在饲料工业中，尤其是水产饲料中，节约鱼粉是亟待解决的重要问题。我国是农业大国，可作为水产饲料的植物蛋白质源的品种众多，来源广泛，价格低廉。随着鱼粉资源日益枯竭以及鱼粉价格的不断升高，植物蛋白质作为鱼粉替代源越来越受到人们的重视，高水平植物蛋白质或无鱼粉饲料将是未来的发展趋势。而对于肉食性鱼类来说，饲料中过高水平的植物蛋白质饲料会导致鱼体代谢紊乱，进而产生脂肪肝等营养代谢性疾病，影响其生长性能甚至导致死亡[1]。研究认为，这种主要与植物蛋白质含有抗营养因子、适口性差等有关，从而限制了植物蛋白质在水产饲料中的利用量。但有研究发现，可通过在水产动物饲料中添加如外源酶制剂[2-3]、核苷酸[4]、益生菌[5]等添加剂来改善植物蛋白质的应用效果。
本团队前期开展了花鲈(Lateolabrax japonicus)对豆粕、花生粕、棉籽粕、菜籽粕和玉米干酒糟及其可溶物(DDGS)5种植物蛋白质源营养物质表观消化率的影响研究，结果发现，花鲈对豆粕和花生粕的营养物质表观消化率与鱼粉比较接近[6]；当等氮替代16%鱼粉(基础饲料含40%鱼粉)时，豆粕效果最好，其次是花生粕[7]。为提高豆粕和花生粕在花鲈饲料中的利用率，本试验以28%鱼粉、30%豆粕和15%花生粕为主要蛋白质源配制基础饲料，并分别添加复合核苷酸、植酸酶、复合芽孢杆菌3种添加剂，研究其对花鲈消化酶活力、前肠组织结构及营养物质表观消化率的影响，旨在为提高植物蛋白质源在花鲈饲料中的应用提供有效途径，并为花鲈实用饲料的配制提供参考。
1 材料与方法 1.1 试验材料晶体赖氨酸纯度为78.8%，晶体蛋氨酸纯度为99%，由广州某生物科技有限公司提供；植酸酶活力为2 500 U/g，由广东某生物科技有限公司提供；复合核苷酸中腺苷酸二钠(AMPNa2) :鸟苷酸二钠(GMPNa2) :胞苷酸二钠(CMPNa2) :尿苷酸二钠(UMPNa2)=1 : 1 : 1 : 1，由南京某生物技术有限责任公司提供；复合芽孢杆菌(枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌)中益生菌数量为5×109 CFU/g，由湛江某饲料有限公司提供。
1.2 试验设计与饲料组成以鱼粉、豆粕和花生粕为主要蛋白质源，以鱼油和豆油为主要脂肪源配制含有28%鱼粉、30%豆粕和15%花生粕的基础饲料，其组成及营养水平见表 1。在基础饲料中分别添加0.06%复合核苷酸、0.04%植酸酶、0.10%复合芽孢杆菌配制3种试验饲料。各饲粮中均添加0.04%三氧化二钇(Y2O3)作为指示剂。饲料原料经粉碎后过60目筛，Y2O3、维生素和矿物质等微量成分按逐级扩大法混匀，然后加入鱼油、豆油、水混匀，用SLX-80型双螺杆挤压机制成直径为2.5 mm的颗粒，50 ℃烘7~8 h，自然冷却后装入密封袋，置于-20 ℃冰箱中保存备用。
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表 1 基础饲料组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) |
花鲈幼鱼购自福建诏安县英港育苗场。试验前暂养在室外水泥池，每天饱食投喂商品料2次，暂养4周。选取体质量为(13.50±0.09) g的花鲈幼鱼320尾，随机分为4组，每组4个重复，每个重复20尾鱼。饲养试验在广东省农业科学院动物科学研究所室内循环水养殖系统进行，对照组(G0组)饲喂基础饲料，3个试验组分别饲喂在基础饲料中添加0.06%复合核苷酸(G1组)、0.04%植酸酶(G2组)、0.10%复合芽孢杆菌(G3组)的试验饲料。养殖系统是由16个直径为80 cm、高为70 cm、容积为350 L(水体容积为300 L)的玻璃纤维桶构成。养殖水源为经过活性炭、珊瑚石过滤后的自来水，流水速率设置为4~5 L/min，养殖过程中24 h连续充氧曝气，每天分别在09:00和18:00投喂饲料，采用表观饱食投喂法，同时根据摄食情况及时调整投饲量。每周换水2次，每次换水量为1/3。饲养期间水温为27.5~32.5 ℃，溶氧浓度>6.0 mg/L，pH 7.3~7.6，氨氮浓度 < 0.10 mg/L，亚硝酸盐浓度 < 0.03 mg/L，自然光源。饲养周期为56 d。
1.4 样品采集待饲养试验结束时，禁食24 h，然后每桶随机选取5尾花鲈置于冰盘内解剖，取出胃、肠道和肝脏，用4 ℃预冷的生理盐水进行冲洗，用吸水纸吸干表面，-80 ℃冰箱保存。每桶另随机选取3尾花鲈置于冰盘内解剖，取出1 cm前肠(根据前中肠结点确定)，固定在福尔马林溶液内。
采样结束后，各桶剩余的鱼恢复正常投喂，暂养1周适应环境。每天投喂2次，每次投喂1 h后用虹吸法除残饵和粪便，之后2 h捞网收集长条状包膜完整的粪便，50 ℃烘干后-20 ℃冰箱中保存备用。连续收集粪便30 d。
1.5 消化酶活力从-80 ℃冰箱中取出胃、肠道和肝脏样品，以1 : 9的比例加入预冷生理盐水匀浆，配制成10%的组织匀浆液，离心后取上清液作为待测酶液。采用福林-酚法测定蛋白酶活力[8]，采用碘-淀粉比色法测定淀粉酶活力[9]，使用脂肪酶测定试剂盒(南京建成生物工程研究所产品)测定脂肪酶活力。
1.6 肠道组织切片取福尔马林固定24 h的前肠样品，按照乙醇梯度脱水、二甲苯透明组织块、包埋、切片、脱蜡、染色、分化、切片脱水复染、封片步骤制作组织切片，用光学显微镜扫描前肠组织，观察并记录相关特性。
1.7 营养物质表观消化率饲料和粪便的水分含量采用105 ℃烘箱干燥法(GB/T 6435—2014)测定；粗蛋白质含量采用凯氏定氮法(GB/T 6432—1994)测定；粗脂肪含量采用(GB/T 6433—2006)索氏抽提法测定；粗灰分含量采用550 ℃灼烧法(GB/T 6438—2008)测定；总能采用氧弹热量计(IKA-C2000)测定。饲料和粪便中Y2O3含量委托广州分析测试中心采用等离子体光谱仪(SPECTRO CIOSCCD)测定。
营养物质表观消化率的计算公式如下：
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试验数据用SPSS 17.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，结果采用平均值±标准差表示，若组间差异显著，则使用Duncan氏法进行多重比较，以P < 0.05为差异显著标准。
2 结果 2.1 消化酶活力由表 2可知，与G0组相比，各试验组前肠、肝脏和胃的蛋白酶活力无显著差异(P>0.05)。G1组前肠脂肪酶活力显著低于G0组(P＜0.05)，其他试验组与G0组无显著差异(P>0.05)。肝脏和胃脂肪酶活力在各组间无显著差异(P>0.05)。与G0组相比，各试验组肝脏淀粉酶活力呈上升趋势，其中G3组与G0组的差异达到显著水平(P < 0.05)。各试验组前肠和胃淀粉酶活力与G0组相比无显著差异(P>0.05)。
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表 2 3种添加剂对花鲈消化酶活力的影响 Table 2 Effects of 3 additives on digestive enzyme activities of Lateolabrax japonicus (n=4) |
由表 3可知，饲料中添加3种添加剂均能显著提高花鲈前肠肌层厚度和绒毛高度(P＜0.05)，以添加植酸酶时效果最显著。
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表 3 3种添加剂对花鲈前肠肌层厚度和绒毛高度的影响 Table 3 Effects of 3 additives on muscular layer thickness and villus height of foregut of Lateolabrax japonicus (n=4) |
如图 1所示，G0组前肠肌肉层较薄，固有结缔组织不紧密，肠道内绒毛脱落较多，部分上皮细胞与固有层分离；G1组前肠肠道内褶皱明显增多，绒毛上杯状细胞排列紧密；G2组前肠肠道结构完整，无损伤，褶皱布满肠腔，肌肉层明显变厚；G3组前肠肌肉层明显变厚，肠道结构完整无损伤，褶皱排列较为紧密，绒毛上杯状细胞排列紧密。
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a：G0组肠道肌层较薄，固有结缔组织不紧密，肠道褶皱长而细，分布稀疏，且多处褶皱受到损伤，箭头示肠道褶皱受到破坏；b：G1组肠道肠壁厚度增加，肠道褶皱长而粗，分布均匀，箭头所示部分褶皱破裂；c、d：G2和G3组肠道肠壁厚度均匀，肠道褶皱长而均匀，分布密集，肠道完整性好。 a: the intestinal wall of the group G0 was thin, tight inherent connective tissue, the intestinal fold was long and thin, the distribution was sparse, and many folds were damaged, arrow showed that the intestinal fold was damaged. b: the intestinal wall thickness of group G1 was increased, the intestinal fold was long and thick, and the distribution was even, and arrows showed that the fold structure was seriously damaged. c and d: the intestinal wall thickness of groups G2 and G3 were uniform, long intestinal folds, uniform with dense distribution and good intestinal integrity. 图 1 3种添加剂对花鲈前肠组织形态的影响(苏木精-伊红染色) Fig. 1 Effects of 3 additives on histological morphology of foregut of Lateolabrax japonicus (HE staining, 100×) |
由表 4可知，G2组的干物质表观消化率最高，显著高于G0和G1组(P＜0.05)，与G3组无显著差异(P>0.05)。粗蛋白质、粗脂肪和总能表观消化率各组间无显著差异(P>0.05)。与G0组相比，G1和G3组粗灰分表观消化率显著升高(P＜0.05)，G2组粗灰分表观消化率则显著降低(P＜0.05)。
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表 4 3种添加剂对花鲈营养物质表观消化率的影响 Table 4 Effects of 3 additives on apparent digestibility of nutrients of Lateolabrax japonicus (n=4) |
消化酶活力是评价水产动物生理消化机能的重要指标，其高低养殖品种、养殖规格、水体环境、饲料、养殖模式、饲养方法等有关[10-11]。外源核苷酸可显著提高异育银鲫(Carassius auratus gibelio)[12]幼鱼肝胰脏蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活力。饲料中添加混合核苷酸能显著提高罗非鱼(Oreochromis niloticus)肠道蛋白酶和淀粉酶活力，对肠道脂肪酶和肝胰脏蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活力的影响不显著[13]。在本试验中，复合核苷酸能显著降低花鲈前肠脂肪酶活力，对其他消化酶活力的影响不显著。豆粕中的胰蛋白酶抑制因子是引起消化道蛋白酶活力下降的重要因素[14]。本试验饲料中添加了30%的豆粕，是否是造成花鲈脂肪酶活力下降的原因呢？关于核苷酸对脂代谢影响的作用机理的研究还比较缺乏，其具体机制并不明确，有待进一步研究。
本试验结果显示，饲料中添加植酸酶能显著提高花鲈肝脏淀粉酶活力，对前肠、胃淀粉酶和肝脏脂肪酶活力无显著影响。植酸酶在水解植物蛋白质中的植酸时，促进了营养物质的充分释放，刺激机体内源消化酶的分泌，进而提高鱼体消化酶活力[15]。有研究发现，随着植酸酶添加量的增加，异育银鲫的肝胰脏淀粉酶活力表现出上升的趋势[16]。但是关于植酸酶对鱼类消化酶活力的影响有不同的报道。饲料中添加1 000 U/kg植酸酶显著提高了黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)胃、肠道蛋白酶和胃淀粉酶活力[17]。饲料中添加500、1 000或1 500 U/kg植酸酶均能显著提高异育银鲫肝胰脏蛋白酶和脂肪酶、肠道脂肪酶活力，显著降低肝胰脏淀粉酶活力[16]。在大菱鲆(Scophthalmus maximus L.)幼鱼饲料中添加1 000或2 000 U/kg植酸酶均显著提高了胃和肠道蛋白酶活力[18]。在不含磷酸二氢钙的基础饲料中添加500、1 000或1 500 U/kg植酸酶均显著提高了红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)幼鱼的肠道脂肪酶和淀粉酶活力[19]。添加1 g/kg植酸酶(2 500 FYT/g)显著提高了奥尼罗非鱼(Oreochromis niloticus×O. aureus)肝胰脏和肠道淀粉酶活力，而对肠道脂肪酶活力无显著影响[20]。植酸酶显著提高鲈鱼胃肠蛋白酶活力，对胃肠淀粉酶和脂肪酶活力无显著影响[21]。出现不同试验结果的原因可能与酶的种类、用量，鱼的品种、大小，饲料配方以及养殖环境不同有关。鱼类各种消化器官都存在淀粉酶，而淀粉酶的分布与鱼的种类有关。
芽孢杆菌具有较强的产酶特性。芽孢杆菌作为水产动物的益生菌，在饲料中添加后在消化道中分泌多种消化酶，促进营养物质消化[22]。芽孢杆菌对水产动物消化酶活力的影响不尽一致。在低鱼粉条件下，适量的枯草芽孢杆菌可显著提高珍珠龙胆石斑鱼(Epinephelus lanceolatu♂ ×Epinephelus fuscoguttatus ♀)肠道蛋白酶和淀粉酶活力[5]。在饲料中添加200或300 mg/kg地衣芽孢杆菌均显著提高异育银鲫食糜蛋白酶和淀粉酶及肠道蛋白酶活力；添加400 mg/kg地衣芽孢杆菌也显著提高了食糜淀粉酶和肠道蛋白酶活力；添加地衣芽孢杆菌对肝胰脏蛋白酶活力无显著影响，但是显著降低了肝胰脏淀粉酶活力[23]。饲料中添加蜡样芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌显著降低了草鱼(Ctenopharyngodon idella)肠道蛋白酶活力，并显著提高了肠道淀粉酶活力[24]。本试验中，饲料中添加复合芽孢杆菌对花鲈前肠、胃和肝脏蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活力的影响不显著。这可能与本试验选用的是枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌复合芽孢杆菌有关，不同芽孢杆菌的作用机制有所差异，再者芽孢杆菌对动物消化酶活力的影响可能受到养殖动物品种、养殖环境、饲养管理方法及芽孢杆菌添加量的影响。
3.2 3种添加剂对花鲈前肠组织结构的影响肠道是消化吸收最主要的器官，是动物快速生长和健康的重要保障，肠道黏膜层形态结构是肠道的基础结构，肠道肌肉层厚度、肠道褶皱高度和厚度增加能增强动物的消化吸收能力。一般认为，当肠道出现上皮细胞脱落、绒毛脱落、肌肉层变薄等病变时，动物的消化吸收能力会显著降低。前肠黏膜皱褶的高低与鱼类食性有一定关系[25]，前肠的组织结构能一定程度反映鱼类的消化吸收能力。本试验结果显示，饲料中添加复合核苷酸、植酸酶和复合芽孢杆菌能显著增加花鲈前肠肌层厚度和绒毛高度。这与前人的研究结果类似。研究发现，饲料中补充外源核苷酸能够提高大黄鱼(Pseudosciaena crocea R.)[26]、凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)[27]的肠道肌肉层(肠壁)厚度和肠道褶皱；饲料中添加复合酶制剂能够降低鲻鱼肠道病变的几率，改善肠道健康[28]；饲料中添加复合酶制剂(主要为植酸酶和碳水化合物酶)可显著增加草鱼肠道绒毛高度和纵截面面积[29]；饲料中添加鼠李糖乳杆菌可以改善尼罗罗非鱼肠道形态结构[30]；饲料中添加芽孢杆菌能增加虎龙斑(E. fuscoguttatus ♀×E. lanceolatus♂)肠绒毛高度[31]。
3.3 3种添加剂对花鲈营养物质表观消化率的影响在真鲷(Pagrus major)幼鱼饲料中添加0.2%腺苷酸(AMP)能提高生长性能、摄食率、饲料转化率和蛋白质效率，改善干物质、粗蛋白质和粗脂肪的表观消化率，其中干物质表观消化率显著高于对照组[32]。在豆粕和花生粕部分替代鱼粉饲料中添加复合核苷酸能显著提高凡纳滨对虾对饲料干物质和粗蛋白质、粗脂肪和磷的表观消化率[33]。饲料中添加复合核苷酸改善了凡纳滨对虾对饲料营养物质的表观消化率，与核苷酸的促摄食、为营养物质合成提供关键辅酶[34]、提高消化酶转运基因表达量[35]等作用有关。而本试验结果显示，饲料中添加复合核苷酸能显著提高花鲈的粗灰分表观消化率，对其他营养物质表观消化率无显著影响。有关水产动物对饲料中粗灰分表观消化率产生影响的机理研究较缺乏，有待进一步研究。
在豆粕和花生粕部分替代鱼粉饲料中添加植酸酶能显著提高凡纳滨对虾对饲料干物质、粗蛋白质、粗脂肪和磷的表观消化率[34]；饲料中添加植酸酶能显著提高黄颡鱼对饲料干物质、粗蛋白质、总能、粗灰分和磷的表观消化率，对粗脂肪表观消化率的影响不显著[16]。低磷低脂饲料和无鱼粉低磷低脂饲料中添加复合酶制剂可以显著提高草鱼干物质、粗蛋白质和磷表观消化率[36]。本试验结果显示，低鱼粉饲料中添加植酸酶显著提高了花鲈干物质表观消化率，对粗蛋白质、粗脂肪和总能表观消化率的影响不显著。通常认为，酶制剂可以通过改变微生物组成影响营养物质的消化吸收，最终改善养殖动物的生长性能。罗非鱼饲料中补充复合酶制剂(植酸酶为主)能改善肠道微生物组成，进而影响其肠道形态[37]。植酸酶可能是通过调节食糜的物理化学性状以及肠道微生物所需营养物质的量，同时提高具有潜在益生效应物质的含量，从而影响肠道微生态的发育，进而影响营养物质的消化吸收。本试验也发现植酸酶能够显著提高花鲈的干物质表观消化率，推测是由于植酸酶可解除植酸与一些内源性酶的结合，释放了部分消化酶，进而提高了对饲料营养物质的消化率。关于水产动物对饲料中粗灰分表观消化率影响的研究较少，本试验结果显示饲料中添加植酸酶能显著降低花鲈的粗灰分表观消化率，其作用机制需作进一步分析。
复合芽孢杆菌对花鲈营养物质表观消化率的作用效果与复合核苷酸的类似，各营养物质的表观消化率较对照组均有提高，其中粗灰分表观消化率显著提高。芽孢杆菌可显著提高奥尼罗非鱼[38]、斑节对虾(Penaeus monodon)[39]饲料中营养物质的表观消化率。这可能有2个方面的原因：一方面，芽孢杆菌在宿主消化道内定植、代谢过程中，可以产生一些消化酶等物质[40]，促进机体的消化系统对营养物质包括矿物质等的消化吸收，提高相关营养物质的表观消化率；另一方面，芽孢杆菌可促进鱼体肠道的生长发育，提高肠壁厚度、肠黏膜高度等，使肠道吸收有效面积增大，进而提高对营养物质的表观消化率。但是关于芽孢杆菌对饲料中粗灰分表观消化率影响的作用机制，尚需作进一步的研究。
4 结论饲料中添加植酸酶能显著提高花鲈肝脏淀粉酶活力和干物质表观消化率，显著降低粗灰分表观消化率；饲料中添加复合核苷酸显著降低花鲈肠道脂肪酶活力，显著提高粗灰分表观表消化率；此外，饲料中添加复合核苷酸、植酸酶或复合芽孢杆菌均能改善花鲈肠道组织结构。
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