仔猪断奶后由于消化系统和免疫系统尚未发育完善，引起仔猪断奶应激综合征，主要表现为仔猪腹泻率增加、生长性能下降等^[1-2]。生产上主要在饲粮中添加抗生素来抑制有害微生物的生长，控制仔猪腹泻，提高生产效益^[3]。然而自2020年7月1日起，我国全面停止生产含有促生长类药物饲料添加剂(中药类除外)的商品饲粮^[4]，这使得我国仔猪健康养殖面临重大挑战。目前研究发现，有机酸是一种有效的抗生素替代产品^[5-6]。苯甲酸是最简单的芳香酸，属于有机酸的一种。苯甲酸具有降低饲粮系酸力、抑制肠道有害菌繁殖、促进饲粮中营养物质消化、提高肠道消化酶活性等多种生物学作用^[7-8]。但是，目前苯甲酸的研究主要针对24^{[7, 9]}、28^[10-11]、38日龄^[12]断奶仔猪，而我国商业猪场普遍在21日龄断奶，所以有必要进一步系统地研究其在21日龄断奶仔猪上的应用情况。因此，本试验以21日龄“杜×长×大”三元杂交断奶仔猪为试验动物，旨在研究饲粮中添加苯甲酸对断奶仔猪生长性能、腹泻率和肠道菌群的影响，为苯甲酸的科学应用提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 试验材料

本试验所用苯甲酸纯度为99.5%。

1.2 试验设计

试验选取21日龄“杜×长×大”断奶仔猪72头，随机分为对照组(基础饲粮)和苯甲酸组(基础饲粮+5 000 mg/kg苯甲酸)，每组6个重复，每个重复6头猪(公母各占1/2)。试验期42 d，分为3个阶段：第1~14天、第15~28天、第29~42天。基础饲粮为玉米-豆粕型饲粮，营养水平参照《猪饲养标准》(NY/T 65—2004)中3~8 kg、8~20 kg仔猪营养需要量，基础饲粮组成及营养水平见表 1。各组饲粮营养水平一致，对照组饲喂基础饲粮，苯甲酸组在基础饲粮中添加5 000 mg/kg的苯甲酸。

1.3 饲养管理及样品采集

试验动物每天分别于08:00与16:00投料，共饲喂2次，试验期间仔猪自由采食、饮水。在第15和43天早上称完重后，每个重复选取1头与平均体重相近的仔猪，颈静脉注射戊巴比妥钠(50 mg/kg BW)溶液麻醉屠宰。采集回肠、盲肠、结肠内容物放于2 mL的离心管并转移到液氮迅速冷冻，之后转移到-80 ℃冰箱保存。

1.4 指标检测 1.4.1 生长性能

试验期间准确记录每天每栏采食量，并分别在仔猪断奶后第1、15、29、43天早上对仔猪进行空腹称重，计算仔猪断奶后第1~14天、第15~28天、第29~42天、第1~28天、第1~42天平均日增重、平均日采食量和料重比。

1.4.2 腹泻评分

腹泻率：每天早上和下午喂料前，观察仔猪粪便，参照Wen等^[13]方法对仔猪粪便进行评分，2、3分记为腹泻。粪便评分标准见表 2，以栏为单位统计仔猪腹泻率。

1.4.3 肠道内容物微生物组成

采用实时荧光定量PCR法检测肠道内容物中微生物组成，具体操作参考温晓鹿等^[14]的方法。采用QIAamp^® DNA Stool Mini Kit Handbook试剂盒(QIAGEN公司) 提取结肠内容物总细菌DNA，用ND-1000核酸和蛋白质分析仪检测DNA的浓度，再经0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测其纯度。

将提取的总细菌DNA分别和不同浓度总细菌、大肠杆菌、芽孢杆菌、双歧杆菌、乳酸杆菌标准质粒进行定量PCR检测，将标准质粒浓度和Ct值做回归分析，制定标准曲线。然后将样品Ct值带入回归方程计算得到目标菌属DNA拷贝数，结果用每克内容物中细菌拷贝数的常用对数表示(lg拷贝数/g)。PCR所用引物见表 3。

1.5 数据统计分析

试验数据采用Excel 2010进行整理，采用软件SPSS 19的独立样本t检验进行2组间试验数据分析，0.05≤P < 0.10时为有显著趋势，P < 0.05时为差异显著，P < 0.01时为差异极显著。

2 结果与分析 2.1 苯甲酸对断奶仔猪生长性能的影响

由表 4可知，与对照组相比，断奶仔猪饲粮中添加苯甲酸显著提高仔猪断奶后第15天的体重(P < 0.05)，显著提高仔猪断奶后第1~14天平均日增重(P < 0.05)，显著降低仔猪断奶后第29~42天、第1~42天料重比(P < 0.05)，有降低仔猪断奶后第1~14天料重比的趋势(P=0.076)。与对照组相比，苯甲酸组平均日增重全期提高11.1%(P>0.05)，平均日采食量全期提高7.6%(P>0.05)。

2.2 苯甲酸对断奶仔猪腹泻率和粪便评分的影响

由表 5可知，与对照组相比，断奶仔猪饲粮中添加苯甲酸，显著降低仔猪断奶后第1~14天、第15~28天、第29~42天、第1~42天的腹泻率(P < 0.05)；显著降低仔猪断奶后第1~14天、第15~28天、第29~42天、第1~28天、第1~42天的粪便评分(P < 0.05)。

2.3 苯甲酸对断奶仔猪肠道微生物组成的影响

由表 6可知，与对照组相比，断奶仔猪饲粮中添加5 000 mg/kg的苯甲酸显著降低仔猪断奶后第14天回肠、盲肠、结肠芽孢杆菌的数量(P < 0.05)，显著降低仔猪断奶后第42天盲肠芽孢杆菌的数量(P < 0.05)；显著降低仔猪断奶后第14天结肠、第42天盲肠和结肠总细菌的数量(P < 0.05)；显著增加仔猪断奶后第42天回肠乳酸杆菌的数量(P < 0.05)，显著降低仔猪断奶后第14天回肠双歧杆菌的数量(P < 0.05)，有增加仔猪断奶后第14天回肠乳酸杆菌数量的趋势(P=0.083)，有降低仔猪断奶后第42天结肠大肠杆菌数量的趋势(P=0.065)。

3 讨论 3.1 苯甲酸对断奶仔猪生长性能的影响

苯甲酸又称安息香酸，是羧基直接与苯环碳原子相连接的最简单的芳香酸，其酸性较弱，属于弱有机酸。随着农业农村部饲用抗生素的禁用，目前普遍认为酸化剂可作为有效的抗生素替代产品。有机酸促进仔猪生长的研究比较多，但苯甲酸作为酸化剂在仔猪上的研究还比较少。Torrallardona等^[15]和舒燕^[10]研究均发现，饲粮中添加5 000 mg/kg的苯甲酸显著提高断奶仔猪的平均日增重、平均日采食量，显著降低料重比。Gutzwiller等^[16]也报道，饲粮中添加5 000 mg/kg的苯甲酸显著改善仔猪的平均日增重和平均日采食量，对仔猪的料重比无显著影响，其他研究^[17-18]也有类似结果。本研究表明，饲粮中添加苯甲酸显著提高仔猪断奶后第15天的体重，显著提高仔猪断奶后第1~14天平均日增重，显著降低仔猪断奶后第29~42天、第1~42天料重比。但是也存在一些不一致的结果。刁慧^[7]研究报道，饲粮中添加5 000 mg/kg的苯甲酸对断奶仔猪的平均日增重和平均日采食量没有显著影响。蔡瑞芳等^[19]在断奶仔猪饲粮中添加5 000和10 000 mg/kg苯甲酸对断奶仔猪平均日增重、平均日采食量和料重比无显著影响。饲粮中添加苯甲酸提高仔猪生长性能可能是由于苯甲酸能有效抑制有害微生物的生长，改善仔猪的肠道形态^[20]，提高饲料消化率。Guggenbuhl等^[21]报道，饲粮中添加苯甲酸显著提高仔猪粗蛋白质和能量的表观消化率。苯甲酸作为酸化剂，能够有效抑制饲粮的霉变，改善饲粮的适口性，提高仔猪的采食量。不同的试验结果说明苯甲酸在不同的饲养条件下试验结果存在差异，试验饲粮的组成、试验动物的健康状况及试验场环境均会影响试验结果。

3.2 苯甲酸对断奶仔猪腹泻率和粪便评分的影响

仔猪断奶后，腹泻是影响仔猪生长性能的主要因素。研究报道，饲粮中添加苯甲酸显著降低仔猪的腹泻指数^[22]。李洁云等^[12]研究苯甲酸与酶制剂、植物精油、益生菌的联合使用效果，结果表明其替代抗生素能显著提高仔猪的平均日增重，降低仔猪腹泻。李璐等^[11]报道，饲粮中添加苯甲酸和葡萄糖氧化酶显著降低仔猪肠道中大肠杆菌的数量和腹泻率。其他研究也发现，在大肠杆菌攻毒的条件，饲粮中添加3 000 mg/kg的苯甲酸、400 mg/kg凝结芽孢杆菌和400 mg/kg的牛至油显著降低仔猪的腹泻率和腹泻指数^[9]。本研究表明，饲粮中添加苯甲酸显著降低仔猪断奶后的腹泻率和粪便评分, 这与其他研究结果一致。断奶仔猪腹泻的原因主要是由于生活环境、饲粮类型的改变，破坏肠道微生态平衡，导致肠道屏障功能障碍，引起仔猪腹泻率增加^[1]。苯甲酸控制仔猪腹泻的机理主要是通过降低饲粮的pH和缓冲能力，从而降低肠道内容物的酸度^[23]；抑制大肠杆菌等有害微生物的生长，维持肠道微生态平衡从而减少腹泻^[8]。本研究也发现饲粮中添加苯甲酸有降低肠道内大肠杆菌数量的趋势。

3.3 苯甲酸对断奶仔猪肠道微生物组成的影响

健康仔猪肠道中有害菌和有益菌处在一个动态平衡状态，断奶应激会导致仔猪肠道微生态失衡，引起仔猪腹泻，其主要原因是乳酸杆菌等有益菌数量降低，大肠杆菌等致病菌数量增加。研究发现，酸化剂能显著提高仔猪肠道和粪便内乳酸菌的数量，降低大肠杆菌的数量^[5-6]。苯甲酸作为酸化剂也显著提高断奶仔猪回肠内容物中乳酸杆菌和双歧杆菌的数量^[8]，降低大肠杆菌的数量^[24]。通过体外方法比较不同单一酸对猪空肠和回肠食糜中大肠杆菌和沙门氏菌抑菌效果时发现，苯甲酸能显著抑制沙门氏菌、大肠埃希菌和总细菌的繁殖^[25]。本研究表明，21日龄断奶仔猪饲粮中添加5 000 mg/kg的苯甲酸显著降低仔猪肠道内总细菌、芽孢杆菌、双歧杆菌的数量，有降低大肠杆菌数量的趋势，同时显著提高乳酸杆菌的数量。这些结果说明苯甲酸不仅能够抑制大肠杆菌的生长，也抑制双歧杆菌和芽孢杆菌等有益菌的生长。跟前人的报道不一致。其他研究也有报道，添加苯甲酸对肠道乳酸杆菌的数量没有显著影响^[26]或者有降低的报道^[27]。这种差异可能是与仔猪日龄或者猪舍环境有关系。Kluge等^[28]研究报道，饲粮中添加5 000 mg/kg的苯甲酸显著降低仔猪回肠内容物总细菌、十二指肠革兰氏阴性菌和胃内总需氧菌和总厌氧菌的数量。这表明苯甲酸对肠道菌群有抑制作用。苯甲酸抑菌的原理可能是低浓度的苯甲酸大多数处于未电离状态。没有电离的有机酸分子具有亲脂性可以进入细菌细胞，从而干扰细菌及霉菌等微生物细胞的通透性，抑制细胞膜对氨基酸的吸收^[29]。进入细胞内的苯甲酸改变细菌体内氢离子(H⁺)的平衡，细胞内的蛋白质变性，各种酶的活性受到抑制，最终达到抑菌的目的^[30]。肠道内细菌数量的降低，能够减少微生物对营养物质的消耗，提高饲料的利用效率。

4 结论

在本试验条件下，饲粮中添加5 000 mg/kg的苯甲酸显著促进肠道乳酸杆菌生长，抑制总细菌、芽孢杆菌等其他细菌生长；同时，添加苯甲酸显著降低仔猪腹泻率，提高生长性能。