2. 内蒙古自治区动物营养与饲料科学重点实验室, 内蒙古农业大学动物科学学院, 呼和浩特 010018
2. Inner Mongolia Key Laboratory of Animal Nutrition and Feed Science, College of Animal Science, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China
乳腺炎是全球公认的发病率最高的奶牛疾病,直接导致奶牛乳腺组织炎性损伤、乳腺细胞分泌功能下降、体细胞数增加,从而影响牛奶产量和质量,给奶牛养殖业带来了巨大的经济损失[1]。抗生素是治疗乳腺炎的首选药物,然而由于长期反复使用,引发病原菌耐药性及抗生素残留问题,严重危害人类健康[2]。欧盟和美国分别于2003和2017年起先后做出限用或禁用抗生素作为饲料添加剂的决定[3]。我国农业农村部规定,于2020年底前全面禁止使用饲用抗生素,因此,寻找抗生素替代物迫在眉睫[4]。植物提取物是植物在发育过程中天然产生的次生代谢产物,具有丰富的生物多样性和巨大的药用潜力,是理想的抗生素替代物[5],其开发利用对于防治奶牛乳腺炎、提升牛奶质量、保障人类健康及促进奶牛养殖业健康发展具有重要研究意义。金银花、益母草、蒲公英、连翘是传统的清热解毒类植物,因地域分布范围广、易于采集、功效显著而在奶牛疾病防治中广泛应用。前人研究表明,其提取物中富含多酚、精油、生物碱、皂苷、多糖等活性物质,不仅能改善奶牛生产性能、提升泌乳功能、增强免疫力,还能有效抑制病原微生物、缓解机体炎症反应,防治奶牛疾病的疗效可与抗生素相当,甚至优于抗生素[6-7]。目前采用金银花、益母草、蒲公英、连翘植物提取物防治奶牛乳腺炎多采用乳房灌注剂或喷剂[8-9],对于全株植物提取物混合饲喂效果的研究较少,因此有必要开展植物提取物混合饲喂对于奶牛乳腺炎防治效果的研究。本试验通过在乳腺炎奶牛饲粮中添加复合植物提取物,研究其对乳腺炎奶牛产奶量、干物质采食量、乳成分、体细胞数及血清免疫指标的影响,旨在为植物提取物的开发及奶牛乳腺炎的有效防治提供参考依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料本试验所需金银花、益母草、连翘、蒲公英4种植物提取物购于南京某公司,提取工艺条件为:乙醇浓度55%,提取温度95 ℃,提取2 h。植物提取物中主要活性成分含量由武汉迈特维尔生物科技有限公司测定,详见表 1。
试验于2019年5—7月在内蒙古呼和浩特市托克托县建亭牧场开展。选取胎次、体重、泌乳期及泌乳量相近,体细胞数高于50万个/mL的乳腺炎荷斯坦奶牛10头,随机分为2组,每组5头牛。对照组饲喂全混合日粮(TMR);试验组在饲喂TMR基础上,根据前期体外批次试验结果,按照每头牛每天干物质饲喂量的0.3%添加复合植物提取物(由连翘、蒲公英、益母草、金银花4种全株植物乙醇提取物按重量比1 : 1 : 1 : 1混合制成)。试验期60 d,其中预试期15 d,正试期45 d。
1.3 基础饲粮奶牛的营养需要参照NRC(2001)奶牛饲养标准配制,以TMR形式饲喂,基础饲粮组成及营养水平见表 2。
奶牛饲养管理方式均按照牧场现有方式。每天06:00和17:00分别进行TMR投料,奶牛自由采食,准确记录投料量和余料量。每天07:00和18:00各挤奶1次,准确记录产奶量。
1.5 样品的采集与测定 1.5.1 乳样的采集与测定于试验期第1、15、30、45天采集奶样,按早:晚=6 : 4混合,取50 mL加入溴硝丙二醇防腐剂,置于4 ℃条件下保存,用于乳中体细胞数测定及乳成分分析。其中乳脂率、乳蛋白率、乳糖率及非脂乳固体、总固体含量采用FOSS Milkoscan FT120测定,体细胞数采用Chemometec SCC-100测定。
1.5.2 血样的采集与测定在试验期第1、15、30、45天晨饲前,每头牛使用尾静脉采血方式采集血液样品10 mL。室温静止30 min后3 000×g、4 ℃离心15 min,取血清于-20 ℃冷冻保存。
血清免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白G(IgG)、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-4(IL-4)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量采用酶联免疫法,试剂盒由南京建成生物工程研究所提供,通过Multiskan FC型酶标仪(赛默飞世尔仪器有限公司)进行测定。
1.6 数据统计与分析试验结果以“平均值±标准误”表示,采用SPSS 20.0软件的GLM方法进行方差分析,并用Duncan氏法进行多重比较,以P < 0.05为差异显著。
2 结果 2.1 复合植物提取物对乳腺炎奶牛产奶量的影响由表 3可知,饲粮中添加复合植物提取物能明显提升试验期乳腺炎奶牛产奶量,且随着时间的增加呈先升高后降低趋势。试验第15、30、45天,试验组产奶量比对照组依次显著提高了6.5、6.4、3.1 kg/d(P<0.05),增幅分别为65%、57%、31%,其中第15天增幅最高。第30天试验组产奶量最高,为17.63 kg/d。试验组第30天产奶量显著高于第45天(P<0.05)。
由表 4可知,第15天,试验组干物质采食量比对照组显著提高了0.28 kg/d(P<0.05)。第1、30、45天,试验组干物质采食量与对照组相比无显著差异(P>0.05)。
由表 5可知,与对照组相比,试验组各时间点乳脂率无显著差异(P>0.05);试验组各时间点乳脂率呈现出先增高后降低趋势,其中第15天最高,为4.02%。第45天,试验组乳蛋白率比对照组显著提高了14%(P<0.05)。第30、45天,试验组乳糖率比对照组显著提高了9%和7%(P<0.05);试验组第30天乳糖率最高,显著高于第1天(P<0.05)。第30、45天,试验组非脂乳固体含量比对照组显著提高了7%和9%(P<0.05);试验组第45天非脂乳固体含量显著高于第1天(P<0.05)。与对照组相比,试验组各时间点总固体含量无显著差异(P>0.05),但试验组第15天总固体含量最高。
由表 6可知,与对照组相比,第30天,试验组体细胞数显著减少了66%(P<0.05);第1、15、45天,试验组体细胞数有所降低,分别减少了7%、30%、40%,但差异不显著(P>0.05)。
由表 7可知,与对照组相比,试验组各时间点血清TNF-α含量无显著差异(P>0.05)。第15天,试验组血清IL-2含量比对照组降低了35%,但差异不显著(P>0.05)。试验组血清IL-4含量随着时间的增加先升高后降低,第15天血清IL-4含量最高,显著高于第45天(P<0.05)。与对照组相比,试验组各时间点血清IgA、IgG、IgM含量无显著差异(P>0.05)。
产奶量高低是判断奶牛泌乳性能好坏的关键指标,直接影响奶牛养殖场的经济效益[11]。乳腺炎会导致奶牛乳腺组织炎性病变,乳腺上皮细胞数量和活性降低,乳腺分泌功能受损,造成奶牛产奶量的减少。研究表明,黄酮类、酚类、有机酸等植物提取物能够明显提升乳腺炎奶牛泌乳功能[12]。本试验通过活性成分测定发现,金银花、益母草、连翘、蒲公英提取物中黄酮类和有机酸类占比较高,饲喂4种植物混合提取物能显著增加乳腺炎奶牛产奶量。Olagaray等[13]给奶牛连续60 d饲喂黄芩提取物能显著降低乳腺炎发病率,增加305 d全期泌乳量,提升乳腺健康状态,这可能与黄芩提取物中的黄酮类化合物增强了奶牛泌乳适应性有关。侯昆等[14]研究发现,在饲粮中分别添加30 g/d的竹叶黄酮和60 g/d的青蒿提取物能使隐性乳腺炎荷斯坦奶牛产奶量分别增加8.95%和13.24%。其机制可能是竹叶黄酮和青蒿提取物中黄酮类化合物能够促进催乳素的释放,并通过催乳素受体(PRLR)介导,启动信号转导与转录因子5(STAT5)信号通路,影响奶牛乳腺上皮细胞分泌功能,进而改善乳腺炎奶牛产奶性能[15]。
产奶量作为奶牛最重要的生产指标,受高温影响显著[16]。长期暴露于高温条件下会抑制奶牛催乳素分泌,使STAT5失活,从而导致乳腺上皮细胞总数减少,奶牛产奶量下降[17]。本试验第45天时,对照组和试验组奶牛产奶量与第1天相比分别降低了28%和9%。这可能是由于试验进入7月份,夏季高温引发热应激问题,导致对照组和试验组乳腺炎奶牛产奶量均有所减少,但对照组产奶量降幅波动比试验组更大,表明饲粮中添加复合植物提取物能在一定程度上缓解热应激对乳腺炎奶牛泌乳性能造成的负面影响。这与郭旭东等[18]、Fabris等[19]、Gao等[20]和李军涛等[21]提出的芦丁、γ-氨基丁酸等植物提取物能减小应激刺激,改善奶牛泌乳性能的研究结果一致,植物提取物可能通过催乳素调控STAT5信号转导减轻了热应激对奶牛产奶量的影响。上述结果说明,复合植物提取物能在一定程度上提高乳腺炎奶牛的产奶性能,延缓由于热应激造成的产奶量下降趋势。
3.2 复合植物提取物对乳腺炎奶牛乳品质的影响乳脂、乳蛋白、乳糖等是构成牛奶营养品质的主要物质基础,既涉及食品质量安全与消费者身体健康,又决定着牛奶经济价值与乳企核心竞争力[18]。当泌乳奶牛受到乳腺炎致病菌刺激时,乳成分会发生明显变化。奶牛患乳腺炎后机体产生大量蛋白水解酶,乳蛋白分解使乳蛋白率下降[21]。本试验中,试验组第45天乳蛋白率显著提高,表明饲粮中添加复合植物提取物能在一定程度上提升乳腺炎奶牛乳蛋白含量。徐腾腾等[4]发现,金银花、益母草、连翘、蒲公英复合提取物能显著提高健康奶牛试验第60天乳蛋白率,与本研究结果一致。乳腺炎奶牛乳中白细胞数量增加会产生大量脂解酶,破坏脂肪球膜,乳脂肪被分解为大量游离脂肪酸,造成乳脂率降低[22]。姚琨等[23]研究表明,杜仲叶提取物中含有黄酮类、多糖类以及氨基酸等多种营养活性物质,能促进乳腺炎奶牛饲粮养分的吸收,提高机体内乳脂的合成,增加乳脂率。本研究中,乳腺炎奶牛乳脂率未受复合植物提取物显著影响,可能是由于奶牛产奶量增加导致“稀释效应”,抵消了乳脂率的下降,使得乳脂率维持不变。乳糖能够维持乳汁渗透压,是决定产奶量的重要因素,乳腺炎改变了奶牛乳腺血乳屏障渗透性,使得葡萄糖难以到达乳腺,导致乳糖合成率降低[24]。本试验通过给乳腺炎奶牛添加复合植物提取物,显著提高了第30、45天乳糖率,进而促进了同期产奶量的增加。姚橹等[25]给隐性乳腺炎奶牛饲喂富含绿原酸、珊瑚苷、多糖及黄酮类等活性成分的提取物,能够显著提升试验第12天牛奶中乳糖率,与本研究结果一致。
大肠杆菌等革兰氏阴性菌是诱发奶牛乳腺炎最常见的原因之一。革兰氏阴性菌细胞壁脂多糖(LPS)被认为是奶牛乳腺细胞炎症的重要刺激物,能够抑制奶牛乳腺细胞的增殖,下调乳腺细胞脂肪酸摄取、活化与转运等相关基因表达,从而抑制乳脂合成;影响乳蛋白合成关键基因雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、核糖S6蛋白激酶1(S6K1)、真核翻译起始因子4E结合蛋白1(4EBP1)和STAT5 mRNA转录和蛋白表达,减少乳蛋白合成;通过抑制葡萄糖转运蛋白(GLUT)基因表达影响乳糖合成[26-27]。占今舜[28]利用LPS诱导建立乳腺细胞炎症模型后,添加苜蓿黄酮能提高STAT5 mRNA表达量,促使S6K1蛋白磷酸化,增强含嘧啶基因mRNA的翻译功能,促进乳蛋白的合成,并能通过上调GLUT1、GLUT4和GLUT8 mRNA的表达量,协助血糖进入乳腺细胞,促进乳糖合成。复合植物提取物能够改善乳腺炎奶牛乳成分,其机制是否与改变乳成分合成相关基因蛋白表达量有关,还有待进一步开展细胞学试验验证。
3.3 复合植物提取物对乳腺炎奶牛体细胞数和免疫机能的影响体细胞数指每毫升乳中的体细胞总数,主要由98%~99%的免疫细胞和1%~2%的乳腺上皮细胞组成,是反映奶牛乳腺健康的关键指标[29]。当病原体侵入乳腺组织后,巨噬细胞、淋巴细胞等固有免疫细胞和乳腺上皮细胞等可通过模式识别受体(PRR)与病原体相关分子模式(PAMPs)相互作用,从而激活核转录因子-κB(NF)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号途径,在炎症部位立即分泌细胞因子如TNF-α、IL-2和白细胞介素-1β(IL-1β)等,导致炎症级联反应的发生[30-31]。随后募集大量嗜中性粒细胞到感染位点参与病原体消除,致使乳中的体细胞数迅速增多,预示乳腺炎的发生。一旦病原菌逃脱固有免疫后,乳腺适应性免疫应答反应被激活,乳腺中将会出现高浓度的免疫球蛋白来清除病原菌或者来减缓炎症反应的程度[30]。
存在于天然植物提取物中的生物碱、精油、黄酮类酚类、有机酸等活性成分均具有免疫调节和抗炎特性,能够显著减少乳腺炎奶牛体细胞含量,抑制炎性因子分泌,增强免疫调节功能,从而有效降低奶牛乳腺炎发病率[32-33]。本试验中,第15天时,给乳腺炎奶牛饲粮添加复合植物提取物出现明显抗炎效果,抗炎因子IL-4含量提升至试验期最高值,第30天体细胞数显著减少,表明炎性介质对乳腺的损伤减弱,促使第15~45天产奶量、采食量和乳成分出现不同程度改善。徐腾腾等[4]给健康奶牛饲喂金银花、益母草、连翘、蒲公英复合提取物同样能显著降低试验第30天体细胞数,降低第15、30、45、60天血清IL-2含量,增加第30、45天血清IgA含量,与本研究结果相似。植物提取物的抗炎作用由复杂的细胞机制介导,其中主要与抑制炎症通路关键蛋白磷酸化,进而阻断NF-κB和MAPK信号途径活化有关[34]。金银花、益母草、连翘、蒲公英属于我国传统的清热解毒类植物,被誉为“绿色抗生素”,根据“营养物质活性组学理论”,其作用机制可能是复合植物提取物所含的多种活性成分协同调控的结果。复合植物提取物用于防治奶牛乳腺炎具有良好的抗炎效果,其能否通过抑制乳腺细胞炎症模型NF-κB、MAPK信号通路激活及炎性细胞因子分泌来发挥其抗炎作用有待研究。
4 结论饲粮中添加由金银花、益母草、连翘、蒲公英组成的复合植物提取物能提升乳腺炎奶牛产奶量和干物质采食量,改善乳品质,降低体细胞数,增强机体抗炎能力。
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