2. 湖南友联禾邦生物技术有限公司, 长沙 410007
2. Hunan United-Hope Biotechnology Company, Changsha 410007, China
2019年我国总计进口大豆8 851万t，而国内大豆自产量仅为1 810万t，大豆进口的依赖程度高达80%[1]。在猪价高涨以及各项鼓励生猪养殖措施等因素的影响下，生猪基础产能积极恢复，饲料产量持续增长，豆粕消费量呈增加趋势[2]。但国内大豆的价格不断上涨，养殖成本也随之增加。因此，亟需寻求价格低廉、可利用养分高的饲料原料代替部分豆粕等蛋白质原料。棕榈粕(palm kernel cake)主要来源于东南亚等国家，价格低廉，可用作动物饲料原料，降低饲料成本[3]。棕榈粕营养价值评定及高效利用方法的研究对非常规饲料原料的开发和应用具有重要理论补充和数据支撑意义。Choe等[4]研究表明，使用棕榈粕替代20%的玉米-豆粕型饲粮会影响生长猪的生长性能，但对育肥猪的生长性能、胴体品质和肉品质无显著影响。通过添加外源酶的方法可提高棕榈粕的养分消化率，改善棕榈粕的适口性[5-6]。Kim等[7]研究表明，饲粮中添加5%棕榈粕并补充β-甘露聚糖酶能显著提高生长猪体重和平均日增重，降低料重比。向含有5%棕榈粕的育肥猪饲粮中添加碳水化合物酶，干物质、粗蛋白质和能量消化率分别提高了4.5%、3.4%和4.0%[8]。
然而，不同来源棕榈粕的营养水平往往差异很大。据报道，来自哥斯达黎加的棕榈粕的粗蛋白质含量为14.8%，总能为17.85 MJ/kg，中性洗涤纤维含量为86.9%，酸性洗涤纤维含量为53.8%；而来自西非的棕榈粕粗蛋白质含量高达20.3%，总能为22.54 MJ/kg，中性洗涤纤维含量为77.2%，酸性洗涤纤维含量为52.1%[9-11]。因此，针对不同来源棕榈粕的营养水平，快速筛选出合理的外源酶谱是充分利用棕榈粕的关键。本实验室利用体外快速优化生长猪饲粮酶谱的方法，大大促进了饲粮的养分消化[12]，同时开发的单胃动物仿生消化系统(SDS-Ⅱ)由电脑程序控制模拟饲粮在猪、禽体内的消化过程，在饲料原料生物学效价评价上与动物试验法有较强的相关性，可用于饲料原料养分效价及外源酶有效性的快速评定[13]。因此，本研究利用SDS-Ⅱ建立猪体外模拟消化模型，评价2种不同来源棕榈粕[马来西亚棕榈粕(Malaysia palm kernel cake，MPK)和菲律宾棕榈粕(Philippines palm kernel cake，PPK)]的体外养分效价，并探究不同外源酶组合对2种不同来源棕榈粕的体外干物质消化率(IVDMD)、体外粗蛋白质消化率(IVCPD)、体外能量消化率(IVGED)和酶水解物能值(EHGE)的影响，确定最佳外源酶组合，为棕榈粕的高效利用提供科学依据。
1 材料与方法 1.1 试验材料试验用酶包(enzyme package，EP)均来自于湖南某生物技术有限公司。试验1中，酶包-A(EP-A)包括100 g/t的酸性蛋白酶(50 000 U/g)和120 g/t的中偏碱性蛋白酶(100 000 U/g)；酶包-B(EP-B)包括130 g/t的甘露聚糖酶(50 000 U/g)、39 g/t的木聚糖酶(200 000 U/g)、40 g/t的β-葡聚糖酶(50 000 U/g)、100 g/t的酸性蛋白酶(50 000 U/g)和120 g/t的中偏碱性蛋白酶(100 000 U/g)。试验2中，各酶包组成见表 1。
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表 1 酶包组成 Table 1 Composition of enzyme package |
试验1：采用2×3双因素完全随机设计，设6个组，即分别以不添加外源酶的PPK和MPK原料作为对照组，以及分别向PPK原料中添加EP-A、EP-B和分别向MPK原料中添加EP-A、EP-B作为试验组。试验2：采用单因素完全随机设计，设5个组，各组分别在MPK原料中添加EP0、EP1、EP2、EP3和EP4。以上2个试验的每个组均设5个重复，每个重复1个消化管。四分法采集样品后，用饲料粉碎机粉碎过60目，充分混合均匀后于-20 ℃储存备用。
1.3 试验方法试验使用SDS-II模拟猪整个消化道的消化过程。仿生消化操作过程中透析袋的型号和处理过程，胃、小肠、大肠缓冲液和模拟消化液的制备，SDS-Ⅱ运行参数等试验操作参照《单胃动物仿生消化系统操作手册》及相关文献[14-16]。体外消化过程后，收集仿生消化残渣，计算IVDMD、IVGED、IVCPD和EHGE，公式计算如下：
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式中：M1为上样饲料干物质重量(g)；M2为未消化残渣干物质重量(g)；CP1为上样饲料粗蛋白质重量(g)；CP2为未消化残渣粗蛋白质重量(g)；GE1为上样饲料总能(J)；GE2为未消化残渣总能(J)。
1.4 测定指标及方法2种棕榈粕原料和仿生消化残渣中干物质(DM)含量参考GB/T 6435—2006的方法测定；粗蛋白质(CP)含量参照GB/T 6432—1994的方法，使用KDY-9820凯氏定氮仪测定；总能(GE)参考ISO 9831—1998的方法，使用Parr 6400全自动绝热式氧弹计测定。棕榈粕原料中的粗脂肪(EE)和灰分(Ash)含量分别参考GB/T 6433—2006的方法和GB/T 6438—1992的方法测定；中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维(ADF)含量采用ANK-OM A200i型半自动纤维分析仪，使用滤袋(ANKOM F57)测定。
1.5 数据统计分析采用SAS 9.4的MEANS模块计算基本统计量。试验1为2×3双因素完全随机设计，用SAS 9.4软件的一般线性模型(GLM)程序进行方差分析，分析模型包括不同原料来源效应、不同外源酶组合效应及原料来源与外源酶组合的交互效应，各组数据采用LSD法进行多重比较检验。试验2为单因素完全随机设计，使用SAS 9.4 GLM模块进行方差分析，各组数据采用LSD法进行多重比较检验。结果均以平均值表示，以P < 0.05为差异显著性判断标准。
2 结果 2.1 2种来源棕榈粕常规营养水平和总能由表 2可知，MPK的DM、CP、EE、NDF、ADF、Ash含量和GE与PPK基本相似。
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表 2 2种来源棕榈粕的常规营养水平和总能(干物质基础) Table 2 Conventional nutrient levels and GE of palm kernel meal from two sources (DM basis) |
由表 3可知，不添加外源酶的PPK的IVDMD、IVCPD、IVGED和EHGE分别为23.72%、50.73%、34.02%和6.88 MJ/kg；不添加外源酶的MPK的IVDMD、IVCPD、IVGED和EHGE分别为22.12%、34.52%、33.17%和6.81 MJ/kg。统计显示，PPK的IVDMD、IVCPD和IVGED显著高于MPK(P < 0.05)，但2种来源棕榈粕的EHGE则差异不显著(P>0.05)。
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表 3 不同外源酶组合对2种来源棕榈粕IVDMD、IVCPD、IVGED和EHGE的影响 Table 3 Effects of different combinations of exogenous enzymes on IVDMD, IVCPD, IVGED and EHGE of palm kernel meal from two sources |
外源酶类型极显著影响了2种来源棕榈粕的IVDMD、IVCPD、IVGED和EHGE(P < 0.01)。添加外源酶组合EP-A可使PPK的IVDMD和IVGED分别提高1.39%(P>0.05)和2.77%(P < 0.05)，EHGE提高0.51 MJ/kg(P < 0.05)。添加外源酶组合EP-B则使PPK的IVDMD和IVGED分别提高2.39%(P < 0.05)和3.58%(P < 0.05)，EHGE提高0.69 MJ/kg(P < 0.05)，并且在数值上均高于EP-A的提升作用。添加外源酶组合EP-A和EP-B对PPK的IVCPD的提升作用则没有出现统计上的差异(P>0.05)。
添加外源酶组合EP-B可使MPK的IVCPD和IVGED分别提高4.79%(P < 0.05)和3.01%(P < 0.05)，EHGE提高0.75 MJ/kg(P < 0.05)，提升效果要优于添加外源酶组合EP-A对IVCPD(2.71%)、IVGED(1.77%)以及EHGE(0.39 MJ/kg)的提升作用(P < 0.05)。此外，添加外源酶组合EP-B可使MPK的IVDMD提高2.62%(P < 0.05)，而添加外源酶组合EP-A对MPK的IVDMD提升效果并没有统计上的差异(P>0.05)。
2.3 不同外源酶组合对MPK的IVDMD、IVCPD、IVGED和EHGE的影响为了进一步筛选最优的外源酶组合，本研究继续评价了4种不同外源酶组合对MPK的IVDMD、IVCPD、IVGED和EHGE的影响。由表 4可知，与不添加外源酶的EP0组相比，添加4种外源酶组合均能显著提高MPK的IVDMD、IVCPD、IVGED和EHGE(P < 0.05)；EP4组MPK的IVDMD比EP0组提高了4.5%(P < 0.05)，且显著高于EP1、EP2和EP3组(P < 0.05)。EP1、EP2、EP3和EP4组MPK的IVCPD均显著高于EP0组(P < 0.05)。EP4组MPK的IVGED比EP0组提高了36.32%(P < 0.05)，且显著高于EP1、EP2和EP3组(P < 0.05)。与之相似的是，EP4组MPK的EHGE显著高于EP0组(P < 0.05)，且显著高于EP1、EP2和EP3组(P < 0.05)。
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表 4 不同外源酶组合对MPK的IVDMD、IVCPD、IVGED和EHGE的影响 Table 4 Effects of different combinations of exogenous enzymes on IVDMD, IVCPD, IVGED and EHGE of MPK |
棕榈粕的养分含量与棕榈树的品种，棕榈树生长过程中的水肥、土壤等条件，以及棕榈粕的加工工艺密切相关[17]。Ezieshi等[18]研究发现，使用机械压榨方式生产的棕榈粕油脂残留为8%，而溶剂萃取方法生产的棕榈粕油脂残留仅为1%。此外，如在榨油环节后棕榈果实外壳混入残渣中还会导致棕榈粕粗纤维含量升高。因此，不同来源的棕榈粕原料养分含量差异往往较大。在本研究中，2种来源棕榈粕原料在主要常规养分含量上比较相似，两者CP含量均高于NRC(2012)中浸提棕榈粕的CP含量(14.39%)，但低于压榨棕榈粕(16.64%)。2种棕榈粕原料GE则均高于NRC(2012)中浸提棕榈粕(15.23 MJ/kg)和压榨棕榈粕(15.23 MJ/kg)的GE。
3.2 不同来源棕榈粕的IVDMD、IVCPD、IVGED和EHGE差异本研究结果表明，PPK的IVCPD要比MPK高16.21%，对应的IVDMD和IVGED也均高于MPK，这可能是源头上不同品种、不同地区棕榈树果实在蛋白质品质上的差异造成的[17]。此外，棕榈粕在加工运输过程中的不同温度、挤压和贮存条件等也是影响其养分消化率及能值的重要因素[19]。饼粕类原料在加工过程中过高的温度可能会产生美拉德反应，生成蛋白酶抑制物，进而影响养分的消化、吸收和代谢[20]。彭健等[21]和González-Vega等[22]均发现高温处理的菜粕和豆粕粗蛋白质消化率均会显著降低。赵谋明等[23]使用体外模拟消化法研究发现，热处理及美拉德反应可致后续的模拟消化产物中分子量较大的肽段含量增加，而这也将会减少本试验中透析袋过滤的小分子蛋白质含量，进而影响IVCPD。粗纤维是影响畜禽养分消化率的另一重要因素，粗纤维除自身难以降解而使消化率降低外，还会通过包裹缠绕其他养分降低养分和能量的消化率[24]。Slominski等[25]研究发现，过热处理的饼粕原料中与粗纤维相连的蛋白质含量显著增加，这将造成例如赖氨酸的有效性显著降低，蛋白质消化率降低。以上是本研究中MPK的IVCPD较低的潜在原因，进而也会导致MPK的IVDMD、IVGED相应降低。
3.3 不同外源酶组合对2种来源棕榈粕IVDMD、IVCPD、IVGED和EHGE的影响畜禽动物体内缺少降解饲料中粗纤维的酶，只能通过肠道微生物的发酵作用降解，在胃肠道内粗纤维致密的组织结构还会阻碍消化酶与其他养分的接触，进而降低其他养分的消化吸收[26-27]。另外，粗纤维还可以改变肠道消化生理和食糜的特性，使养分与前段肠道中的消化酶以及后肠中微生物的接触时间缩短，降低养分的消化率[28-29]。本研究中，2种棕榈粕的粗纤维含量较高，相较于其他常规原料，具有较差的适口性和较低的养分消化率，这也是影响其在饲料行业的应用推广的重要因素[30]。
近年来，在饲料中添加外源性酶制剂已公认是提高饲料利用率有效且经济的方式[31]。如外源蛋白酶可以通过断裂肽键，破坏蛋白质的一级结构，从而将饲料中大分子蛋白质水解成小分子多肽和氨基酸，提高其消化率[32]。碳水化合物酶则可以断裂多聚体的长链结构、移除侧链基团，使其致密的网状结构和空间结构发生改变，释放饲料中养分，提高自身及其他养分的消化率[27]。本研究利用SDS-Ⅱ建立猪体外模拟消化模型，探究不同外源酶组合对2种来源棕榈粕原料的酶解效果，结果显示在试验1和试验2中的不同外源酶组合均能不同程度地提升棕榈粕的IVDMD、IVCPD、IVGED和EHGE。这与之前的体内动物试验研究结果相似，即在棕榈粕中添加甘露聚糖酶、蛋白酶和果胶酶能显著提高其粗蛋白质消化率、氨基酸消化率和代谢能[33-34]。陈权军等[35]使用体外法和动物法均发现含有10%棕榈粕的饲粮中添加甘露聚糖酶可显著提高饲粮粗蛋白质的体外消化率和雏鸡的增重。
本研究中，试验1使用的外源酶组合EP-A以外源蛋白酶为主要成分，而外源酶组合EP-B则为含甘露聚糖酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶和外源蛋白酶等多种酶的复合酶。试验结果显示外源酶组合EP-B对MPK和PPK的IVDMD、IVCPD、IVGED和EHGE提升效果要优于EP-A。Jimoh[36]体外消化试验也表明，添加木聚糖酶、多用途酶和植酸酶组成的混合酶对棕榈粕消化率的改善作用优于单独使用其中任何一种单酶。体内试验也表明在含有30%棕榈粕的猪饲粮中添加多功能酶组合能够显著提高猪平均日增重和饲料转化率[37]。以上结果均表明不同种外源酶作用底物不同，配伍使用时互补作用更加明显，对饲料养分消化率的提升效果也更加明显[31]。此外，不同种类、不同来源的饲料原料中粗纤维等养分的含量和组成差异较大，不同种类和剂量的外源酶合理配伍使用是充分发挥其提升饲料养分消化吸收作用的关键[38]。本实验室开发建立的基于生长猪生理消化液组成依据的仿生消化法为高效、快速的筛选最优外源酶组合提供了一个可行的途径[39]。MPK的NDF和ADF含量较高，而本研究中试验2使用的外源酶组合EP4中可降解粗纤维的甘露聚糖酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶的含量高于外源酶组合EP1和EP3，而与外源酶组合EP2相比不含中偏碱性蛋白酶和淀粉酶。本研究中试验2发现外源酶组合EP4对MPK的IVDMD、IVGED和EHGE提升效果显著高于外源酶组合EP1、EP2和EP3，这也将为棕榈粕及相应最优外源酶组合的精准高效应用提供数据支撑。
4 结论① PPK的IVDMD、IVCPD、IVGED均高于MPK，为更加优质的棕榈粕来源。
② 添加外源酶组合EP-A和EP-B均可提高2种来源棕榈粕的IVDMD、IVCPD、IVGED和EHGE，且EP-B效果更佳。
③ 不同外源酶组合对MPK的体外养分消化率的提升效果不同，在本试验条件下，外源酶组合EP4对MPK的酶解效果最佳。
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