2. 内蒙古农业大学兽医学院, 呼和浩特 010018
2. College of Veterinary Medicine, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018, China
动物应激一直是制约我国畜牧产业发展的重要因素之一,许多因素可以导致动物应激。根据应激源的不同分为热应激、冷应激、束缚应激、运输应激等[1]。由高温刺激引起的热应激根据应激持续时间可分为急性热应激和慢性热应激。根据畜牧养殖业的实际情况,家畜热应激主要是由于季节变化导致饲养环境温度高于最适体温引起的,并且都有较长的持续时间,属慢性热应激。近些年来,随着全球气温普遍升高,气候变化导致的动物热应激逐渐威胁着世界生态系统和畜牧生产系统的可持续性[2]。热应激可引起畜禽体温调节及生理机能紊乱等一系列异常反应,甚至死亡[3]。国外几项研究报告表明,夏季高温会导致母牛妊娠率显著下降[4-5]。我国也有许多研究证实,热应激可以导致母畜繁殖性能下降[6-7]。生产性能和繁殖性能的提高是畜牧业可持续发展的重要前提。因此,热应激限制了我国畜牧业的发展,造成了巨大经济损失。Silanikove等[8]预测,由于全球变暖的进展,在不久的将来动物热应激问题会日益严峻。在我国肉牛养殖产业中,繁殖母牛的健康状况是影响肉牛业经济效益的最重要因素。有研究表明,奶牛处于热应激状态时采食量降低,生产性能下降[9]。热应激会引起母牛体内激素分泌失调、代谢紊乱以及胚胎早死等疾病,还会影响母牛的受胎率及流产率增加、新生犊牛死亡率增加[10]。而我国内蒙古地区多以粗放的饲养模式为主,夏季草原没有舍饲降温防控热应激的条件,这导致了放牧牲畜长时间处于慢性热应激的状态。国外有研究表明,增强营养干预可能会改善热应激期间动物的耐受性和生产性能[11-12]。因此,通过营养调控手段缓解热应激对草原放牧牲畜造成的负面影响是目前最有效的方式之一。而国内对热应激放牧牛营养调控方面缺乏相关的试验数据,为了更好地指导放牧肉牛产业的健康发展,本试验选用妊娠5个月左右的西门塔尔牛,研究热应激放牧妊娠牛营养调控对其生殖激素含量、免疫功能及抗氧化能力的影响,旨在为我国放牧的饲养模式下肉牛养殖业缓解热应激提供科学参考。
1 材料与方法 1.1 试验时间与地点本试验于2019年7月在内蒙古赤峰市阿鲁科尔沁巴彦温都尔草原进行。该地区是科尔沁草原和锡林郭勒草原的交错地带,牲畜资源丰富,且有天然河流经过,便于牲畜自由饮水,适合开展试验研究。
1.2 试验设计及饲粮试验随机选择妊娠5个月左右、健康、体重和体况相近的西门塔尔母牛18头,随机分为对照组(仅放牧)和试验组(营养调控),每组9头。天然牧场没有遮阴树木或人工遮阴棚等避暑措施,有天然河流经过,放牧试验牛全天自由采食牧草和自由饮水。试验开始前采集试验地草场的牧草样本,用概略养分分析法测定牧草养分,放牧草场牧草概略养分见表 1。根据我国《肉牛饲养标准》(NY/T 815—2004),在试验地牧草营养成分以及采食量的基础上,精准调配补饲料进行营养调控,补饲精料的组成及营养水平见表 2。对照组全天放牧不进行补饲,试验组每天归牧后进行补充饲喂精料,每头2.5 kg/d。预试期10 d,试验期60 d。
采用内外源指示剂结合法测定放牧牛的DMI,选取体况相近的放牧妊娠牛5头,每天08:30和18:30以胶囊形式喂服三氧化二铬(Cr2O3)各1次,每头牛每次12 g。预试期3 d,正试期7 d。正试期每天定时采集粪便200 g,将每头牛每天的粪样混合均匀阴干保存,用以测定粪中的Cr2O3含量,采用72-1分光光度计比色法测定[13]。采用人工模拟采样法采集牧草,现场跟群观察放牧牛采食牧草的种类和部位,连续7 d每天采集牧草2 000 g,混匀,保存于-20 ℃冰箱备用。牧草、粪样中的盐酸不溶灰分(AIA)含量采用4 mol/L AIA法测定。根据放牧牛采食牧草中干物质AIA含量、粪样中干物质含量及粪中干物质AIA含量按以下公式计算出放牧牛DMI:
式中:DMI为干物质采食量;F为粪样中干物质含量;a为粪中干物质AIA含量;b为采食牧草中干物质AIA含量。
1.4 牧草和精料营养成分的测定牧草和精料营养成分的测定指标包括干物质、粗蛋白质、粗灰分、粗纤维、粗脂肪含量和综合净能,参照陈浩等[15]的方法进行测定。
1.5 环境温湿度的测定由于试验是以在天然草场进行全年放牧的肉牛为研究对象,因此所测的环境指标均为自然环境下的温度和相对湿度。试验期间,记录草场温度和相对湿度,统计每天最高气温和最低气温并计算平均温度,环境温湿度指数(THI)的计算方法公式如下:
式中:Td为干球温度(℃);RH为相对湿度;Tw为湿球温度(℃)。
1.6 样品采集分别于试验期第1、30和60天早晨空腹进行颈静脉采血,每头牛10 mL,血样静置0.5 h后,用离心机999×g离心15 min,收集血清于离心管中,记录相关日期及编号后液氮储存,将样品送至实验室保存至超低温冰箱中,以待检验。
1.7 测定指标血清激素:三碘甲状腺原氨酸(T3)、催乳素(PRL)、促卵泡素(FSH)、孕酮(PROG)、雌二醇(E2)含量。
免疫指标:免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白G(IgG)、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-4(IL-4)含量及溶菌酶(LZ)活性。
抗氧化指标:超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性、丙二醛(MDA)含量、总抗氧化能力(T-AOC)。
以上指标均采用酶联免疫吸附测定(ELISA)法进行测定,利用GYI-LRH-400-D生化培养箱和BIO-RAD680型酶标仪检测上述指标,检测所需ELISA试剂盒购于江苏酶免实业有限公司,试验操作步骤详见试剂盒说明书。
1.8 数据处理用Excel 2016整理试验数据,采用SPSS 9.0软件对数据进行统计分析。2组间数据比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),组内组间(第1、30和60天间)数据比较采用独立样本t检验。结果以平均值±标准差表示,以P < 0.05为差异显著性水平。
2 结果 2.1 热应激与环境温度情况热应激的程度分为:轻度热应激(72 < THI < 78)、中度热应激(78 < THI < 88)和严重热应激(THI>88)。表 3为3次采样当天和整个试验期的平均温湿度及THI指数的测定情况。图 1所示为试验期间牧场THI变化趋势,结果显示在整个60 d的试验期间,有41 d处于轻度热应激状态,有3 d处于中度热应激状态。这表明草原放牧的试验牛群长期处于热应激环境。图 2为试验期间牧场环境温度的变化趋势,结果显示夏季放牧草场昼夜温差大,试验期间最高气温41.2 ℃,夜间最低气温10.2 ℃,日最大温差可达到25.5 ℃。这表明放牧肉牛不仅受到高温热应激的侵害,还处于气温日较差大的恶劣环境中。
由表 4可知,在试验第60天,试验组妊娠牛血清PROG含量显著高于对照组(P < 0.05),同时试验组妊娠牛血清E2含量显著高于对照组(P < 0.05)。而在整个试验期间,试验组组内组间妊娠牛血清PRL含量增加显著(P < 0.05),试验第60天显著高于第1天(P < 0.05)。试验组妊娠牛血清T3含量随着试验的进行有了显著的提高,在试验第60天显著高于第1天(P < 0.05)。2组妊娠牛血清FSH含量在组内组间无显著差异(P>0.05)。
由表 5可知,在试验第60天,试验组妊娠牛血清IL-2和IL-4含量显著高于对照组(P < 0.05),随着营养调控的持续进行,试验组组内妊娠牛血清IgA、IgM和IgG含量均有显著提高,其中IgA和IgM含量在试验第60天较第1天有显著提高(P < 0.05),IgG含量在试验第30天和第60天较第1天有显著提高(P < 0.05)。而在营养调控的过程中,2组妊娠牛血清LZ活性在组内和组内组间均无显著差异(P>0.05)。
由表 6可知,在整个试验期间,试验组组内妊娠牛血清GSH-Px活性和T-AOC显著增加(P < 0.05),试验期第30天和第60天较第1天有显著提高(P < 0.05),在试验第60天,试验组血清GSH-Px活性显著高于对照组(P < 0.05)。而2组妊娠牛血清SOD活性和MDA含量组内组间均无显著差异(P>0.05),但试验组血清SOD活性有高于对照组的趋势。
动物的繁殖功能主要受到下丘脑-垂体-性腺轴的调控[16]。高温刺激产生的非特异性生理反应会抑制下丘脑的活动,进而影响生殖相关激素的分泌。而E2是卵巢分泌的重要性激素,对于维持妊娠与PROG起协同作用。PROG可抑制子宫肌收缩,维持妊娠,有保胎作用。有研究表明,妊娠母牛遭受热应激时, 体内PROG和E2含量降低[17]。在本研究中,试验组妊娠牛血清PROG和E2含量显著高于对照组,表明营养调控对慢性热应激下妊娠牛PROG和E2的分泌有积极作用,在一定程度上可以保胎,降低流产风险。垂体分泌的FSH等促性腺激素的主要功能是控制卵巢的内分泌活动,间接对子宫内膜适应胚泡附植的各种变化产生影响。有研究证实,热应激会降低卵巢类固醇激素及促性腺激素的分泌[18]。本试验中,2组牛血清FSH含量差异不显著,主要原因可能是由于妊娠期间卵巢内卵泡不再发育成熟,也无法排卵,所以血清FSH含量没有显著增加。在妊娠期间体内PRL含量会随孕期进展而逐渐升高,而在热应激情况下,促肾上腺皮质激素(ACTH)大量分泌会干扰垂体前叶分泌PRL等激素[19]。营养摄入不足时,神经-内分泌系统导致催乳素抑制因子(PIF)增加,催乳素释放因子(PRF)减少,最终引起PRL的分泌减少,试验组组内妊娠牛血清PRL含量有显著提高,通过营养调控可以改善热应激期妊娠牛的PRL分泌状况。甲状腺素是调节机体代谢的重要激素,热应激时肉牛甲状腺机能减弱,代谢率降低,产热减少,以增加机体对炎热环境的适应,血清T3含量会明显降低[20],母牛妊娠期机体内E2含量增加,E2可以引起肝脏甲状腺素结合球蛋白(TBG)的合成增加,TBG与甲状腺素的结合力提高[21],也会导致血清中游离T3含量的降低。李妍等[22]研究表明,T3、甲状腺素(T4)含量随着饲粮营养水平的提高而增加,与本研究结果一致。提高营养水平会提高妊娠牛机体内T3含量,改善热应激状态下的甲状腺机能。
3.2 营养调控对慢性热应激期放牧妊娠牛血清免疫功能相关指标的影响免疫球蛋白主要参与体内体液免疫,负责机体保护性的免疫应答和自身的稳定,其在血清中水平的高低是评估免疫状况的重要指标,血清中球蛋白含量体现了机体免疫功能强弱[23]。本研究中的试验动物长期生存在热应激环境,有报道证实热应激会导致牛免疫功能下降[10],且试验所选取的天然牧场每日较大的温差还可能产生温差应激反应,出现神经系统、内分泌系统、免疫系统等生理紊乱,抵抗力下降,影响生产效益[24]。在本研究中,试验组组内妊娠牛血清IgA、IgM和IgG含量显著升高。由于PRL不仅可以促进乳腺发育和泌乳,还可以促进IgA的分泌;E2可以促进IgA和IgG的分泌,妊娠期间随着母牛体内PRL和E2分泌的增加可提高机体免疫功能。白细胞介素(IL)主要由T细胞产生,能调控免疫细胞。据报道,奶牛遭受热应激侵袭时,机体内淋巴细胞功能受到抑制,免疫因子含量降低,进而降低奶牛免疫功能[25]。本研究中通过营养调控显著提高了慢性热应激妊娠牛血清IL-2和IL-4含量,在一定程度上增强免疫机能,减轻热应激对机体造成的损害。
3.3 营养调控对慢性热应激期放牧妊娠牛血清抗氧化能力相关指标的影响当动物体处于热应激状态时,机体代谢水平提高,细胞产生过量且无法被及时清除的活性氧(ROS)自由基过多[26],损伤机体的正常生理机能。有研究表明,妊娠期胚胎-胎盘-母体间的血液循环完全建立以后,胎盘内的氧浓度迅速增加[27]。随着胎儿的生长,所需要的营养物质增多,通过胎盘排泄的代谢物增多,母体的各个系统、器官的代谢负荷加重,细胞活动所产生的ROS也不断增加[28]。有试验证明在热应激条件下,肉牛血清中的T-AOC、SOD和GSH-Px活性较非热应激条件明显降低,使机体抗氧化能力减弱[29]。饲粮营养、生理阶段、生长环境等有可能导致机体自由基水平变化的因素都能导致机体抗氧化物质含量变化。而饲粮营养水平对机体抗氧化的影响研究报道较少,本试验的营养调控主要是在牧草的基础上补充了蛋白质、矿物质以及维生素(维生素A、维生素D和维生E), 对慢性热应激状态下的妊娠母牛机体清除自由基有积极作用,减少氧化物的生成,可以增强抗氧化防御系统的能力。
4 结论夏季天然草场放牧的妊娠牛长时间处于昼夜温差较大的热应激状态,在本试验条件下,通过营养补饲有效地提高了放牧条件下妊娠牛的免疫功能和抗氧化能力,缓解了热应激对肉牛健康的危害,且显著提高了妊娠牛血清繁殖激素含量,对母牛繁殖性能的发挥具有积极作用。
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