2. 吉林农业大学动物生产及产品质量安全教育部重点实验室, 长春 130118;
3. 吉林省动物营养与饲料科学重点实验室, 长春 130118
2. Key Laboratory of Animal Production and Product Quality and Security, Ministry of Education, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China;
3. Jilin Key Laboratory of Animal Nutrition and Feed Science, Changchun 130118, China
胃饥饿素(Ghrelin)，又称生长激素释放肽，是一种由28个氨基酸组成的多肽，由胃底黏膜泌酸腺X/A样细胞产生，约占胃黏膜细胞总数的20%[1]。作为一种多功能肽，Ghrelin广泛分布在下丘脑、垂体、肠道、肾脏、胰脏、胎盘等中枢和外周器官[2]。Ghrelin主要以2种形式存在：去酰基化Ghrelin(des-acyl-ghrelin，DAG)和酰基化Ghrelin(acyl-ghrelin，AG)[3]。Ghrelin作为生长激素促分泌素受体(growth hormone secretagogue receptor，GHSR)的内源性配体，除具有促进垂体释放生长激素(growth hormone，GH)的作用外[4]，还是连接中枢神经系统和参与营养代谢的外周组织的重要方式[2]，在促进摄食、改善胃肠功能、调节脂类代谢和能量平衡等方面也具有广泛作用。研究发现，Ghrelin与其受体GHSR-1a结合后，GHSR-1a会通过释放神经肽Y和影响下丘脑弓状核神经元的刺鼠相关蛋白来促使动物产生饥饿感，从而促进摄食[5]。不仅如此，通过向小鼠脑内注射Ghrelin，可促进脂肪细胞中与脂肪储存相关酶及蛋白的表达[6]，且对脂质代谢存在外周效应，包括增加白色脂肪组织质量、刺激肝脏的脂肪生成等[7]。此外，Ghrelin对提高机体免疫力、改善内分泌功能、治疗心血管疾病等方面均具有重要作用[3, 7-8]。Ghrelin的分泌是一个较为复杂的过程，包括mRNA转录、转录后的翻译、修饰、分泌及在体内的转运等，营养物质的摄入、体内激素水平等因素的变化都会影响到Ghrelin合成和释放的过程[9-10]。目前对于Ghrelin生理功能方面的研究与应用已较为成熟，但关于合成及其分泌过程的相关研究较少。因此，进一步探究Ghrelin合成和释放的机制及其影响因素，对改善动物健康、提高动物生产性能具有重要作用，对Ghrelin在动物生产中的应用也有着重要意义。
1 Ghrelin的合成、分泌及转运 1.1 Ghrelin基因的转录与翻译从Ghrelin基因到Ghrelin肽的过程，需要在Ghrelin基因完成转录后，成熟的Ghrelin mRNA翻译后生成Ghrelin前体蛋白原(Preproghrelin)[11]。人Ghrelin基因定位在3号染色体(3p25-26)上[12]，研究表明，Ghrelin基因中有2个不同的转录起始位点，相对于ATG起始密码子来说，一个发生在-80位，另一个发生在-555位，会产生2个不同的mRNA转录本(转录本-A和转录本-B)，其中转录本-A是胃中Ghrelin mRNA的主要表现形式，而转录本-B上呈现的人类Ghrelin基因中存在1个短的非编码第一外显子[13]。对人和大鼠Ghrelin基因核心启动子序列的研究发现，其上游刺激因子(upstream stimulatory factor，USF)可与Ghrelin启动子内多种具有活性的E-box序列结合，以调节Ghrelin基因的表达，当USF与Ghrelin启动子内同样具有活性的TATA-box序列结合时，USF还可以与RNA聚合酶的转录因子相互作用，间接证明了Ghrelin启动子活性可能通过调节某些重要的蛋白质-蛋白质间的相互作用来实现[14-15]。研究发现，Nkx2.2是一种包含对胰腺Ghrelin细胞分泌重要的转录因子的同源结构域，作为Ghrelin启动子的转录因子，具有增加人Ghrelin mRNA表达的作用[16]。Ghrelin启动子中存在正调控区和负调控区，Shiimura等[17]研究表明，人Ghrelin启动子序列的-1 400和-1 800之间的核苷酸是抑制Ghrelin启动子活性的负调控区，而核因子-κB(NF-κB)可能是参与Ghrelin启动子活性负调控的一个重要的转录因子，上述这些转录因子都可能成为调控Ghrelin基因转录的重要靶点。
1.2 Ghrelin的加工与修饰转录和翻译后的Preproghrelin由117个氨基酸组成，在结构上含有1个N-末端分泌信号肽，该信号肽会在内质网中被丝氨酸蛋白酶移除，成为由94个氨基酸组成的Ghrelin前体蛋白(Proghrelin)[18]。Ghrelin需要通过与GHSR-1a结合才能发挥其生理作用[19]，为实现这一目的，Ghrelin需要将中链脂肪酸(通常是正辛酸)连接到其丝氨酸-3(Ser-3)上，这是一种独特的翻译后修饰的过程，即酰化，由Ghrelin O-酰基转移酶(Ghrelin O-acyltransferase，GOAT)在内质网中进行[20-21]，此过程中需要辛酰基辅酶A(octanoyl-CoA)的参与，将丝氨酸辛酰化，使Proghrelin酰化为酰基化Ghrelin前体蛋白(Acly proghrelin)[22]。激素原转化酶1/3(prohormone convertase 1/3，PC1/3)将Acly proghrelin在单个精氨酸上进行有限的蛋白质水解加工后，形成含有28个氨基酸并具有生物学活性的Ghrelin。
GOAT是一种特异性催化O-酰基酸转移到Ghrelin的Ser-3羟基的酰基转移酶，也是具有多个跨膜结构域的膜结合酶，高度保守[23]。Lim等[24]研究了GOAT mRNA在不同组织中的表达分布，发现GOAT mRNA的表达情况与Ghrelin的分布是相对应的，但在敲除GOAT后，Ghrelin的酰化过程会被完全阻止，说明GOAT是Ghrelin酰化的关键酶。研究发现，应用体外GOAT活性测定的方法，对GOAT底物特异性进行研究，发现Proghrelin中Ser-3及周围的甘氨酸-1(Gly-1)和苯丙氨酸-4(Phe-4)是影响GOAT活性的关键氨基酸[25-26]。Darling等[27]在研究GOAT在Ghrelin中的结合位点时，通过Proghrelin和模拟Ghrelin的N-末端“GSSF”序列的短肽的突变，证实了Ghrelin的N-末端序列的重要性，并确定了Ghrelin结构中前4个氨基酸的侧链对GOAT起主要识别作用。因Ghrelin具有自分泌和旁分泌2种形式，所以GOAT除了酰化Ghrelin的自分泌作用外，对酰化Ghrelin的旁分泌及局部合成作用都可能发挥着重要作用[25, 28]。
激素原转化酶(prohormone convertase，PC)家族作为一类蛋白水解酶，具有催化碱性氨基酸分裂的作用，常见的有PC1/3、PC2等[29]。Walia等[30]通过免疫组化试验证实了胃内Ghrelin免疫阳性细胞中PC1/3与Ghrelin共定位，而未见PC2的免疫染色现象。Seim等[31]研究发现，只有在缺失PC1/3的小鼠胃中才存在完整的Proghrelin，并证明了PC1/3是胃内Proghrelin转化为Ghrelin的关键转化酶，但在胰腺中却发现了Ghrelin免疫阳性细胞中PC1/3及PC2的共定位情况，一些数据也表明在胰腺中PC2同样在Proghrelin的加工与修饰中发挥重要作用，并且可能在局部释放Ghrelin机制中发挥作用，但具体机制尚不清楚[32]。
1.3 Ghrelin在体内的转运研究发现，血液中DAG和AG的比例约为9 : 1[33]，Ghrelin在胃分泌颗粒细胞中形成后，经血液运输到靶器官发挥作用。但AG结构十分不稳定，会影响其跨室转运，特别是跨越血脑屏障[34]。因此，为确保Ghrelin可以顺利通过并充分发挥其作用，还需经过循环酯酶的快速脱酰基作用去除辛烷基，将AG转化为不活跃的去酰基化形式，即DAG[35]。在多种循环酯酶的检测中，丁酰胆碱酯酶(butyrylcholinesterase，BChE)是AG脱酰基的关键酶，主要由哺乳动物的肝脏合成并分泌，广泛存在于机体的大脑、肠、胃、脾脏、肾脏等部位[36]。研究表明，循环中的BChE可以在Ghrelin穿过血脑屏障之前将其水解变成DAG[37]。此外，有研究发现中枢BChE可以调节下丘脑局部产生的Ghrelin，并且对下丘脑各核团有直接影响[38]。最后在BChE作用下，DAG会顺利进入血液，通过血液循环被运送到相应的靶器官，再与这些部位原生质膜的GOAT会发生局部再酰化反应，使Ghrelin再次具有生物学活性，发挥其相应的生物学作用[21]。
2 营养物质对Ghrelin分泌的调控动物在正常生理状态下，Ghrelin水平在摄食之前会有所升高，但在进食后会迅速下降，而食物中的营养物质是产生该作用的主要原因[39]。动物所摄入的葡萄糖、脂类、氨基酸以及微量元素等营养物质，都会影响到动物体内Ghrelin水平。
2.1 葡萄糖葡萄糖是调节体内Ghrelin水平的重要因素之一。静脉注射或口服葡萄糖对胃内Ghrelin mRNA表达及血浆中DAG的酰化都具有明显的抑制作用[40]。Sakata等[41]在体外培养的小鼠胃黏膜原代细胞中添加不同浓度的D-葡萄糖，发现D-葡萄糖浓度较高时Ghrelin释放量减少，但在D-葡萄糖浓度较低时Ghrelin释放量则明显增加。低糖诱导Ghrelin分泌可能与ATP敏感性K+(KATP)通道有关，研究发现在低葡萄糖浓度下，在MGN3-1细胞(一种Ghrelin分泌细胞)培养液中加入KATP通道抑制剂会抑制Ghrelin的分泌，并且，电压依赖性钙离子(Ca2+)通道也会参与这个过程[42]。在不同的葡萄糖环境中，调节葡萄糖应答的各种葡萄糖转运体、通道和酶都可能参与调节Ghrelin分泌，但它们在此过程中的确切作用仍有待研究[43-44]。
2.2 脂类脂类物质对Ghrelin分泌的调控较为复杂，Ghrelin的酰化过程需要有脂肪酸的参与，从乙酸衍生到十四酸(C14 : 0)的脂肪酸都可能会影响到Ghrelin的酰化过程，其中辛酸(C8 : 0)是参与该反应的主要脂肪酸[45]。不同类型的脂肪酸对Ghrelin酰化的影响机制也不尽相同，研究发现摄取中链脂肪酸(MCFAs)或中链三酰甘油(MCTs)可增加胃内AG含量，并且修饰Ghrelin酰基的碳链长度与摄取MCFAs的碳链长度一致，表明摄入的MCFAs直接参与Ghrelin的酰基修饰过程[46]。此外，Lu等[47]通过向幽门结扎小鼠灌胃富含长链脂肪酸(LCFA)的脂质后，血清及胃中Ghrelin水平显著降低。在研究LCFA抑制Ghrelin分泌机制中发现，胃中产生Ghrelin的细胞表面存在大量的G蛋白偶联受体120(G protein coupled receptor 120，GPR120)，作为调节体内外Ghrelin分泌的信号，同时GPR120也是LCFA的受体，所以与进食相关的LCFA增加会与Ghrelin细胞上的GPR120相互作用，从而抑制Ghrelin的分泌[48-49]。
2.3 氨基酸研究发现，一定水平的循环氨基酸会影响体内Ghrelin的分泌[50]。不同的氨基酸对Ghrelin的影响也有所不同。Fukumori等[51]将蛋氨酸及生理盐水混合液连续注入泌乳奶牛的颈静脉，发现血浆中增加的蛋氨酸水平促进了Ghrelin的分泌。此外，胃肠内分泌细胞上的味觉感受器会感知营养物质，并控制激素信号的传递[52]。Vancleef等[53]研究发现，一些功能性氨基酸会通过其特定种类的氨基酸味觉受体，刺激MGN3-1细胞中Ghrelin的分泌，例如L-苯丙氨酸可通过钙敏感受体(CaSR)感知Ghrelin，谷氨酸钠通过味觉受体1型成员1(TAS1R1)和味觉受体1型成员3(TAS1R3)感知Ghrelin等，但由于体内环境复杂，这些局部营养感知机制在体内可能会被间接抑制Ghrelin释放的机制所推翻，其中可能涉及胰岛素或其他信号，还有待进一步研究。
2.4 微量元素铜、锌作为具有促生长作用的微量元素，对动物体内Ghrelin水平以及合成过程均存在一定影响。Zhang等[54]发现，在断奶仔猪饲粮中添加四碱式氯化锌可提高其血浆Ghrelin水平，并促进垂体GH的分泌，进而促进生长。但这种促生长作用可能与采食量无关，Yin等[55]研究表明，氧化锌可刺激胃黏膜细胞产生Ghrelin，但不影响Ghrelin mRNA表达水平，其原因可能是氧化锌在转录后水平上刺激了胃中Ghrelin分泌。G蛋白偶联受体39(GPR39)，也是Ghrelin受体家族的成员之一[56]。锌离子(Zn2+)作为一种激动剂，可通过刺激磷脂酶C(PLC)活性和生成环磷酸腺苷(cAMP)，从而激活GPR39[57]，这可能是Zn2+提高机体内Ghrelin水平的方式之一，但需要进一步的试验来证明这一点。
在铜对机体Ghrelin分泌调节方面，Yang等[58]研究发现，在生长猪饲粮中添加铜可以促进生长猪胃底腺的颈部和基底部Ghrelin免疫阳性细胞的发育，并能促进Ghrelin mRNA的表达。黄元龙[59]研究表明，在绵羊饲粮中添加硫酸铜可提高其皱胃中Ghrelin mRNA及蛋白表达，但具体的作用途径和机制尚未阐明。核转录因子激活蛋白-1(activator protein-1，AP-1)是Ghrelin上游调控因子的结合位点之一[58]。有研究指出，添加低浓度铜可提高AP-1的结合能力[60]，其主要机制为铜会诱导c-Jun N-末端激酶/应激激活蛋白激酶和p38通路磷酸化和活化水平增加，从而激活丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)途径，最终激活转录[61]，这可能是铜调节Ghrelin转录的方式之一。
3 激素对Ghrelin分泌的调控 3.1 生长抑素(somatostatin，SS)SS是胃黏膜中产生的一种多肽，它会以旁分泌的方式抑制Ghrelin的分泌[62]。胃中产生Ghrelin的细胞是封闭型内分泌细胞，与管腔之间没有连续性，并且与胃中产生SS的分泌细胞直接接触，若SS分泌水平升高，则会影响Ghrelin的释放过程[63]。Fukuhara等[64]研究发现，静脉注射SS可降低大鼠血浆中Ghrelin水平，并且对其抑制作用具有剂量和时间的依赖性。Silva等[65]对SS的2种类似物SOM230和奥曲肽进行研究，发现2种物质均对禁食小鼠体内AG的分泌产生了明显的抑制作用，其中奥曲肽对其抑制作用更强。SS受体可能是影响Ghrelin分泌时发挥作用的关键[66]。不仅如此，杜改梅等[67]通过分析断奶前后小鼠胃中GOAT基因的表达规律，提出在胃中SS可能会通过抑制GOAT的表达调控胃酸的分泌，但该试验中并未证实是否是通过调节Ghrelin从而影响到胃酸的分泌。Gahete等[68]通过在培养的小鼠脾细胞中对SS进行基因敲除，发现GOAT的mRNA表达量明显升高，证明了SS对GOAT的表达存在一定的抑制作用，这也是SS调节Ghrelin分泌的途径之一。
3.2 瘦素在结构上，产生瘦素的细胞主要位于胃黏膜的底部，大量的Ghrelin细胞被其紧密包围，故瘦素会以与SS类似的方式在结构上抑制Ghrelin的旁分泌[69]。在体内，空腹状态下血浆中Ghrelin水平与瘦素水平呈负相关趋势[70]。Zhao等[71]试验表明，瘦素会以剂量依赖性的方式直接抑制大鼠胃Ghrelin mRNA的表达，并证明了禁食状态下胃Ghrelin mRNA表达水平的升高，部分原因是通过降低胃瘦素水平来实现。同时瘦素作为长期调节能量平衡、抑制食物摄入并导致体重减轻的介质，在中枢性食欲控制中与Ghrelin的调节是反向的[72]。Nour等[73]研究表明，瘦素可通过磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)-磷酸二酯酶3(PDE3)途径抑制Ghrelin的分泌，并且这种相互作用可能在调节摄食中发挥重要作用。
3.3 胰岛素在机体正常情况下，注射胰岛素后血浆中Ghrelin水平会降低，其原因可能是果糖会提高机体Ghrelin水平，而胰岛素会以激素活性的形式抵抗和影响果糖的摄取能力，以减少酰基Ghrelin水平[74-75]。正常人注射胰岛素后，与胰岛素抵抗个体相比，胰岛素敏感个体的总Ghrelin水平以及AG水平均显著降低，表明Ghrelin的修饰过程可能受到胰岛素敏感性的影响[76]。Seim等[11]从睾丸和LNCaP前列腺癌细胞系中克隆得到与人类Ghrelin基因内含子2中的隐含外显子相对应的胰岛素应答转录因子，命名为in2c-ghrelin，添加胰岛素会显著增加in2c-ghrelin的表达量，该转录因子同时可编码Ghrelin，表明胰岛素可能通过调节Ghrelin的转录因子参与Ghrelin的合成过程。Song等[77]发现，与哺乳动物相比，通过皮下注射胰岛素的方法可增加鸡腺胃中Ghrelin的表达，胰岛素在增加外周Ghrelin的表达时，会下调下丘脑Ghrelin和GHSR-1a的表达水平，从而抑制了中枢Ghrelin/GHSR-1a系统的激活，其机制可能与PI3K途径有关[78]。
3.4 胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)GLP-1具有促进胰岛素分泌、调节动物摄食的作用[79]。研究表明，进食会促进GLP-1的分泌，向体内注射天然的GLP-1，可明显抑制进食一段时间后血浆Ghrelin水平升高的情况，并且通过对血浆中葡萄糖、胰岛素、GLP-1和Ghrelin水平的测定，发现血浆中Ghrelin水平与胰岛素水平呈负相关，说明GLP-1对Ghrelin的抑制作用可能是通过促进胰岛素的分泌间接实现[80]。胰高血糖素样肽-1受体(GLP-1R)在外周和中枢神经系统中均有表达，研究发现GLP-1对Ghrelin的抑制作用与其受体活性有关[81]。Hong等[82]通过向由饮食诱导的肥胖小鼠脑内注射Exendin-4(EX-4，一种GLP-1激动剂)，发现小鼠的下丘脑、胃和血浆中Ghrelin均被抑制，但下丘脑和胃中的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号活性显著增强，当mTORC1信号转导的机制靶点被阻断时，GLP-1和EX-4的作用显著减弱，证实mTORC1是GLP-1R被激活后诱导Ghrelin下调的关键信号通路。
4 影响Ghrelin分泌的其他因素除上述因素外，神经系统调节也是动物机体对于体内Ghrelin水平调节的重要方式。研究人员证实，切除迷走神经后，可使动物因禁食而引起的Ghrelin水平升高消失，并短时间降低体内Ghrelin水平[83]。Mundinger等[84]通过电刺激激活肠交感神经，发现可显著提高大鼠门静脉Ghrelin水平，证明交感神经也可直接刺激Ghrelin分泌，去甲肾上腺素(noradrenaline，NE)可能起到关键作用。Zhao等[85]研究发现，在Ghrelin分泌细胞培养基中添加NE可刺激Ghrelin的分泌，但通过利血平降低小鼠交感神经元肾上腺素能神经递质后，小鼠因禁食引起的Ghrelin水平升高被阻断。Mani等[86]研究表明，NE会通过释放细胞内Ca2+来实现，在这过程中，cAMP及其下游鸟苷酸交换蛋白(EPAC)的激活，也起到重要作用。
5 小结尽管目前对于Ghrelin生理作用的研究有了一定进展，但对调节Ghrelin合成及分泌的分子机制的认识还相对滞后，对于Ghrelin分泌整体过程的系统性研究也相对较少，很多问题还缺乏一致性的结论。Ghrelin合成和分泌的进一步探究，可为更精确地调控Ghrelin的表达、实现Ghrelin的功能奠定基础，也为阐明动物的促生长机制提供理论依据。
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