维生素K是一组具有促凝血作用的脂溶性维生素[1-2]，主要包括维生素K1、维生素K2、维生素K3、维生素K4等。其中，维生素K1大量存在于绿色蔬菜和植物油中，维生素K2是一类可以从肠道细菌发酵获得的活性物质[3]，而维生素K3和维生素K4是人类通过化学合成的产物。目前，畜禽饲粮中的维生素K主要为维生素K3[4]。维生素K主要通过参与羧化维生素K依赖蛋白发挥其凝血、骨骼矿化、抑制血管钙化等生理作用[5-10]，凝血酶原前体蛋白维生素K缺乏或拮抗剂Ⅱ诱导蛋白(protein induced by vitamin K absence or antagonist-Ⅱ，PIVKA-Ⅱ)和骨钙素分别是与凝血和骨骼矿化相关的维生素K依赖蛋白[11]，可作为机体维生素K营养状况的评价指标。小鼠通过注射维生素K1可显著降低血浆PIVKA-Ⅱ含量[12]，肉鸡饲粮中添加维生素K3可显著提高肉鸡3周龄胫骨骨密度和显著降低血清羧化不全骨钙素含量[13]。NRC(1994)家禽营养需要标准中推荐育雏期北京鸭维生素K营养需要量为0.5 mg/kg，但该推荐量是依据其他家禽数据确定，缺乏肉鸭方面试验依据。目前，维生素K对肉鸭生长发育影响的研究未见报道。因此，本试验通过研究不同维生素K3添加水平对1~21日龄北京鸭生长性能、胫骨质量和凝血及骨代谢相关血浆生化指标的影响，探讨反映肉鸭维生素K营养状况的敏感指标，确定育雏期北京鸭维生素K营养需要参数，为肉鸭饲粮配制中维生素K的合理使用提供技术支撑和理论依据。
1 材料与方法 1.1 试验设计及饲粮试验采用单因子完全随机试验设计，设7个维生素K3添加水平(0、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0和8.0 mg/kg)。试验基础饲粮营养水平参考我国《肉鸭饲养标准》(NY/T 2122—2012)，基础饲粮组成及营养水平见表 1。通过在基础饲粮中添加7个不同水平人工合成维生素K3(0、0.98、1.96、3.92、7.84、11.76和15.68 mg/kg，按照甲萘醌含量进行换算)配制成7种试验饲粮。维生素K3添加形式为亚硫酸氢钠甲萘醌(甲萘醌含量为51%)，试验饲粮均制成颗粒料。选择448只1日龄健康雄性北京鸭，随机分为7组，每组8个重复，每个重复8只鸭。各重复试验鸭初始体重基本一致。试验期为21 d。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets (air-dry basis) |
试验鸭网上平养，自由采食与饮水，24 h光照。1~21日龄按试验饲粮分组饲养，其他按常规饲养管理进行。
1.3 样品采集和指标测定 1.3.1 生长性能分别于1和21日龄称取各组各重复试验鸭空腹体重和剩余饲料重，计算1~21日龄试验鸭平均日增重、平均日采食量和料重比。
1.3.2 血浆生化指标使用采血针和真空采血管采集21日龄北京鸭血液，从各组各重复随机挑选试验鸭2只，颈静脉采血5 mL，置于肝素钠抗凝管中，3 500 r/min离心15 min，分离血浆，-20 ℃保存，用于血浆生化指标的测定。其中，血浆中钙、磷含量和碱性磷酸酶活性采用HITACHI7080全自动生化分析仪进行测定分析，试剂盒购自迈克生物股份有限公司。血浆中PIVKA-Ⅱ含量采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定，采用上海酶联公司生产的试剂盒并用BiotekEpoch酶标仪在450 nm波长下测定吸光度，计算血浆PIVKA-Ⅱ含量。血浆中骨钙素和羧化不全骨钙素含量同样采用ELISA法测定，在450 nm波长下测定吸光度，试剂盒购自北京绿源伯德生物科技有限公司。通过血浆骨钙素和羧化不全骨钙素含量计算骨钙素羧化率：
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于21日龄，从各组各重复随机挑选试验鸭2只，颈静脉采血后，处死，取试验鸭左侧胫骨测定胫骨骨密度、骨矿盐含量和骨面积，采用GE Lunar iDXA双能X射线骨密度仪进行测定。
1.4 统计分析试验数据采用SAS 9.3统计软件进行统计分析，采用GLM程序按完全随机试验设计进行单因素方差分析，采用Duncan氏法进行平均值之间的多重比较。试验数据采用“平均值±标准差”表示，P < 0.05表示差异显著。
2 结果 2.1 不同维生素K3添加水平对1~21日龄北京鸭生长性能的影响如表 2所示，不同维生素K3添加水平对1~21日龄北京鸭平均日增重、平均日采食量和料重比均未产生显著影响(P>0.05)。
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表 2 不同维生素K3添加水平对1~21日龄北京鸭生长性能的影响 Table 2 Effects of different vitamin K3 supplemental levels on growth performance of Pekin ducks during 1 to 21 days of age |
如表 3所示，不同维生素K3添加水平对21日龄北京鸭胫骨骨密度、骨矿盐含量和骨面积均未产生显著影响(P>0.05)。
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表 3 不同维生素K3添加水平对21日龄北京鸭胫骨质量的影响 Table 3 Effects of different vitamin K3 supplemental levels on tibial bone quality of Pekin ducks at 21 days of age |
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表 4 不同维生素K3添加水平对21日龄北京鸭骨代谢相关血浆生化指标的影响 Table 4 Effects of different vitamin K3 supplemental levels on plasma biochemical indices related to bone metabolism of Pekin ducks at 21 days of age |
不同维生素K3添加水平对21日龄北京鸭血浆钙、磷含量和碱性磷酸酶活性产生显著影响(P < 0.05)。4.0 mg/kg维生素K3添加水平组血浆钙含量显著高于0、0.5、1.0 mg/kg维生素K3添加水平组(P < 0.05)。0 mg/kg维生素K3添加水平组血浆磷含量显著低于0.5、2.0、4.0、6.0、8.0 mg/kg维生素K3添加水平组(P < 0.05)。2.0 mg/kg维生素K3添加水平组血浆碱性磷酸酶活性显著高于0、0.5、1.0、8.0 mg/kg维生素K3添加水平组(P < 0.05)。
2.3 不同维生素K3添加水平对21日龄北京鸭血浆维生素K依赖蛋白含量的影响如表 5所示，不同维生素K3添加水平对21日龄北京鸭血浆PIVKA-Ⅱ含量产生显著影响(P < 0.05)。8.0 mg/kg维生素K3添加水平组血浆PIVKA-Ⅱ含量最低，显著低于0、0.5、1.0、2.0 mg/kg维生素K3添加水平组(P < 0.05)。不同维生素K3添加水平对血浆羧化不全骨钙素和骨钙素含量产生显著影响(P < 0.05)。0 mg/kg维生素K3添加水平组血浆羧化不全骨钙素含量显著高于0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mg/kg维生素K3添加水平组(P < 0.05)，并且血浆骨钙素含量也显著高于0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mg/kg维生素K3添加水平组(P < 0.05)。不同维生素K3添加水平对21日龄北京鸭骨钙素羧化率未产生显著影响(P>0.05)。
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表 5 不同维生素K3添加水平对21日龄北京鸭血浆维生素K依赖蛋白的影响 Table 5 Effects of different vitamin K3 supplemental levels on plasma vitamin K-dependent proteins of Pekin ducks at 21 days of age |
研究发现，饲粮中添加维生素K3未显著提高猪生长育肥阶段的平均日采食量、平均日增重和料重比[14-15]，同时对1~3周龄肉鸡生长性能的影响也不显著[13]。Price等[16]给大鼠持续服用维生素K拮抗剂造成大鼠维生素K缺乏，但未对大鼠平均日增重产生显著影响。有关维生素K对北京鸭生长性能影响的研究还未见报道。本试验结果显示，饲粮中添加不同水平维生素K3对1~21日龄北京鸭的平均日采食量、平均日增重和料重比均无显著影响，这与上述研究报道基本一致。然而，维生素K对动物生长性能的影响与维生素K缺乏持续时间有关。Zhang等[13]研究发现，尽管维生素K缺乏对1~3周龄肉仔鸡平均日增重没有显著影响，但持续饲喂维生素K缺乏饲粮7周以后可显著降低6~7周龄肉仔鸡平均日增重。由此可见，维生素K对肉鸭生长发育的影响在生长性能等宏观指标上可能体现较弱，研究应注重维生素K对机体生理生化机能的影响。
3.2 不同维生素K3添加水平对21日龄北京鸭胫骨质量和骨代谢相关血浆生化指标的影响Price等[16]研究发现，服用维生素K拮抗剂组的大鼠与对照组大鼠胫骨密度无显著差异，骨质疏松患者补充维生素K后骨密度并没有显著升高，但在临床上补充维生素K可降低患者的骨折风险[17]。本试验结果显示，饲粮中添加不同水平维生素K3对21日龄北京鸭的胫骨骨密度、骨矿盐含量和骨面积都没有产生显著影响，这与上述研究结果基本一致。但本试验结果表明提高饲粮维生素K3添加水平可促进钙、磷吸收及代谢，表现在提高饲粮维生素K3添加水平可提高血浆钙、磷含量。这与肉鸡方面的研究结果[13]相一致。碱性磷酸酶是成骨细胞骨矿化的标志物，碱性磷酸酶活性升高间接反映成骨细胞代谢更活跃。医学临床上给骨折早期患者补充较高水平维生素K4可显著提高患者血清碱性磷酸酶活性[18]。大鼠离体骨细胞培养试验也表明，维生素K2能够显著增强血清碱性磷酸酶活性[19]。本试验中2.0 mg/kg维生素K3添加水平组血浆碱性磷酸酶活性显著高于0、0.5、1.0、8.0 mg/kg维生素K3添加水平组的结果在一定程度上支持了上述研究报道。由此可见，维生素K可能通过参与体内钙、磷代谢调控机体骨骼发育。然而本试验尚未观察到不同维生素K3添加水平对北京鸭胫骨质量产生显著影响，这有待于进一步研究。
3.3 不同维生素K3添加水平对21日龄北京鸭血浆维生素K依赖蛋白含量的影响凝血功能是维生素K的主要生理功能[14, 20-23]，凝血酶原前体蛋白PIVKA-Ⅱ是与凝血相关的维生素K依赖蛋白，血浆PIVKA-Ⅱ含量也是目前最敏感的凝血指标，能够预测机体维生素K缺乏的亚临床状况[24-25]，当机体维生素K缺乏时，PIVKA-Ⅱ在肝脏中未能及时的被羧化成为凝血酶原，随后PIVKA-Ⅱ在血液中累积，而PIVKA-Ⅱ无法被激活成为凝血酶发挥凝血功能，血液中PIVKA-Ⅱ含量过高反映出凝血功能出现障碍[5, 24, 26]。本试验结果显示，血浆PIVKA-Ⅱ含量随维生素K3添加水平升高而降低，且在饲粮维生素K3添加水平达到8.0 mg/kg时最低，这间接反映出维生素K缺乏可影响肉鸭的凝血功能。
此外，骨钙素也是维生素K的依赖性蛋白[11, 27]，当机体维生素K缺乏时，部分骨钙素无法在维生素K的作用下完成羧化反应，血液中羧化不全骨钙素含量会大大增加[28]，进而导致血液中骨钙素的含量也随之增加，肉鸡饲粮中添加维生素K3可显著降低血清羧化不全骨钙素含量[13]。因此，羧化不全骨钙素是维生素K缺乏的生物标志物，可作为评价维生素K营养状况的敏感指标[27, 29]。羧化后的骨钙素对羟基磷灰石晶体具有高亲和力，使其沉积到骨基质中，骨钙素羧化率和骨密度在临床上常用来作为骨质疏松的诊断标准[29]，同时血浆羧化不全骨钙素含量也被认为是评估骨折风险的敏感指标[30]。本试验结果显示，饲粮中添加维生素K3可显著降低北京鸭血浆羧化不全骨钙素含量。这间接表明维生素K3参与了骨钙素的羧化，这与本试验中高维生素K3添加水平组骨钙素羧化率升高相一致，也与饲粮中添加高水平维生素K3可显著提高北京鸭血浆钙含量的结果相一致。这在一定程度上表明，维生素K3可通过提高骨钙素的羧化水平促进肉鸭对钙的吸收或动员。
目前，关于肉鸭维生素K3营养需要的研究未见报道。尽管本试验设置了7个维生素K3添加水平，但尚不能成功通过构建数学模型计算出北京鸭对维生素K3的适宜需要量。参考方差分析和平均值之间多重比较，与未添加维生素K3组相比，0.5 mg/kg维生素K3添加水平组血浆磷含量显著升高，而血浆羧化不全骨钙素含量显著降低。这支持NRC(1994)家禽营养需要标准中育雏期北京鸭维生素K3的推荐量(0.5 mg/kg)。同时，维生素K3添加水平高于0.5 mg/kg对升高血浆磷含量和降低血浆羧化不全骨钙素含量没有进一步显著改善作用。这提示在本试验条件下，以血浆磷羧化不全骨钙素含量为评价指标，1~21日龄北京鸭饲粮中维生素K3适宜添加水平为0.5 mg/kg。同时，在饲粮中添加8.0 mg/kg维生素K3可显著降低血浆中未羧化的凝血酶原前体蛋白PIVKA-Ⅱ和羧化不全骨钙素含量的试验结果也暗示着，在特定情况下为促进血液凝集功能和骨代谢相关机能，饲粮中维生素K3的添加水平可适当提高。
4 结论饲粮中添加维生素K3可能通过参与羧化影响凝血酶原前体蛋白PIVKA-Ⅱ、骨钙素等维生素K依赖蛋白的调控，进而影响机体的血凝功能和骨代谢。综合血浆磷和羧化不全骨钙素含量，育雏期北京鸭饲粮维生素K3适宜添加水平为0.5 mg/kg。
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