TNF-α的mRNA相对表达量显著低于对照组(P＜0.05)。各组间输卵管组织中IL-1β和IL-2的mRNA相对表达量均无显著差异(P＞0.05)。
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表 6 淫羊藿苷对蛋鸡输卵管炎性细胞因子mRNA相对表达量的影响 Table 6 Effects of icariin on mRNA relative expression levels of inflammatory cytokines in oviduct of laying hens |
关于饲粮中添加淫羊藿苷对蛋鸡生产性能和蛋品质的研究鲜有报道。Park等[17]研究发现，饲喂朝鲜淫羊藿对蛋鸡的产蛋率无显著影响，但显著提高了平均蛋重、蛋白重量和哈氏单位。本研究发现，饲粮中添加淫羊藿苷显著提高了蛋鸡的平均蛋重；同时通过对每周平均蛋重的记录发现，随着蛋鸡周龄的增加，各组的平均蛋重均呈逐渐增加的趋势，但是蛋壳强度和蛋壳厚度却呈逐渐降低的趋势。之前的研究表明，蛋鸡产蛋后期蛋重的增加会导致整体蛋壳质量的下降，从而影响蛋品质[18]。通过对蛋品质的检测发现，饲粮中添加淫羊藿苷未对蛋壳强度和蛋壳厚度造成不良影响，这表明饲粮中添加淫羊藿苷提高蛋重的同时并不会影响蛋壳品质。通过对蛋白高度的检测发现，饲粮中添加0.20%淫羊藿苷在试验第13周时显著提高蛋白高度。Ahn等[19]研究发现，青年蛋鸡蛋重的增加是由蛋黄和蛋白含量的增加引起的，但是老年蛋鸡蛋重的增加完全归因于蛋白含量的增加。这说明淫羊藿苷提高平均蛋重的原因主要是蛋白含量的增加。
3.2 淫羊藿苷对蛋鸡输卵管氧化还原状态的影响我国人均禽蛋占有量达到发达国家水平，禽蛋消费量人均超过20 kg/年[20]。随着现代集约化养殖生产的发展，要求蛋鸡在长时间内能保持良好的产蛋性能。在高强度产蛋压力下，蛋鸡容易受到外界各种应激源的刺激，导致氧化应激[21]。而当氧化应激超过机体自我调整能力时，就会发生氧化损伤[22]。输卵管作为蛋鸡主要的生殖器官，其健康与否直接决定生产性能和蛋品质。Song等[23]研究发现，淫羊藿苷通过线粒体保护和细胞外调节蛋白激酶(ERK)激活，减轻了氧化应激诱导的心肌细胞凋亡。此外，淫羊藿苷还可促进血管生成分化并防止氧化应激诱导的内皮祖细胞自噬[24]。在体外抗氧化试验中，淫羊藿苷能清除1, 1-二苯基-2-苦苯肼自由基和超氧阴离子并抑制脂质过氧化，具有显著的抗氧化能力[25]。在慢性阻塞性肺疾病大鼠模型中，淫羊藿苷能缓减肺组织局部及外周血中的超氧化物歧化酶活性的下降，减轻氧化应激对肺组织的损伤[26]。Xiong等[27]研究发现，淫羊藿苷的磷酸化可通过丝裂原激活的蛋白激酶信号通路减轻鸭肝炎病毒A引起的氧化应激。本试验结果表明，饲粮中添加0.20%淫羊藿苷显著降低了蛋鸡输卵管组织的MDA含量，从而减少了输卵管的氧化应激。
3.3 淫羊藿苷对蛋鸡输卵管炎性细胞因子的影响炎症在外来(病原体)入侵或组织损伤后被激活，在生理上起保护宿主正常功能的作用[28]。细胞因子根据其在炎症中的作用，被分为促炎因子和抗炎因子。其中，促炎因子主要有TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-2和IL-6[29]，抗炎因子有IL-4和IL-10[30]。IL-2与IL-4分泌水平可反映机体的免疫功能强弱[31]。这些细胞因子相互间保持一种平衡状态，但是当这些细胞因子的内在平衡被打破，机体的免疫系统就会遭到破坏。Elhamouly等[32]认为蛋壳的形成过程受到促炎因子、抗炎因子和趋化因子的影响，同时这些因子的平衡表达在衰老蛋鸡中受到破坏。淫羊藿苷在治疗不同疾病中对炎性细胞因子具有多种作用。Zhou等[33]发现淫羊藿苷能下调肿瘤微环境中IL-10、IL-6和TNF-α的mRNA表达。Jia等[34]研究表明，淫羊藿苷减轻了脊髓损伤大鼠的氧化应激并降低炎症因子的水平，增加了抗炎蛋白在受损脊髓中的表达。Li等[35]研究发现，淫羊藿苷可通过减少暴露于香烟烟雾中小鼠炎性因子的产生，从而保护肺功能并减弱炎症反应。以上研究表明，淫羊藿苷可通过不同途径减少炎性反应的发生。Martínez等[36]认为，黄酮类化合物可通过核转录因子-κB信号通路，下调趋化因子和细胞因子表达等方式调节机体免疫。因此，饲粮中添加淫羊藿苷可能通过调节核转录因子-κB信号通路，降低蛋鸡输卵管组织中促炎因子和抗炎因子的mRNA表达量，进而调节老年蛋鸡输卵管内细胞因子的平衡状态，改善输卵管的免疫功能，提高老年蛋鸡的平均蛋重，并对料蛋比有改善趋势。
4 结论蛋鸡饲粮中添加0.20%淫羊藿苷可提高蛋鸡的平均蛋重和蛋白高度，减少蛋鸡输卵管的氧化应激水平，调节输卵管促炎因子和抗炎因子的mRNA表达水平，从而改善输卵管的免疫功能。
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