2. 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所, 农业农村部奶产品质量安全风险评估实验室(北京), 北京 100193;
3. 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所, 农业农村部奶及奶制品质量监督检验测试中心(北京), 北京 100193;
4. 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所, 动物营养学国家重点实验室, 北京 100193
2. Laboratory of Quality and Safety Risk Assessment for Dairy Products of Ministry of Agriculture and Rural Affairs(Beijing), Institute of Animal Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China;
3. Milk and Milk Products Inspection Center of Ministry of Agriculture and Rural Affairs(Beijing), Institute of Animal Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China;
4. State Key Laboratory of Animal Nutrition, Institute of Animal Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China
糠氨酸，即ε-N-2-呋喃甲基-L-赖氨酸，又名呋喃素，是美拉德反应的系列产物之一。糠氨酸的含量可以直接反映牛奶在加工过程中所经历的热处理强度，一般而言，牛奶所经历的热处理强度越强(加热时间越长或加热温度越高)，糠氨酸含量越高；此外，储存过程中糠氨酸含量也规律性增加[1]。因此，国内外常用糠氨酸含量的变化来评价牛奶加工方式或储存方式对奶制品质量的影响[2-3]。我国已经将糠氨酸和乳果糖含量联合用于巴氏杀菌乳和超高温(UHT)灭菌乳中复原乳的鉴定[4]。一系列研究发现，糠氨酸可以抑制HepG2和Hek293细胞体外生长活力[5-6]，小鼠体内试验证明糠氨酸具有肝脏毒性和肾脏毒性[7]，并可以影响睾丸指数、血清激素表达水平和精子质量，并对睾丸组织造成病理损害[8]。因此，准确地、定量地检测乳制品中糠氨酸含量对于科学研究和乳制品质量监管具有重要意义。
目前，糠氨酸含量的检测方法主要有高效液相色谱(HPLC)法[9-10]、超高效液相色谱(UPLC)法[11]、超高效液相色谱-质谱串联(UPLC-MS/MS)法[12]、毛细管电泳-质谱串联(CE-MS/MS)法[13]、稳定同位素稀释-质谱联用法[14]和表面荧光光谱法[15]等。表面荧光光谱法因其灵敏度较低，一般用于半定量分析，因此应用范围有限。CE-MS/MS法虽然分离度较高，但前处理复杂，不适用于大批量样品检测。UPLC-MS/MS法因仪器昂贵、维护成本高，需要专门人员进行操作，也限制了其在实际中的应用。目前，对于液态奶中糠氨酸含量的检测，国际上主要参照ISO18329中的HPLC法[10]，国内主要参照农业行业标准NY/T 939—2016中的HPLC法或UPLC法[4]。尽管国内外对糠氨酸含量的检测做了大量的研究，但对该物质标准品稳定性的研究未见报道。了解标准品物质的稳定性，有助于使定量分析过程准确可靠，对样品检测具有十分重要的意义。陈永艳等[16]对抗生素类标准品稳定性进行了分析，结果显示不同溶剂和温度条件对抗生素稳定性的影响程度不同。周鑫等[17]研究了以甲醇为溶剂介质的氯氰菊酯和氟胺氰菊酯标准溶液的稳定性，结果发现长时间跨度和复杂的温度条件会增加氯氰菊酯和氟胺氰菊酯标准溶液不稳定的风险。因此，研究糠氨酸标准溶液稳定性对于乳及乳制品中糠氨酸定量检测的准确性以及乳制品质量控制具有重要意义。此外，在参照NY/T 939—2016中规定的HPLC法或UPLC法[4]对牛奶中糠氨酸含量进行检测时发现，使用不同批次或不同品牌盐酸水解相同牛奶时结果有时存在差异。Guerra-Hernandez等[18]在检测婴儿米粉中糠氨酸含量时发现，在一定范围内增加水解米粉时所用盐酸浓度会提高糠氨酸含量的检测值。而在参照NY/T 939—2016中规定的HPLC法或UPLC法[4]对牛奶中糠氨酸含量进行检测时，我们发现使用不同批次或不同品牌盐酸水解相同牛奶时结果有时存在差异，因此，推测不同浓度盐酸水解牛奶影响牛奶中糠氨酸的检测结果。因此，本试验研究了不同方式配制的糠氨酸标准溶液在不同储存环境中的稳定性，以期为糠氨酸标准溶液保存和检测结果的可靠性提供一定的依据；同时，本试验还研究了使用不同浓度盐酸水解牛奶对糠氨酸检测结果的影响，以期为更准确地定量检测乳及乳制品中糠氨酸含量提供科学数据支持。
1 材料与方法 1.1 糠氨酸标准溶液的配制糠氨酸标准贮备溶液(500 mg/L)配制：将糠氨酸标准品按标准品证书提供的肽纯度系数换算后，用3 mol/L盐酸配制成标准贮备溶液，-20 ℃下可贮存24个月。
糠氨酸标准中间溶液：移取2 mL糠氨酸标准贮备溶液于10 mL容量瓶中，用3 mol/L盐酸定容，此标准中间溶液浓度为100 mg/L。
糠氨酸标准工作溶液：移取100 μL糠氨酸标准贮备溶液于25 mL容量瓶中，用3 mol/L盐酸液定容，此标准工作溶液浓度为2.0 mg/L。依上述方法分别配制0.05、0.10、0.50、1.00、2.00和5.00 mg/L的糠氨酸标准工作溶液。
1.2 糠氨酸标准溶液储存稳定性研究为了研究糠氨酸标准溶液在不同温度和不同盐酸浓度条件下的稳定性，本试验分别用3个浓度的盐酸(3.0、1.0和0.1 mol/L)配制不同浓度的糠氨酸标准溶液(1和5 mg/L)，并保存于不同温度[-20、4 ℃和室温(25 ℃)]条件下，分别于第1、3、5、8、10、12、14、15、17和21天对保存的糠氨酸标准溶液进行糠氨酸含量检测。每个处理设3个平行。
1.3 不同浓度盐酸水解牛奶对糠氨酸检测结果的影响试验设置11种不同浓度的盐酸水解牛奶，每个浓度设4个平行，分析盐酸浓度对牛奶中糠氨酸检测结果的影响。盐酸浓度用氢氧化钠标准滴定溶液进行标定，试样溶液以溴甲酚绿为指示液，用氢氧化钠标准滴定溶液滴定至溶液由黄色变为蓝色为终点[19]。选择连续的3 d重复同样试验，研究结果的可重复性。取1 mL牛奶和11 mL不同浓度的盐酸(12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2和1 mol/L)于可以密闭的水解管中，密封水解管后放于110 ℃的恒温干燥箱中，加热水解24 h(加热约1 h后轻轻摇动水解管)；加热结束后，取出水解管，冷却后用滤纸过滤，滤液备用。
1.4 水解液中蛋白质含量的测定移取2 mL水解液，参考GB 5009.5—2016[20]中规定的方法用凯氏定氮仪(Foss，丹麦)对水解液中蛋白质含量进行检测。
1.5 糠氨酸含量的测定稳定性试验中的糠氨酸标准溶液可以直接上机检测。测定水解液中的糠氨酸含量时，检测前需先取1 mL水解液与5 mL 6 g/L乙酸铵溶液混合，过0.22 μm滤膜(Waters公司)后再上机测定。
水解液中糠氨酸含量参考NY/T 939—2016[4]中规定的方法利用Waters ACQUITY UPLC H-CLASS UPLC仪(配有紫外检测器及Empower数据处理系统)进行定量检测，方法如下：使用0.1%三氟乙酸水溶液(含6 g/L乙酸铵，流动相A)、甲醇(流动相B)和水(流动相C)为流动相，色谱柱为Waters ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱(2.1 mm×100 mm，粒径1.8 μm)，采用流动相A等度洗脱模式，洗脱速度为0.4 mL/min，柱温为35 ℃，进样量为0.5 μL。定量检测前需先用流动相B和C冲洗色谱柱，再用流动相A和C流动相平衡色谱柱，最后用3 mol/L盐酸检测溶剂纯度、仪器和色谱柱的状态。上述所用试剂均为色谱纯，乙酸铵购于CNW公司，三氟乙酸购于百灵威科技有限公司，甲醇和乙腈购于Thermo Fisher公司。
1.6 数据统计分析试验数据用平均值±标准误表示，采用SAS 9.1.3统计软件中的单因子方差分析(one-way ANOVA)过程进行单因子方差分析，并采用LSD法进行多重比较，P < 0.05为差异显著。
2 结果与分析 2.1 糠氨酸标准溶液的储存稳定性 2.1.1 盐酸浓度对糠氨酸标准溶液储存稳定性的影响本试验采用3种不用浓度的盐酸配制糠氨酸标准溶液，由图 1和图 2可以看出，在相同储存条件下，用低浓度盐酸(0.1 mol/L)配制的糠氨酸溶液稳定性较差，随着储存时间的延长，糠氨酸发生明显的降解。根据糠氨酸的峰面积计算降解率，0.1 mol/L盐酸配制的1 mg/L糠氨酸标准溶液在25 ℃储存8 d时降解率达到23.55%，储存21 d时降解率达到84.27%，4 ℃储存12 d时降解率达到21.75%，储存21 d时降解率达到42.01%，-20 ℃储存8 d时降解率达22.75%，储存21 d时降解率达59.12%，不能够满足试验要求；0.1 mol/L盐酸配制的5 mg/L糠氨酸标准溶液25 ℃储存14 d时降解率达到10.15%，储存21 d时降解率达到14.18%，4 ℃储存17 d时降解率达到10.89%，储存21 d时降解率达到12.19%，-20 ℃储存8 d时降解率达13.10%，储存21 d时降解率达49.39%，不能够满足试验要求；中浓度盐酸(1.0 mol/L)配制的2种浓度的糠氨酸标准溶液(1和5 mg/L)稳定性总体比较好，但5 mg/L糠氨酸标准溶液在-20 ℃储存条件下峰面积波动比较大(18.10%~32.24%)。高浓度盐酸(3.0 mol/L)配制的糠氨酸标准溶液稳定性最好，在-20、4和25 ℃储存21 d后仍保持稳定，满足试验要求。考虑到糠氨酸标准溶液在3.0 mol/L盐酸中稳定性最好，因此，建议用3.0 mol/L盐酸溶解糠氨酸并进行储存。
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图 1 不同浓度盐酸配制的1 mg/L糠氨酸标准溶液在不同温度下的储存稳定性 Fig. 1 Storage stability of 1 mg/L furosine standard solution dissolved in different concentrations of HCl at different temperatures |
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图 2 不同浓度盐酸配制的5 mg/L糠氨酸标准溶液在不同温度下的储存稳定性 Fig. 2 Storage stability of 5 mg/L furosine standard solution dissolved in different concentrations of HCl at different temperatures |
由图 1和图 2可以看出，当糠氨酸溶解于高浓度盐酸(3 mol/L)时，糠氨酸标准溶液稳定性比较好，但温度并不影响糠氨酸标准溶液的稳定性。但是考虑到大批量检测过程中，UPLC样品室的温度一般设定为4 ℃，同时为了尽可能减少冻融对糠氨酸的影响，因此，配制好的糠氨酸标准溶液不建议保存于室温和-20 ℃，建议于4 ℃保存，于21 d内使用。
2.2 盐酸浓度对牛奶中糠氨酸检测结果的影响由图 3和表 1可以看出，一定范围内，随着水解牛奶所用盐酸浓度的升高，糠氨酸的游离程度升高，检测到的糠氨酸含量增加。统计分析后发现，当使用的盐酸浓度达到10 mol/L时，检测到的糠氨酸峰面积趋于平稳，不再发生显著变化(P>0.05)。
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图 3 不同浓度盐酸水解牛奶对糠氨酸检测结果的影响 Fig. 3 Effects of different concentrations of HCl used for milk hydrolysis procedure on furosine detection result |
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表 1 不同浓度盐酸水解牛奶对糠氨酸检测结果的影响 Table 1 Effects of different concentrations of HCl used for milk hydrolysis procedure on furosine detection result |
为了进一步探究上述结果的可重复性，选择连续的3 d重复同样试验。由图 4和表 2可以看出，当水解牛奶所用的盐酸浓度达到10 mol/L时，牛奶中的糠氨酸可以完全水解游离出来，检测到的糠氨酸含量不再发生显著变化(P>0.05)。
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A、B和C表示在不同的3 d进行的3次独立试验。每次试验n=4。 A, B and C represent 3 independent trials performed in 3 separate days. In each trial, n=4. 图 4 不同浓度盐酸水解牛奶对糠氨酸检测结果影响的重复性研究 Fig. 4 Repetitive study on effects of different concentrations of HCl used for milk hydrolysis procedure on furosine detection result |
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表 2 不同浓度盐酸水解牛奶对糠氨酸检测结果影响的可重复性研究 Table 2 Repetitive study on effects of different concentrations of HCl used for milk hydrolysis procedure on furosine detection result |
糠氨酸是牛奶在加热过程中发生“美拉德反应”后的特征性产物之一，其含量可以反映牛奶的质量和营养价值[21]。近些年的一系列研究发现，糠氨酸具有细胞毒性，并对小鼠肝脏、肾脏和睾丸的正常功能产生负面影响[5, 7, 22]。因此，准确测定牛奶中糠氨酸含量对于牛奶加工过程质量控制和科学研究具有重要意义。
目前基于糠氨酸检测的研究比较多[9, 12, 21, 23-27]，但是尚未有研究分析糠氨酸标准溶液的稳定性。本研究考察了糠氨酸标准溶液在不同储存条件下的稳定性。试验发现，糠氨酸受所处溶液环境影响比较大，在相同的储存条件下，糠氨酸溶解在低浓度盐酸(0.1 mol/L)中稳定性较差，在中浓度盐酸(1.0 mol/L)中稳定性较好，在高浓度盐酸(3.0 mol/L)溶液中稳定性最好，这可能是因为糠氨酸本身为酸性分子，较高的酸性环境有利于其结构的稳定。与单纯的糠氨酸溶液不同，牛奶中糠氨酸则会在储存过程中会发生规律性变化，一般而言，储存时间越长，储存时温度越高，糠氨酸含量会越高，室温条件下，每10 d每100 g牛奶蛋白质中糠氨酸含量约增长7 mg，这主要是因为室温条件下牛奶中仍然可以发生缓慢的“美拉德反应”产生新的糠氨酸[1]。而在相同的盐酸浓度(3.0 mol/L)条件下，糠氨酸对温度不敏感，在-20、4 ℃和室温(25 ℃)条件下储存21 d没有明显降解，满足试验需求。但是考虑到在实际样品检测过程中，UPLC样品室温度一般设定为4 ℃，因此建议保存于4 ℃。
此外，本试验还研究了使用不同浓度盐酸水解牛奶对糠氨酸检测结果的影响，结果发现随着水解牛奶所用盐酸浓度的升高，检测到的糠氨酸含量增加，一方面可能是因为低浓度的盐酸不能完全水解牛奶使糠氨酸完全游离出来，随着水解牛奶所用盐酸浓度的升高，糠氨酸游离程度升高；另一方面也可能是因为低浓度的盐酸并不能完全阻止新的“美拉德反应”产生新的糠氨酸。前人研究发现，当牛奶中盐酸浓度达到6 mol/L时，可以完全阻断“美拉德反应”的进行[28-29]。本试验发现，当水解液中盐酸浓度达到9.17 mol/L时，再提高盐酸浓度检测到的糠氨酸含量不再发生显著变化，可能是因为这时牛奶中已经不再发生新的“美拉德反应”，同时糠氨酸已经在盐酸的作用下完全游离出来。因此，建议水解1 mL牛奶所用的盐酸浓度至少为10 mol/L，考虑到牛奶稀释倍数，即牛奶水解液中盐酸浓度应至少达到9.17 mol/L。
本试验通过对糠氨酸标准溶液储存稳定性进行研究，确定了糠氨酸标准溶液的储存条件，可为实验室中糠氨酸标准溶液的配制和保存提供参考依据；同时，本试验通过对牛奶水解所用盐酸浓度进行研究，确定了牛奶水解液中的盐酸浓度，可为更加准确地定量检测牛奶中糠氨酸含量提供数据支持。
4 结论① 糠氨酸标准溶液的储存稳定性受到盐酸浓度的影响，3.0 mol/L盐酸配制的糠氨酸标准溶液稳定性最佳。
② 糠氨酸标准溶液的储存稳定性受储存温度的影响较小，建议将配制好的糠氨酸标准溶液保存于4 ℃，于21 d内使用。
③ 盐酸浓度影响牛奶的水解效果，水解牛奶所用的盐酸浓度应使水解液中盐酸浓度至少达到9.17 mol/L。
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