蛋壳是禽蛋重要的保护壳，保护内容物免受外界应力破损和病菌等微生物的侵染，在种蛋孵化过程中提供钙源等营养成分，是禽蛋重要的表观和经济性状。蛋壳主要由碳酸钙和有机基质组成，其中碳酸钙占蛋壳组分的96%以上，是构成蛋壳结构的重要部分，维持蛋壳的结构和功能^[1]。蛋壳的钙化在子宫内进行，通过钙化起始、线性沉积和钙化末期3个阶段，逐渐形成蛋壳的乳突层、栅栏层、垂直晶体层和胶护膜，构成完整的蛋壳结构^[2]。蛋禽体内钙的总量为20~23 g，每产1枚蛋需消耗2.2~2.3 g钙，即每天有10%的钙需要更换^[3]。因此，体内钙离子的代谢直接影响蛋壳的形成和品质，明确蛋禽体内的钙代谢机制及影响因素，可为蛋壳品质的调控研究提供思路。

1 蛋壳形成的钙代谢机制

在蛋壳形成的动态时序过程中，子宫上皮细胞不断从血液中摄入钙离子然后分泌到子宫腔内，与碳酸氢根离子共同作用，沉积形成碳酸钙，而血液中钙离子一部分通过肠道吸收，另一部分来源于髓质骨(动态钙源库)的动员。因此，蛋禽体内钙离子的代谢及其调控机制，对蛋壳形成和品质具有重要作用。

1.1 钙离子在肠道的吸收转运

蛋壳开始钙化时，肠道内钙离子浓度大幅度增加，达到12 mmol/L^[4]。肠道对钙离子的吸收主要在十二指肠，对钙的吸收率达90%，主要通过主动转运，少部分通过被动扩散进行^[5]。钙离子在上皮细胞的主动转运主要包括：1)钙离子通过顶膜上的上皮钙离子通道(TRPV)顺梯度进入细胞；2)通过基底膜上的钙结合蛋白完成细胞内钙离子转运；3)通过基底膜上钙泵[如转运载体钙离子/钠离子交换器(NCX)和基底外侧质膜钙ATP酶被挤出基膜]主动泵入肠腔内^[6]。在此过程中，离子载体发挥重要作用：1)TRPV，蛋鸡十二指肠中转运钙离子的通道主要是TRPV6^[7]，还存在少量的TRPV2，促使钙离子进入上皮细胞^[8]。2)钙结合蛋白D28k(CALB1)，是钙转运的主要蛋白，在肠上皮细胞高水平表达，与肠上皮细胞转移钙的能力高度相关^[9]。CALB1含量提高主要与卵蛋进入子宫和蛋壳形成有关，钙的吸收增加，肠道中CALB1的含量及其表达量增加；产软蛋时，肠道内CALB1含量降低1/2，当蛋壳形成恢复后，CALB1及其mRNA表达水平显著增加^[10]，产蛋停止，肠道CALB1含量下降^[9]。3)NCX，主要有NCX1和NCX3，可将钙离子逆浓度转运^[5-6]。4)钙泵[钙离子-ATP酶(PMCA)或ATP]，可利用ATP将钙离子转运至细胞外而降低细胞内外电位差，主要有内质网钙离子泵3型(ATP2A3)、质膜钙转运ATP酶1(ATP2B1)、质膜钙转运ATP酶2(ATP2B2)和质膜钙转运ATP酶4(ATP2B4)^[6]。在上述载体的作用下，大部分的钙离子被肠道吸收。

1.2 髓骨钙的形成和动员

蛋禽性成熟后，从饲粮摄入的钙会优先储存在髓质骨(包括胫骨、肱骨、股骨)中，作为产蛋期蛋壳形成的动态钙源，可提供蛋壳约40%的钙，在低钙饲粮中，甚至会提供60%的钙^[11]。髓质骨由成骨细胞沉积，约占总骨钙的11.7%，是一种非结构性骨，缺乏机械抗性，从骨内膜表面生长填满骨髓腔^[12]。髓质骨的矿物盐含量和结晶度较低，矿物颗粒较薄短^[13]，与细胞外有机基质(由非胶原蛋白、糖蛋白、蛋白多糖组成)相互作用，作为钙的动态储存库，有机基质是髓质骨快速矿化和脱矿的重要条件。髓质骨的表面积大，血管密集，代谢速率是皮质骨的10~15倍^[12]。髓质骨的这些特性，成为蛋壳钙化过程中的重要动态来源，尤其在蛋壳钙化末期，由于夜间饲粮钙供应不足，髓质骨大量破骨产生钙离子供蛋壳形成。随着蛋禽年龄的增加，肠道对钙的吸收量减少且机体利用骨钙的能力下降^[14]，蛋禽体内每天有10%的钙需要更换，当吸收的钙或利用的骨钙不足以达到蛋壳形成所需，就会出现产蛋减少，蛋壳变薄、变脆的现象，甚至产生软壳蛋、无壳蛋等^[15]。因此，髓骨钙的形成和动员，也是影响蛋壳品质形成过程中钙离子代谢的重要因素。

1.3 钙离子在子宫的转运分泌

子宫内钙离子的分泌是影响蛋壳碳酸钙沉积的直接因素。产卵后6~22 h，碳酸钙以0.33 g/h的速度线性沉积在蛋壳腺(子宫)内。子宫钙离子的分泌不是持续的，与排卵过程同步，当卵到达子宫时，受到刺激启动钙离子的分泌^[5]。蛋壳钙化阶段，血浆钙离子浓度(1.2 mmol/L)与子宫腔中钙离子浓度(6~10 mmol/L)之间存在较大的浓度差^[16]。钙离子在子宫部位的转运分泌，主要通过管状腺细胞，逆浓度梯度向子宫腔内转移大量的钙离子，同时保持细胞内低浓度的钙(< 0.000 2 mmol/L)。上皮管状腺细胞分泌的钙离子主要涉及TRPV(细胞摄取/进入)、CALB1(细胞内转移)、内质网钙离子泵2型(ATP2A2)和ATP2A3(内质网摄取)以及肌醇三磷酸受体1型、2型和3型(ITPR1、ITPR2和ITPR3，由网状细胞输出)，然后通过ATP2B1和ATP2B2以及NCX1和NCX3(SLC8A1和SLC8A3)将钙离子从腺细胞中泵出。与十二指肠上皮细胞不同，子宫管状腺细胞中可能不存在TRPV6，而TRPV2和TRPV3可能是钙通道的重要离子载体^[17]，但有待进一步确定。与肠道相比，蛋壳腺管状腺细胞钙离子分泌的载体更多更复杂，还存在许多其他载体，如碳酸酐酶7，可促进碳酸氢根离子生成；钠离子/碳酸氢根离子转运蛋白，主要有溶质载体家族4成员5(SLC4A5)、成员7(SLC4A7)、成员9(SLC4A9)；钠离子通道，主要有氨酰敏感钠通道亚基α(SCNN1A)、亚基β(SCNN1B)、亚基γ(SCNN1G)等。钙和碳酸氢盐从血液转移到子宫，需要额外的离子运动来维持细胞的稳态。大电流的钠离子、钾离子和氯离子有助于维持细胞内的生理离子浓度。钠离子通过NCX和顶膜上对氨基离子敏感的钠离子通道从子宫液中吸收，通过钠离子/钾离子-ATP酶在电化学梯度作用下从基底外侧膜细胞中泵出，钠离子/钾离子-ATP酶可转运钠离子和钾离子进入细胞^{[16, 18]}。这些载体基因(ATP2A3、ITPR1、SCNN1A、SCNN1B和SCNN1G)多态性之间的关联证明，其与蛋壳力学特性(强度、厚度和蛋壳重量)有关，证明它们参与了蛋壳矿化前体的供应^[19]。肠道主要吸收钙离子，子宫主要分泌钙离子，都是通过转运载体而发挥作用，二者载体存在一些相似性，但子宫细胞的载体更加复杂，然而各离子之间的相互关系和作用，仍需深入研究。

2 蛋壳形成过程中钙代谢的影响因素 2.1 维生素D及其代谢产物1, 25-二羟维生素D₃

维生素D及其代谢产物1, 25-二羟维生素D₃是调控钙离子在肠道上皮细胞吸收的重要因子，可促进肠上皮细胞顶端钙离子的渗透，及在细胞内的胞质转运和排出^[9]。蛋禽肠道存在1, 25-二羟维生素D₃和维生素D受体(VDR)^[20]。CALB1作为肠道钙离子转运的主要蛋白，是一种维生素D依赖型蛋白，饲粮缺乏维生素D，肠道中几乎检测不到钙结合蛋白，但注射1, 25-二羟维生素D₃，钙结合蛋白的基因表达增加了10倍^[21]。蛋禽性成熟后产第一枚蛋前，血浆1, 25-二羟维生素D₃含量增加，肠道中钙结合蛋白及其表达量增加，钙吸收增加^[10]。此外，研究表明，PMCA1的合成也受维生素D影响，其基因与维生素D受体反应元件有关^[22]。但其他钙离子转运载体并未发现受1, 25-二羟维生素D₃的调控。肠道中虽然已经发现了许多假定的离子转运体，但关于这些候选分子在特定离子转运体(通道、泵或交换器)之间的相互作用并不清楚。维生素D代谢物对蛋鸡钙结合蛋白和PMCA表达的影响已得到证实，但其他参与钙吸收和肠细胞离子稳态的蛋白的作用仍有待进一步研究。

肠道钙的吸收直接受维生素D的控制，子宫内则不同。钙结合蛋白也是子宫管状腺细胞钙离子转运分泌的主要蛋白，在蛋壳形成过程中大量表达^[16]，但子宫中的钙结合蛋白表达是否受维生素D的影响，还存在争议。外源性1, 25-二羟维生素D₃或低钙饲粮不会影响子宫钙结合蛋白的水平^[9]，饲喂缺乏维生素D的饲粮，鹌鹑子宫内仍有CALB1的合成^[23]，但也有研究发现，在体外培养维生素D缺乏蛋禽子宫组织的培养基中添加1, 25-二羟维生素D₃或与雌激素共同作用，又可刺激钙结合蛋白的表达，这表明1, 25-二羟维生素D₃对钙结合蛋白合成有促进作用，并且子宫细胞存在VDR，并在蛋壳钙化时表达增加^[24]。蛋壳形成时，除了钙离子和碳酸氢根离子的载体，许多参与蛋壳前体分泌或维持细胞内稳态的离子转运蛋白上调。且多数转运蛋白的基因中都存在VDR，表明可能也受维生素D影响。但维生素D及其代谢产物1, 25-二羟维生素D₃对子宫细胞钙离子转运分泌载体的调控作用有待进一步研究。

髓骨和皮质骨之间的平衡受饲粮钙和维生素D的影响^[12]。维生素D对骨矿化具有重要作用，提高钙磷吸收，促进某些骨基质蛋白的合成，如骨钙素和骨桥蛋白。骨钙素是与骨矿化基质相关的最丰富的非胶原蛋白，可与钙结合，对羟基磷灰石有较强的吸附力^[25]。骨桥蛋白是一种糖基化、高度磷酸化的蛋白，存在于骨和蛋壳中^[26]。在骨中，骨桥蛋白可影响破骨细胞的分化和形成。1, 25-二羟维生素D₃通过与特定的维生素D反应启动子元件结合，促进骨钙素和骨桥蛋白的合成，从而增加成骨细胞^[6]。因此，髓骨钙的合成和动员受维生素D及其代谢产物1, 25-二羟维生素D₃的调控。

应用研究中表明，维生素D₃是维持蛋禽正常生长、繁殖和蛋壳品质的重要因素^[27]，可调控钙磷吸收，调节甲状旁腺激素的分泌、骨矿化和动员，减少骨疾病的发生^[28]。蛋鸡饲粮缺乏维生素D₃，体内钙磷代谢降低，蛋鸡的产蛋性能和蛋壳品质降低，死亡率增加^[29]。随着产蛋日龄的增加，蛋禽体内钙吸收和维生素D₃代谢能力降低^[30]，导致体内1, 25-二羟维生素D₃不足，影响钙磷代谢，导致蛋壳质量和骨强度降低^[27]。在产蛋后期，饲粮添加维生素D₃可提高蛋壳强度、厚度、蛋壳比例和胫骨强度，降低破蛋率^[31]。饲粮添加维生素D₃、维生素D₂、1, 25-二羟维生素D₃可提高蛋鸡体内钙和磷的总表观消化率^[32]。饲粮添加维生素D₃(2 400 vs. 300 IU/kg)可提高蛋鸡的蛋壳密度和厚度^[33]，但也有研究表明饲粮添加维生素D₃(2 200~102 020 IU/kg)对蛋鸡的蛋壳品质和骨性能无显著影响^[34]。

2.2 雌激素

雌激素是确保蛋壳形成的先决条件，刺激输卵管和子宫的生长发育，并激活卵巢每日控制子宫分泌钙的能力，随着蛋壳形成不断变化，并与蛋壳形成一致^[3]。管状腺细胞存在雌激素受体和钙结合蛋白，子宫CALB1的含量受雌激素调控，影响子宫的钙分泌。雌激素是影响髓骨形成的关键因素，成骨和破骨细胞中都存在雌激素受体，可诱导骨内膜细胞分化形成成骨细胞，降低骨内膜表面破骨细胞数量及活性^[35]。蛋禽性成熟时，雌激素大量分泌，髓质骨较皮质骨比例增加^[12]，雌激素还可诱导骨基质形成，但需与维生素D₃共同作用。维生素D是促进皮质骨和髓质骨成骨细胞活动的关键因素，但2种骨之间的平衡受雌激素的调节，通过调控血管系统和交换表面积^[12]。此外，维生素D参与髓质骨形成，在成骨细胞中，雌激素可增加维生素D受体表达刺激骨钙素分泌，并与维生素D共同作用，促进髓质骨形成。产蛋后期，蛋壳品质和骨性能降低，这可能与蛋壳腺上皮细胞的雌激素受体(α和β)之间的平衡改变有关，若连续低剂量的注射雌激素，可改善蛋鸡的蛋壳强度^[36]。因此，雌激素也是影响蛋壳钙代谢和形成的重要因素。

2.3 骨钙素、甲状旁腺素、成纤维细胞生长因子23(FGF23)

饲粮钙供应不足时，髓质骨是蛋壳形成的动态钙库^[35]。蛋壳形成过程中(产卵10~22 h)，破骨细胞活跃，髓质骨被大量吸收，吸收面积增加了9倍，血浆和尿中磷含量大幅增加^[6]。骨钙素主要由成骨细胞合成，参与钙循环，并可得到快速周转。血浆中骨钙素含量变化与1, 25-二羟维生素D₃有关，产无壳蛋蛋禽血浆中的骨钙素和1, 25-二羟维生素D₃含量均较低^[37-38]。低钙饲粮中，蛋壳的形成会促进骨钙素的分泌。血浆骨钙素可反映成骨细胞的日周期活动，在成骨细胞中，雌激素通过增加VDR表达刺激骨钙素的分泌。饲粮添加维生素K可通过骨钙素改善骨组织代谢的失衡状态，促进骨形成和抑制骨细胞吸收的双向调节^[39]，但对蛋壳品质的调控研究有待进一步研究。骨的重吸收日常变化还受甲状旁腺素(PTH)的控制^[35]。在蛋壳形成期间，由于血浆中钙离子的降低，PTH的分泌增加，可强烈刺激骨吸收^[35]。FGF23是一种调节骨钙和磷代谢的激素，调控骨桥蛋白等的表达^[38]，FGF23主要在成骨和破骨细胞中表达，可抑制肾小管中磷酸盐的再吸收，还可通过双重作用降低1, 25-二羟维生素D₃的循环^[38]。然而，FGF23在蛋禽体内蛋壳形成过程中的具体作用并不清楚，但FGF23及其辅助因子可能参与蛋禽肾脏中磷酸盐和1, 25-二羟维生素D₃的每日变化^[40]。因此，调控影响骨矿化和破骨的激素水平，可调控骨钙磷代谢，影响体内钙代谢。

髓骨钙的储存也是影响蛋壳钙代谢的重要因素。关注育成期蛋禽的骨骼发育，保证产蛋后期髓骨钙的供应，是调控后期蛋壳品质的重要方向。通过调控钙磷代谢而影响碳酸钙的沉积是改善后期蛋壳品质的研究重点。研究表明，饲粮添加锌^[41]、枯草芽孢杆菌^[42]、有机酸和中草药添加剂^[43]以及调控饲粮钠氯水平^[44]、使用硫酸钠部分代替氯化钠^[45]等，可改善产蛋后期的蛋壳品质，主要是调控碳酸钙的沉积，通过促进钙离子的吸收转运和降低骨钙流失等发挥作用。

3 小结

蛋壳品质受钙磷代谢的影响受到广泛关注，通过调控钙源和水平、钙磷比例、添加维生素等调控蛋壳品质，也已广泛应用于生产实践。但仍有许多问题有待进一步研究和探讨，归结起来主要有如下4个方面：1)肠道和子宫部上皮细胞仍然存在许多未鉴定或功能不清楚的离子载体，通过组学技术与表型数据的关联分析，有助于发现或解析其在蛋壳形成的功能和作用途径。2)子宫上皮细胞钙离子的分泌，不仅需要钙离子转运载体，还与其他离子的转运和平衡有关，可从整体上，调控离子稳态平衡而改善蛋壳品质。3)蛋壳钙化的动态时序性过程中，需要持续不断的提供大量的钙离子，受体内钙稳态的调控，受1, 25-二羟维生素D₃、雌激素、降钙素、PTH和钙离子调节等影响。然而，激素水平的变化受多种因素影响，如何应用营养手段进行调控，仍然是研究的重点和难点。4)通过调控钙离子在肠道的吸收转运而改善蛋壳品质已进行大量研究，但关于调控髓骨钙的形成和动员的研究很少，这将是未来蛋壳品质研究的新方向。