肉兔是典型的食草性单胃动物，对颗粒料具有偏好性。在自由选择粉料和颗粒料条件下，肉兔对颗粒料的采食量约占95%^[1]。生产上饲料制粒前通常进行蒸汽调质，但也存在不经过水热处理的干压制粒和经过高温高压处理的膨化或膨胀制粒，不同制粒方式对颗粒料加工质量和营养质量以及动物的生长性能和消化生理都有着重要影响。Booth等^[2]研究发现，与干压制粒相比，蒸汽调质和挤压膨化制粒使得银鲈具有更好的生长速度，同时挤压膨化比蒸汽调质制粒提高了干物质和能量消化率，改善了饲料利用效率。在猪、禽上的研究均表明膨胀制粒比蒸汽调质制粒更能提高颗粒料的质量，改善乳仔猪、育肥猪和肉鸡的生产性能^[3-7]。膨胀是介于蒸汽调质和膨化之间的对饲料湿热压处理的方式，可有效提高饲料淀粉糊化率和淀粉消化率^[8-9]，也可促进纤维降解，提高纤维消化率^[10]。肉兔饲粮有别于猪、禽饲粮，具有高纤维低淀粉的特点，膨胀或膨化处理的高温高湿高压对纤维和淀粉都有良好的作用效果。目前有关膨胀制粒工艺在兔料加工中的研究及应用报道极少。因此，本试验在同一饲粮配方下，比较研究干压、蒸汽调质和膨胀3种制粒工艺对肉兔胃肠道发育和肠道生理机能的影响，为兔料生产中选择合适的制粒工艺提供参考。

1 材料与方法 1.1 试验设计与试验动物

采用单因子试验设计，选择72只30日龄、体重(918.85±5.71) g的断奶健康伊高乐商品代肉兔，预饲7 d后按体重相近原则随机分配到3个组，每组6个重复，每个重复4只兔(公母各占1/2)。3组试验兔分别饲喂同一饲粮配方下采用干压、蒸汽调质和膨胀制粒工艺生产的颗粒料，试验期35 d。参考NRC(1977)^[11]家兔营养需要以及De Blas等^[12]的肉兔营养需要推荐量设计基础饲粮(表 1)，原料中玉米、豆粕、菜籽粕、小麦麸、苜蓿草粉和花生壳粉按配方比例采用2.5 mm筛粉碎后均匀混合，按试验设计分别选择制粒工艺。干压制粒为不进行水热处理，直接制粒(饲粮实测营养水平：粗蛋白质，16.21%；粗纤维，14.78%；中性洗涤纤维，30.55%；酸性洗涤纤维，18.89%)；膨胀条件为套筒温度为125 ℃，物料含水率为16%，喂料速度为9 Hz(饲粮实测营养水平：粗蛋白质，15.82%；粗纤维，13.41%；中性洗涤纤维，26.27%；酸性洗涤纤维，18.08%)；蒸汽调质参数为压力0.46~0.50 MPa，调质温度85 ℃，调质时间10~15 s(饲粮实测营养水平：粗蛋白质，16.13%；粗纤维，14.44%；中性洗涤纤维，27.91%；酸性洗涤纤维，18.62%)。饲粮均制成直径为2.5 mm的颗粒料。

1.2 饲养管理

肉兔每2只(公母各1只)饲养于35 cm×45 cm×45 cm的金属笼内，上层和中层2笼兔合并为1个重复。舍内温度(26.34±2.26) ℃，相对湿度(65.54±4.18)%。每日饲喂2次(08:00和17:00)，自由采食和饮水，32日龄注射瘟巴二联苗，采用常规饲养管理。

1.3 指标检测和方法

试验结束当天07:30逐只称重，分别从每个重复中选1只与该组平均体重接近且未出现腹泻史的试验兔屠宰，快速分离肠段，采集十二指肠食糜2 mL、盲肠食糜10 mL于灭菌EP管中，液氮冷冻保存待测。取出十二指肠、空肠和回肠组织，用生理盐水冲洗干净，分别剪取2~3 cm的中段组织样放入4%多聚甲醛溶液中浸泡保存。

1.3.1 胃肠道发育指标

取胃、小肠和盲肠，称重后计算胃、小肠和盲肠比重。

1.3.2 小肠黏膜形态结构

十二指肠、空肠和回肠组织样品在4%多聚甲醛溶液中固定24 h，然后经脱水、浸腊、包埋、切片等处理，制成石蜡切片，再以苏木精-伊红染色，封片后在光学显微镜下进行观察，测量十二指肠、空肠和回肠的绒毛高度和隐窝深度，并计算绒隐比(V/C)。

1.3.3 肠道消化酶活性

十二指肠食糜的淀粉酶、脂肪酶和胰蛋白酶活性采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒进行测定，按照试剂盒说明书严格操作。盲肠食糜的纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶活性采用3, 5-二硝基水杨酸(DNS)法测定。

1.3.4 盲肠pH、微生物数量及其代谢产物

盲肠食糜在取出后立即用pH-3B型酸度计测定pH；挥发性脂肪酸含量采用CP-3800型气相色谱仪(美国瓦里安)测定；氨态氮含量采用比色法测定。盲肠食糜总菌、大肠杆菌、乳酸杆菌及双歧杆菌的16S rRNA基因的拷贝数采用实时荧光定量PCR分析仪测定。

1.4 数据统计与分析

试验数据采用SPSS 20.0统计软件进行单因素方差分析和Duncan氏法多重比较。结果以平均值±标准差表示，P＞0.05表示差异不显著，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析 2.1 饲料膨胀制粒对肉兔胃肠道发育的影响

由表 2可以看出，与干压和蒸汽调质制粒相比，膨胀制粒显著降低胃重和胃比重(P＜0.05)，显著提高小肠重和小肠比重(P＜0.05)，对盲肠重和盲肠比重无显著影响(P＞0.05)。

2.2 膨胀制粒对肉兔小肠黏膜形态结构的影响

由表 3可知，膨胀制粒比蒸汽调质制粒显著提高了十二指肠绒毛高度(P＜0.05)，比干压制粒显著降低了十二指肠隐窝深度(P＜0.05)，比蒸汽调质和干压制粒显著提高了十二指肠绒隐比(P＜0.05)。空肠和回肠绒毛高度、隐窝深度、绒隐比不同制粒工艺间无显著差异(P＞0.05)。

2.3 膨胀制粒对肉兔肠道消化酶活性的影响

由表 4可知，膨胀制粒比干压制粒显著提高了十二指肠脂肪酶活性(P＜0.05)，比干压和蒸汽调质制粒显著提高了淀粉酶活性(P＜0.05)，十二指肠胰蛋白酶活性不同制粒工艺间无显著差异(P＞0.05)。膨胀制粒比干压制粒显著降低了盲肠纤维素酶活性(P＜0.05)，比干压和蒸汽调质制粒显著提高了盲肠半纤维素酶活性(P＜0.05)，比干压制粒显著提高了盲肠果胶酶活性(P＜0.05)。

2.4 膨胀制粒对肉兔盲肠pH、微生物数量及其代谢产物的影响

由表 5可知，膨胀制粒比干压和蒸汽调质制粒显著降低了盲肠氨态氮含量(P＜0.05)，盲肠pH、总挥发性脂肪酸含量及各挥发性脂肪酸比例不同制粒工艺间无显著差异(P＞0.05)。盲肠总菌数量和大肠杆菌数量不同制粒工艺间无显著差异(P＞0.05)，但膨化制粒比干压和蒸汽调质制粒显著提高了盲肠双歧杆菌数量(P＜0.05)，比干压制粒显著提高了盲肠乳酸杆菌数量(P＜0.05)。

3 讨论 3.1 膨胀制粒对肉兔胃肠道发育和肠道黏膜形态的影响

家兔消化系统一般占体重的10%~20%，消化道正常发育在养分消化吸收和肠道健康方面发挥重要作用。García等^[13]认为胃肠道重量和指数可以用于评估家兔消化道发育，一定程度反映消化道代谢与功能。有关膨胀或膨化制粒工艺对动物消化道发育的影响结果不尽一致。Boroojeni等^[14]研究表明，与蒸汽调质制粒组相比，膨胀制粒组肉鸡胃、十二指肠、回肠、盲肠重量和相对重量没有差异，但膨胀制粒可显著提高空肠和小肠的相对重量。但González-Alvarado等^[15-16]认为膨化制粒对肉仔鸡消化器官比重没有显著影响。本研究发现，膨胀制粒促进了小肠发育，对盲肠发育无显著影响。这可能是由于膨胀制粒改善了饲粮的消化特性，更有利于小肠的消化吸收，促进小肠比重的增加。肉兔盲肠重受饲粮木质素含量影响最大^[17]，本课题组前期的研究发现膨胀制粒不会显著降低饲粮酸性洗涤纤维含量^[18]，本次试验测得饲粮酸性洗涤纤维含量也变化不大(干压、蒸汽调质和膨胀制粒饲粮酸性洗涤纤维含量分别为18.89%、18.62%和18.08%)，故对盲肠重及比重未造成显著影响。

小肠是养分消化吸收的主要场所，小肠黏膜形态影响动物肠道健康和养分消化吸收。本研究发现，膨胀制粒提高了十二指肠绒毛高度和绒隐比，对空肠和回肠黏膜形态无显著影响。膨胀处理可以改变物料的物理化学特性和减少霉菌总数^[19-20]，提高饲料的消化率^{[10, 21]}，增加肉兔肠道能量和其他养分的摄入量，减少饲粮中过硬的木质纤维素和霉菌毒素对小肠绒毛的损伤。章红兵等^[22]在断奶仔猪饲粮中使用膨化玉米显著提高了十二指肠的绒毛高度，降低了空肠中段的隐窝深度。但Yang等^[23]发现对生长育肥猪饲粮采用膨胀处理并未改变肠道绒毛高度和隐窝深度。对不同饲粮类型进行膨胀处理对不同动物肠道黏膜的影响可能存在差异。研究发现，膨胀处理降低肉兔饲粮淀粉糊化度提高，酸性洗涤纤维和中性洗涤纤维消化率提高^[18]，这可能与十二指肠黏膜形态改善有关。Chiou等^[24]发现饲粮酸性洗涤纤维下降，中性洗涤纤维与淀粉比例适中提高了家兔十二指肠绒毛高度。

3.2 膨胀制粒对肉兔肠道消化酶活性和盲肠微生物代谢的影响

家兔作为草食性单胃动物，对饲料的消化主要依靠消化道分泌的酶如蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶进行化学性消化。家兔肠道本身不分泌纤维素酶，但可通过盲肠微生物发酵纤维类物质产生，以完成对纤维的分解。肠道食糜中淀粉酶活性可作为反映淀粉消化的较好指标。刘春生等^[25]研究表明，膨化处理可提高饲粮的淀粉糊化度，提高断奶仔猪肠道麦芽糖酶、糖化酶和淀粉酶活性。胡毅等^[26]报道随膨化饲料碳水化合物水平的增加，草鱼肠道胰蛋白酶和淀粉酶活性先下降后升高。本研究表明，与干压和蒸汽调质制粒相比，膨胀制粒提高了十二指肠脂肪酶和淀粉酶活性。这与Gao等^[27]的研究结果基本一致，他们发现，与蒸汽调质制粒相比，膨胀制粒显著提高鲤鱼小肠胰蛋白酶、糜蛋白酶、淀粉酶活性。其原因可能在于膨胀的高温高压提高了淀粉的糊化度^{[18, 28]}和破坏了脂肪粒细胞，从而刺激肠道淀粉酶和脂肪酶的分泌。纤维在盲肠微生物作用下产生挥发性脂肪酸是肉兔能量来源之一，纤维结构影响盲肠微生物有关纤维素酶的产生。本研究还发现，膨胀制粒较干压和蒸汽调质制粒提高了盲肠半纤维素酶和果胶酶活性，降低了纤维素酶活性，说明膨胀有助于可溶性纤维的分解利用。有研究表明，膨化处理的高温高压使小麦麸和黑麦麸高纤维饲粮中β-葡聚糖的分子质量下降^[29]，纤维可溶性增加^[30]，粗纤维消化率升高。

家兔盲肠微生物区系稳定在纤维的消化和肠道健康方面发挥重要作用。盲肠pH和挥发性脂肪酸含量可以用来估测盲肠微生物发酵活性。影响盲肠微生物发酵活性的主要因素是饲粮纤维水平、纤维摄入量和饲粮在盲肠中的停留时间^{[13, 31]}。本研究表明，膨胀制粒降低了盲肠氨态氮含量，但对盲肠pH、总挥发性脂肪酸含量及乙酸、丙酸、丁酸比例没有显著影响。本课题组前期的研究结果发现膨胀制粒不会明显降低饲粮的粗纤维含量，对肉兔采食量也无显著影响^[18]，说明纤维摄入量稳定，维持了盲肠发酵模式的稳定。盲肠氨态氮含量的降低可能与膨胀制粒改善饲粮蛋白质质量，提高其消化率，降低进入盲肠的蛋白质的量有关。Durmic等^[32]和Kim等^[33]采用膨化小麦、高粱和大米饲喂猪后也发现显著降低了肠道食糜氨态氮含量。家兔盲肠微生物数量和菌群结构与盲肠发酵活性关系密切。肠道菌群可分为益生菌和有害菌，其中双歧杆菌和乳酸杆菌是肠道益生菌，具有抗感染，增强动物抵抗力和抑制有害菌群的功效^[34]。本研究还发现，膨胀对盲肠总菌和大肠杆菌数量无显著影响，但改变了菌群结构，提高了双歧杆菌和乳酸杆菌的数量，说明膨胀处理主要通过提升肠道有益菌来改善肠道健康，可能因为膨胀处理改变饲粮养分结构，特别是纤维结构，能提供更多益生菌繁殖生长的底物，更有利益生菌总量的增加。这与Kim等^[35]的研究结果不一致，他们指出膨胀处理降低了肉鸡肌胃乳酸杆菌属数量，提高了梭菌属数量。不一致的原因可能在于饲粮结构、动物种属和菌群取样部位不同。

4 结论

本试验条件下，膨胀制粒可改善肉兔肠道黏膜形态结构，增强肠道消化酶活性，促进小肠发育，并有利于盲肠益生菌的繁殖，提高肠道健康。推荐肉兔饲粮加工采用膨胀制粒工艺。