2. 宁夏职业技术学院, 银川 750021
2. Ningxia Vocational and Technical College, Yinchuan 750021, China
苜蓿干草粗蛋白质含量高，适口性好，是反刍动物优质的粗饲料来源和重要的饲草作物[1]。但我国优质苜蓿干草缺乏，若以苜蓿干草作为单一粗饲料，不能满足养殖业的需要。我国是农业大国，秸秆产量每年约为9.0亿t[2]，但利用率较低且大规模的焚烧造成了环境污染。如何有效利用秸秆，降解其纤维素含量并与苜蓿干草配合使用，使其成为反刍动物的优质粗饲料，一直是动物营养研究的热点。通过饲用酶制剂的添加降解植物细胞壁的纤维素和半纤维素已是生物技术在动物营养和饲料工业中应用最成功的例子[3]，在粗饲料的发酵中已运用纯熟。益生菌发酵粗饲料能够提高其营养价值，促进动物生长，提高生产性能[4-8]。稻草和苜蓿干草均为肉羊养殖中的常见粗饲料，目前，通过酶菌混合处理稻草和苜蓿干草尚未见报道。鉴于此，本试验采用纤维素酶与复合益生菌(主要成分为乳酸菌、酵母菌和枯草芽孢杆菌等)混合处理宁夏地区常见的2种粗饲料稻草和苜蓿干草，参考课题组成员王萌[9]的试验结果，将饲粮精粗比设为30∶70，并将稻草与苜蓿干草以60∶40组合作为粗饲料，研究酶菌混合处理稻草和苜蓿干草饲喂滩羊对其生长性能、血清生化指标、瘤胃细菌多样性及KEGG通路的影响，以期为粗饲料资源的开发及其在滩羊生产实践中的科学应用提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 酶菌混合处理稻草和苜蓿干草的制备准备适量的稻草和苜蓿干草，用粉碎机粉碎至3~5 cm备用。参照文献[10]确定纤维素酶与复合益生菌的添加量，按照配制比例准确称取纤维素酶[活性≥10000U/g；添加量为0.1%]、复合益生菌[主要成分为酵母菌(活菌数≥1.0×108 CFU/g)、乳酸菌(活菌数≥1.0×107 CFU/g)和枯草芽孢杆菌(活菌数≥5.0×107 CFU/g)，添加量为2 kg/t]和麦麸(按照待处理粗饲料的1%称取)后，加入适量的水，充分搅拌，混合均匀后采取喷淋的方式，边喷洒边搅拌，使水溶液与待处理粗饲料充分混合并将含水量调至70%左右，最后利用青贮裹包机直接进行打捆包膜后，密封保存30 d。稻草和苜蓿干草处理前后分别测定其营养物质含量，其中干物质含量参照《饲料水分的测定方法》(GB/T 6435—2006)测定，粗蛋白质(CP)含量参照《饲料中粗蛋白测定方法》(GB/T 6435—2006)测定，中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维(ADF)含量参照Van Soest等[11]的方法进行测定，粗灰分含量参照《饲料中粗灰分的测定方法》(GB/T 6435—2006)测定，钙(Ca)含量采用高锰酸钾法测定，磷(P)含量采用钼黄比色法(UV-1780紫外分光光度计，岛津，日本)测定。处理前后稻草和苜蓿干草营养成分含量见表 1。
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表 1 处理前后稻草和苜蓿干草营养成分含量(干物质基础) Table 1 Nutrient contents of straw and alfalfa hay before and after treatment (DM basis) |
饲养试验于2019年7—9月在宁夏农垦宁羊农牧有限公司有机牧场进行。选择体重[(31.03±1.00) kg]相近、健康状况良好的3月龄断奶宁夏滩羊(公羊)20只，随机分为2组(对照组和试验组)，每组10只。对照组饲喂以未经处理的稻草和苜蓿干草为粗饲料的试验饲粮，试验组饲喂以酶菌混合处理的稻草和苜蓿干草为粗饲料的试验饲粮。
1.3 试验饲粮与饲养管理试验饲粮参照农业行业标准《肉羊饲养标准》(NY/T 816—2004)和生产实践配制，其组成及营养水平见表 2。试验饲粮精粗比为30∶70，粗饲料由稻草与苜蓿干草按照60∶40的比例进行配制，对照组饲粮中稻草与苜蓿干草未经处理，试验组饲粮中稻草与苜蓿干草经酶菌混合处理。参试羊在试验前进行驱虫等常规防疫，定期对圈舍进行消毒与清扫。预试期15 d，正试期60 d，每日早晚(06:30和18:00)分2次等量饲喂，自由饮水。
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表 2 试验饲粮组成及营养水平(干物质基础) Table 2 Composition and nutrient levels of experimental diets (DM basis) |
从正试期开始，每日准确记录羊只的给料量与剩料量，计算干物质采食量。分别在试验开始当天和试验结束当天早晨空腹称取2组参试羊的体重，分别作为初始体重和终末体重，计算每只羊的总增重、平均日增重(ADG)和料重比(F/G)。
1.4.2 血液样品采集与血清生化指标测定血液样品采集：分别于正试期的第1天、第30天和第60天晨饲前对2组参试羊进行静脉采血，采集的血样在离心管内放置40 min，之后用离心机于3 800 r/min离心10 min，离心结束后吸取血清(每个样品取1 mL血清2份)，置于-20 ℃保存。试验结束后，使用迈瑞BS-180全自动生化分析仪，利用试剂盒(购于深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)测定血清总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、尿素(URE)、葡萄糖(GLU)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、球蛋白(GLB)含量，计算白蛋白/球蛋白(A/G)。
1.4.3 瘤胃液的采集与DNA提取及建库测序饲养试验结束当天清晨空腹采集瘤胃液，每组选择3只参试羊，采用负压采集器，经导管通过口腔食道，深入到瘤胃中部采集瘤胃液约100 mL，每个瘤胃液样品经4层薄纱布过滤后液氮保存。将瘤胃液样品送至广州基迪奥生物科技有限公司进行V3+V4区扩增并进行Illumina HiSeq平台测序。通过原始控制程序过滤原始Tags，以97%以上匹配度为标准，将有效的Tags分配到操作分类单元(OTU)。采用MetaProdigal (V2.6.3)预测宏基因组蛋白质编码基因，CH-HIT (V4.6.5)构建非冗余集合预测基因模型。采用序列同源性搜索工具DIAMOND (V0.8.24)以及BLASTX (V2.2.31+)完成蛋白质功能的序列注释。
1.5 数据统计与分析生长性能、血清生化指标及瘤胃细菌多样性等数据用Excel 2007记录并作简单处理后，采用SAS 8.2软件进行方差分析，并采用LSD法进行多重比较，以P < 0.05和P < 0.01分别作为差异显著和极显著的判断标准。宏基因组数据Unigenes通过DIAMOND软件(阈值E值≤1e-5)比对到KEGG数据库，集合基因丰度表格计算不同数据库比对结果的丰度信息，以进行系统丰富的组间功能差异分析和比较。
2 结果与分析 2.1 酶菌混合处理稻草和苜蓿干草对滩羊生长性能和经济效益的影响 2.1.1 对滩羊生长性能的影响由表 3可知，试验组与对照组的初始体重无显著差异(P＞0.05)，而试验组的终末体重较对照组有所增加，但差异不显著(P＞0.05)；试验组的干物质采食量比对照组降低了1.63%，但差异不显著(P＞0.05)；试验组的总增重、平均日增重极显著高于对照组(P＜0.01)，料重比极显著低于对照组(P＜0.01)，其中试验组总增重比对照组提高了44.36%，平均日增重比对照组提高了44.37%，料重比比对照组降低了31.89%。上述结果表明，用酶菌混合处理稻草和苜蓿干草饲喂滩羊，可以提高滩羊的增重，降低料重比。
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表 3 酶菌混合处理稻草和苜蓿干草对滩羊生长性能的影响 Table 3 Effects of straw and alfalfa hay treated by enzyme and bacteria on growth performance of Tan sheep |
由表 4可知，试验组与对照组滩羊每日饲料成本差异不大，但试验组1只羊的日平均纯利润为3.39元，比对照组提高了1.33元。该结果表明，用酶菌混合处理稻草和苜蓿干草饲喂滩羊，能够提高滩羊养殖的经济效益。
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表 4 经济效益分析 Table 4 Economic benefit analysis |
由表 5可知，第1天时，试验组与对照组相比，各项血清生化指标均无显著差异(P>0.05)。第30天时，试验组血清尿素含量显著低于对照组(P＜0.05)，其他各项指标无显著差异(P>0.05)。第60天时，试验组血清总蛋白、球蛋白含量显著高于对照组(P＜0.05)，血清尿素含量极显著低于对照组(P＜0.01)。该结果表明，用酶菌混合处理稻草和苜蓿干草饲喂滩羊，可以显著提高滩羊血清总蛋白、球蛋白含量，极显著降低滩羊血清尿素含量。
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表 5 酶菌混合处理稻草和苜蓿干草对滩羊血清生化指标的影响 Table 5 Effects of straw and alfalfa hay treated by enzyme and bacteria on serum biochemical indexes of Tan sheep |
经测定，对照组共获得reads 113 515 252个，试验组共获得reads 126 324 584个。由表 6可知，对照组与试验组的覆盖度均大于0.98，说明测序量和测序深度合理，能够准确反映滩羊瘤胃内的细菌组成情况；试验组的OTU数量极显著高于对照组(P＜0.01)，说明用酶菌混合处理稻草和苜蓿干草饲喂滩羊，提高了其瘤胃细菌的OTU数量。
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表 6 各组瘤胃细菌OTU数量 Table 6 Number of OTU of rumen bacteria in each group |
由表 7可知，试验组Chao指数、ACE指数和Simpson指数与对照组差异不显著(P＞0.05)，Shannon指数极显著高于对照组(P＜0.01)。上述结果说明用酶菌混合处理后的稻草和苜蓿干草饲喂滩羊，提高了其瘤胃细菌的Shannon指数。
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表 7 16S rDNA检测Alpha多样性 Table 7 Alpha diversity detected by 16S rDNA |
图 1为基于瘤胃细菌OTU的主坐标分析(PCoA)。由图 1可知，主坐标成分1(PCo1)和主坐标成分2(PCo2)对样本间变异的贡献度分别为33.43%和20.04%，能够充分解释样本间的变异；且PCoA显示，同组内样本距离较近，说明同组内物种多样性差异较小，对照组与试验组之间样本距离较远，说明对照组与试验组之间细菌多样性存在差异。该结果表明，用酶菌混合处理后的稻草和苜蓿干草饲喂滩羊，影响了其瘤胃细菌的多样性。
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蓝色圆点为对照组的3个平行样本，橙色圆点为试验组的3个平行样本。图 2同。 Blue dots were the three parallel samples of control group, and orange dots were the three parallel samples of trial group. 图 1 基于瘤胃细菌OTU的主坐标分析 Fig. 1 Principal coordinate analysis of rumen bacteria based on OTU |
由表 8可知，对照组与试验组的优势菌门均为变形菌门、厚壁菌门和拟杆菌门，三者总量占总菌门的90%以上。其中，试验组变形菌门的丰度极显著低于对照组(P＜0.01)，拟杆菌门的丰度极显著高于对照组(P＜0.01)，厚壁菌门的丰度较对照组提高了4.58%，但差异不显著(P＞0.05)。由图 2可知，试验组与对照组存在显著差异的菌门分别为变形菌门、Patescibacteria、拟杆菌门、Kiritimatiellaeota、浮霉菌门、蓝藻门、螺旋体门和互养菌门，其中试验组变形菌门、Patescibacteria的比例显著高于对照组(P＜0.05)，拟杆菌门、Kiritimatiellaeota、浮霉菌门、蓝藻门、螺旋体门、互养菌门的比例显著低于对照组(P＜0.05)。上述结果说明用酶菌混合处理稻草和苜蓿干草饲喂滩羊，其瘤胃内的差异菌门多达8个，影响了其瘤胃内环境。
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表 8 全样本优势菌门丰度 Table 8 Abundances of dominant bacteria at phylum level in whole sample |
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Proteobacteria：变形菌门；Bacteriodetes：拟杆菌门；Planctomycetes：浮霉菌门；Cyanobactria：蓝藻门；Spirochaetes：螺旋体门；Synergistetes：互养菌门。 图 2 门水平Welch’s t检验差异物种 Fig. 2 Difference species in Welch's t test at phylum level |
本试验中，对照组共获得基因5 121 024个，试验组共获得基因6 461 155个。与KEGG数据库对比可得各样品KEGG注释图(图 3)。由图 3可知，在A层级中，富集到新陈代谢(metabolism)层级的基因数量最多，其次是遗传信息处理(genetic information processing)、环境信息处理(environmental information processing)、细胞过程(cellular processing)以及人类疾病(human disease)层级。该结果表明，以酶菌混合处理稻草和苜蓿干草作为粗饲料饲喂滩羊，其瘤胃内主要功能酶是参与新陈代谢、遗传信息处理和环境信息处理。在B层级中，丰度排名前25的通路见表 9。由表 9可知，试验组嘌呤代谢(purine metabolism)、双组分系统(two-component system)和ABC转运蛋白(ABC transporters)等22条通路的基因数量与对照组无显著差异(P＞0.05)，而嘧啶代谢(pyrimidine metabolism)、氨基糖和核苷酸糖代谢(amino sugar and nucleotide sugar metabolism)、二羧酸代谢(glyoxylate and dicarboxylate metabolism)这3条通路的基因数量极显著高于对照组(P＜0.01)。
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Metabolism：新陈代谢；Carbohydrate metabolism：碳水化合物代谢；Amino acid metabolism：氨基酸代谢；Nucleotide metabolism：核苷酸代谢；Metabolism of cofactors and vitamins：辅助因子和维生素代谢；Energy metabolism：能量代谢；Lipid metabolism：脂质代谢；Glycan biosynthesis and metabolism：聚糖生物合成代谢；Metabolism of other amino acids：其他氨基酸代谢；Biosynthesis of other secondary metabolites：其他次生代谢产物的生物合成；metabolism of terpenoids and polyketides：萜类化合物和聚酮的代谢；Xenobiotics biodegradation and metabolism：外源生物的生物降解与代谢；Genetic Information Processing：遗传信息处理；Replication and repair：复制和修复；Translation：翻译；Folding, sorting and degradation：折叠、排序和退化；Transcription：誊写；Environmental Information Processing：环境信息处理；Membrane transport：膜运输；Signal transduction：信号转导；Cellular Processes：细胞过程；Cellular community-prokaryotes：原核微生物的细胞通讯；Human Diseases：人类疾病；Drug resistance：抗药性。 图 3 全样本KEGG通路注释图(A层级) Fig. 3 KEGG pathway annotation map of whole sample (level A) |
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表 9 KEGG通路较高丰度基因数量(B层级) Table 9 Number of genes in high abundance in KEGG pathway (level B) |
反映反刍动物生长性能的主要指标有采食量、日增重、料重比等。有研究表明，适宜的苜蓿补饲可以提高稻草纤维物质的消化率[12]。本试验选用稻草与苜蓿干草以60∶40比例组合作为粗饲料，增重效果较为理想。研究表明，在畜禽养殖过程中添加一些维生素制剂、微量元素制剂、酶制剂、微生物制剂等可以提高畜禽的生长性能和肉品质[13]。邱玉朗等[14]研究发现，用混合微生物发酵秸秆饲喂肉羊，其平均日增重提高36%，料重比降低28.68%。王平等[15]研究表明，在育肥绵羊基础饲粮中添加纤维素酶后，日增重可提高43.98%。李军[16]的研究结果显示，益生菌剂的添加可以提高肉羊的生长性能。申春红[17]的研究结果显示，在基础饲粮中添加2.0%复合微生物制剂可以提高肉牛的生长性能。本试验运用纤维素酶和复合益生菌混合处理稻草和苜蓿干草。以其作为粗饲料饲喂滩羊，显著提高了滩羊的总增重和平均日增重，并降低了料重比，说明该处理方式提高了滩羊的生长性能。
有研究表明，饲粮中添加酶制剂能够显著提高养殖户的经济效益。蔺国文[18]在枯黄玉米秸秆中添加不同比例的复合酶制剂饲喂肉牛，结果表明，0.10%的酶制剂效果最佳，日增重达到1.192 kg，比对照组提高了23.49%，经济效益显著增加。本试验用酶菌混合处理稻草和苜蓿干草饲喂滩羊，1只羊的日平均纯利润提高了1.3元，说明该处理方式的经济效益较为理想。
3.2 酶菌混合处理稻草和苜蓿干草对滩羊血清生化指标的影响血清生化指标反映了机体新陈代谢的变化情况[19]。其中，血清总蛋白不但承载了运输营养物质、调节运输物质等重要生理功能，还与组织蛋白质合成有密切联系，其含量能够反映机体的营养状况和蛋白质消化率[20]。血清球蛋白又称为免疫球蛋白，能够反映机体的抗病能力。良好的营养状况可使血清总蛋白和球蛋白含量维持在一个较高水平，二者含量的升高表明机体代谢活动增强[21]。血清尿素是机体蛋白质分解代谢的重要产物之一，体现了蛋白质的代谢情况。机体血清尿素含量降低，说明机体对氮的利用效率升高[22]。康怀艳[23]研究了益生菌发酵饲料对奶山羊血清生化指标和产奶性能的影响，结果表明，益生菌发酵饲料能够提高奶山羊血清总蛋白和球蛋白含量，降低血清尿素氮含量。余淼等[24]用芽孢杆菌、乳酸菌和酵母菌发酵饲料饲喂肉牛，结果显示，肉牛的血清总蛋白、白蛋白、免疫球蛋白G、免疫球蛋白A和免疫球蛋白M含量显著提高。这与本试验结果一致。本试验结果表明，用酶菌混合处理稻草和苜蓿干草饲喂滩羊，可以提高滩羊血清总蛋白、球蛋白含量，降低血清尿素含量，有益于滩羊的健康养殖。
3.3 酶菌混合处理稻草和苜蓿干草对滩羊瘤胃细菌多样性的影响目前随着宏基因组学的兴起，学者们针对瘤胃生态环境的研究越来越趋向于微观的分子。在瘤胃微生态系统当中，微生物区系的结构十分复杂，瘤胃微生物种群的数量以及区系组成受多种因素的影响。近年来，有关饲用纤维素酶或益生菌作为饲料添加剂对反刍动物瘤胃消化代谢影响的研究较多。有研究表明，在饲粮中添加分解纤维素酶制剂可以显著提高奶牛瘤胃微生物数量[25]。黄庆生等[26]研究表明，酵母培养物能够显著提高瘤胃总细菌数量，而对其他指标没有显著影响。Kong等[27]研究了饲喂不同粗饲料对奶牛瘤胃细菌多样性及结构的影响，结果显示，在门水平上，厚壁菌门和拟杆菌门占整个瘤胃细菌的比例较大，这与本试验研究结果一致。
3.4 酶菌混合处理稻草和苜蓿干草对滩羊瘤胃KEGG通路的影响KEGG能够从分子水平上系统研究差异基因的功能，因此是代谢通路研究的核心[28]。它涵盖了基因组、疾病和信号通路等数据库，整合了相关蛋白质、基因、代谢等多种信息，通过比对已知通路，按照不同功能分级。褚毅[29]通过在猪的基础饲粮中添加脂肪和糖研究代谢通路的差异，结果发现功能基因进行KEGG富集时集中在代谢通路上，进一步研究注释在代谢通路上的差异功能基因，发现添加脂肪和糖造成的差异主要表现在脂肪酸代谢方面。多项研究表明，二羧酸代谢与脂肪酸代谢有关。有研究表明，尿嘧啶参与了某些B族维生素的合成，其含量变化可能会引起B族维生素的变化[30]。本试验中，试验组嘧啶代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢、二羧酸代谢3条通路的基因数量极显著高于对照组，说明用酶菌混合处理稻草和苜蓿干草饲喂滩羊，提高了滩羊嘧啶代谢、氨基糖和核苷酸糖代谢、二羧酸代谢的基因数量，有可能会增强B族维生素的合成和脂肪酸的代谢功能。
4 结论酶菌混合处理稻草和苜蓿干草可以提高滩羊的增重和养殖的经济效益，同时，该处理方式提高了滩羊血清总蛋白、血清球蛋白含量，降低了血清尿素含量，改变了滩羊瘤胃细菌多样性和部分功能基因的数量。在本试验条件下，用酶菌混合处理的稻草和苜蓿干草饲喂滩羊的效果较优，有益于滩羊的健康养殖，可在生产中推广使用。
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