2. 山西省农业科学院高粱研究所, 晋中 030600
2. Sorghum Research Institute, Shanxi Academy of Agricultural Sciences, Jinzhong 030600, China
高粱是全世界五大重要谷物之一。高粱耐盐碱、耐干旱,对土壤、气候等具有较强的适应性。高粱营养丰富,其主要营养成分与玉米相近。因此,高粱作为动物的饲料原料具有重要的应用价值。高粱籽实含有抗营养因子——缩合单宁。Pan等[1]测定了28个不同品种高粱籽实的单宁含量,发现大部分品种的高粱单宁含量为0.67%~1.51%。缩合单宁极性很强,能够与饲粮中的蛋白质结合,形成不易被瘤胃微生物降解的蛋白质-单宁复合物[2-3]。因此,单宁对饲粮中蛋白质具有过瘤胃保护作用。但是,很多研究显示,饲粮中添加单宁会导致蛋白质的消化率下降。Yang等[4]的研究结果显示,向肉牛饲粮中添加单宁酸降低了饲粮氮的消化率。Kronberg等[5]报道,饲粮中添加富含缩合单宁的胡枝子颗粒料,导致绵羊饲粮干物质和氮的消化率下降。Koenig等[6]报道,向肉牛饲粮中添加黑荆树(Acacia mearnsii)单宁提取物降低了饲粮氮的消化率。上述结果表明,在瘤胃中形成的蛋白质-单宁复合物可能在反刍动物后部消化道中分解不完全,因而导致饲粮氮消化率的下降。
聚乙二醇(PEG)是无毒、无味、化学性质稳定的乙二醇高聚物,在医药、食品、化工等众多研究领域已被广泛应用。PEG中的氢键能够与单宁中的酚羟基结合形成稳定的PEG-单宁复合物[7]。因此,单宁既能够与蛋白质结合,也能够与PEG结合,形成相应的复合物。也就是说,蛋白质和PEG之间在与单宁结合方面存在竞争作用。在饲粮中存在高粱单宁的条件下,添加PEG能否缓解高粱单宁对瘤胃发酵的不利影响,提高营养物质消化率,以及PEG在真胃中能否促进单宁-蛋白质复合物解离,释放出蛋白质,提高蛋白质消化率,尚不清楚。本研究计划采用体外两步消化法研究高粱单宁提取物(STE)与PEG协同作用对体外瘤胃发酵参数和营养物质消化率的影响,阐明STE对瘤胃发酵参数的影响以及PEG能否缓解STE对营养物质消化造成的不利影响。
1 材料与方法 1.1 试验材料本研究以精粗比为40 ∶ 60(干物质基础)混合料作为体外发酵基质,其组成及营养水平见表 1。
STE由山西省农业科学院高粱研究所提供,参照国家标准GB/T 27985—2011测得单宁含量为61%(干物质基础)。PEG(相对分子质量为4 000,分析纯)购自国药集团化学试剂有限公司。
以3头体重约为500 kg并装有永久性瘤胃瘘管的安格斯阉公牛作为瘤胃液供体,每天06:30和19:30各饲喂1次。瘤胃液供体动物饲粮组成及营养水平见表 2。
采用两步消化法,分别模拟瘤胃发酵和真胃消化过程[9],测定体外瘤胃发酵参数及干物质消化率(DMD)和粗蛋白质消化率(CPD)。
1.2.1 模拟瘤胃发酵于早晨饲喂后2 h,通过瘤胃瘘管分别从3头牛的瘤胃中采集200 mL瘤胃液,混合均匀,然后用4层纱布过滤。根据Zhao等[10]的方法配制缓冲液。按照4 ∶ 1(体积比)的比例将缓冲液与瘤胃液在39 ℃水浴锅中混合均匀,并持续通入二氧化碳气体。以容积为50 mL的离心管作为发酵容器。准确称取0.400 0 g风干发酵基质(表 1)样品置于每个离心管中。每个离心管注入40 mL缓冲液与瘤胃液的混合液,盖上橡皮塞。橡皮塞上装有1支玻璃滴管,滴管的吸球上留有一条缝隙,以释放发酵过程中产生的气体。然后放入温度为39 ℃的生化培养箱中进行培养发酵。发酵48 h后,按放入顺序依次取出离心管,置于冰上,终止发酵。用低温高速离心机(TGL 20M,上海卢湘仪离心机仪器有限公司)在4 ℃和1 800×g条件下,将培养液离心15 min。取上清液,用酸度计(pH-HJ 90,北京航天计算机集团有限公司)测定pH,然后放置在-20 ℃的冰柜中冷冻保存。离心沉淀用于模拟真胃消化过程。
1.2.2 模拟真胃消化将2.0 g胃蛋白酶(15 000 U/mg,上海阿拉丁生化科技股份有限公司)溶解于850 mL去离子水中,加入100 mL 1 mol/L盐酸(HCl),稀释至1 L,配制成胃蛋白酶溶液,该溶液中胃蛋白酶活性为30 000 U/mL。向体外瘤胃发酵的离心沉淀中加入40 mL新配制的胃蛋白酶溶液,然后将培养管放置在温度为38 ℃的生化培养箱中进行消化,并不时摇晃混匀。消化48 h后,将样品在4 ℃和1 800×g条件下离心(TGL 20M台式高速离心机,上海卢湘仪离心机仪器有限公司)15 min。分别收集上清液和离心沉淀,放置于-20 ℃的冰柜中冷冻保存。
1.3 试验设计本研究分为3个试验。每个试验均设置4个处理,每个处理设置8个重复,另外设置3个空白。STE和PEG的添加量均以干物质为基础。试验1:分别向发酵基质中添加0、0.50%、1.00%、2.00% STE作为试验处理,模拟体外瘤胃发酵和真胃消化过程。测定体外瘤胃发酵参数pH、挥发性脂肪酸(VFA)和氨态氮(NH3-N)浓度及两步消化过程后的体外DMD和CPD;试验2:在向发酵基质中添加1.50% STE的基础上,分别添加0、0.75%、1.50%、3.00% PEG作为试验处理,试验方法、过程及测定指标均与试验一相同;试验3:试验处理分为不添加STE和PEG(对照)、瘤胃发酵阶段添加1.50% STE、瘤胃发酵阶段添加1.50% STE和3.00% PEG、瘤胃发酵阶段添加1.50% STE+真胃消化阶段添加3.00% PEG,试验方法、过程均与试验1相同,测定指标为两步消化过程后的体外DMD和CPD。
1.4 指标测定根据AOAC(1990)[11]的方法测定发酵基质及瘤胃液供体牛饲粮的干物质和粗蛋白质含量。根据Van Soest等[12]的方法,应用ANKOM200纤维测定仪(A200i,美国Ankom科技公司)测定中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量。根据Broderick等[13]的苯酚次氯酸钠比色法,应用分光光度计(UV-1801,北京北分瑞利仪器有限公司)测定培养液中NH3-N浓度。应用气相色谱仪(TP-2060F,北京北分天普仪器技术有限公司)测定培养液中VFA浓度,计算总挥发性脂肪酸(TVFA)浓度。
1.5 数据统计分析应用Excel 2007对数据进行初步处理,然后应用SAS 9.4 (2013)软件中的one-way ANOVA程序对数据进行方差分析,采用Duncan氏法对各处理指标进行多重比较。以P < 0.05作为差异显著的判断标准,以0.05≤P < 0.10作为有变化趋势的标准。
2 结果与分析 2.1 STE对体外瘤胃发酵参数及营养物质消化率的影响表 3中结果显示,添加STE对培养液的pH没有显著影响(P>0.05)。添加0.50%和1.00% STE显著降低了培养液中TVFA浓度(P < 0.05),但是添加2.00% STE对TVFA浓度没有显著影响(P>0.05)。添加0.50% STE显著降低了培养液中乙酸、丙酸和丁酸浓度(P < 0.05),但是添加1.00%和2.00% STE对乙酸、丙酸和丁酸浓度没有显著影响(P>0.05)。添加2.00% STE显著降低了培养液中戊酸浓度(P < 0.05),但是添加0.50%和1.00% STE对戊酸浓度没有显著影响(P>0.05)。添加0.50%、1.00%和2.00% STE均显著降低了培养液中异戊酸浓度(P < 0.05)。不同添加量的STE导致培养液中TVFA、乙酸、丙酸和丁酸浓度均呈现先降低后升高的二次曲线变化(P < 0.05),并导致异丁酸、戊酸和异戊酸浓度均呈现线性下降(P < 0.05),但对乙酸/丙酸及NH3-N浓度没有显著影响(P>0.05)。添加0.50%、1.00%和2.00% STE均显著降低了体外DMD和CPD(P < 0.05),并且导致体外DMD和CPD呈现线性和二次曲线变化(P < 0.05)。
表 4中结果显示,在发酵基质中含有1.50% STE的条件下,添加0.75% PEG显著降低了培养液中TVFA、乙酸及丁酸浓度(P < 0.05),但是添加1.50%和3.00% PEG对TVFA、乙酸及丁酸浓度没有显著影响(P>0.05)。添加0.75%、1.50%和3.00% PEG对培养液的pH和丙酸、异丁酸浓度及乙酸/丙酸没有显著影响(P>0.05)。随着PEG添加量的增加,培养液中TVFA和NH3-N浓度线性升高(P < 0.05),乙酸浓度呈先下降再升高的二次曲线变化(P < 0.05),戊酸(P=0.088)和异戊酸(P=0.067)浓度具有线性升高的趋势。在发酵基质中含有1.50% STE的条件下,添加0.75%、1.50%和3.00% PEG对体外DMD没有显著影响(P < 0.05),但是具有线性提高体外CPD的趋势(P=0.089)。
表 5中结果显示,添加1.50% STE显著降低了体外DMD(P < 0.05)。在瘤胃发酵阶段或者真胃消化阶段添加3.0%PEG对STE抑制体外DMD的影响均没有缓解作用。添加1.50% STE显著降低了体外CPD(P < 0.05)。在瘤胃发酵阶段或者真胃消化阶段添加3.0%PEG均缓解了STE对体外CPD的抑制作用。
瘤胃液pH是反映瘤胃发酵状况的重要指标。正常饲养管理条件下,成年牛的瘤胃液pH为5.5~7.0。Yildiz等[14]研究表明,在绵羊饲粮中添加185和370 g/d橡树缩合单宁提取物对瘤胃液pH没有显著影响。在本试验中,向发酵基质中添加不同水平的STE对培养液的pH没有显著影响,与前人研究结果一致。
饲粮中的碳水化合物在瘤胃可以被发酵产生乙酸、丙酸、丁酸等VFA。VFA通过消化道吸收后被反刍动物利用,是反刍动物的主要能量来源[15]。本试验结果显示,添加STE降低了培养液中TVFA浓度,而添加PEG则提高了培养液中TVFA浓度。这表明STE能够抑制饲粮中碳水化合物的发酵,因而降低了TVFA的浓度。
前人研究结果显示,饲粮中添加银合欢缩合单宁降低了培养液中原虫的数量[16],饲粮中添加鸡眼草缩合单宁降低了山羊瘤胃液中原虫的数量[17],而饲粮中添加单宁酸也降低了肉牛瘤胃中原虫的相对丰度[4]。这些研究结果表明,缩合单宁和水解单宁均能够降低瘤胃液中原虫数量。还有研究显示,饲粮中添加漆树水解单宁能够降低瘤胃中产琥珀酸丝状杆菌和黄色瘤胃球菌的相对丰度[18]。瘤胃原虫及产琥珀酸丝状杆菌和黄色瘤胃球菌对于碳水化合物在瘤胃中的发酵具有重要作用,因此,本研究中STE降低培养液中TVFA浓度的原因可能是通过抑制瘤胃原虫和部分瘤胃细菌的生长和活动造成的结果。由于本研究没有测定瘤胃微生物区系变化情况,STE究竟抑制了哪些瘤胃微生物的生长和活动还需要进一步研究。STE对培养液中不同VFA的影响不同,可能是STE对不同瘤胃微生物的作用不同所造成的。本研究结果显示,在发酵基质中含有STE的条件下,添加PEG能够提高培养液中TVFA浓度。导致这一结果的原因可能是PEG与STE结合,缓解了STE对碳水化合物发酵的抑制作用。
Beauchemin等[19]研究结果显示,饲粮中添加1%和2%(干物质基础)的白坚木单宁提取物,使肉牛瘤胃液的NH3-N浓度线性降低。Yang等[4]研究结果表明,肉牛饲粮中添加13.0或26.0 g/kg的单宁酸显著降低了瘤胃液的NH3-N浓度,而添加6.5 g/kg的单宁酸则对瘤胃液NH3-N浓度没有显著影响。单宁降低瘤胃液NH3-N浓度的原因可能有2个方面:一是单宁与蛋白质结合形成了复合物,抑制了蛋白质的降解;二是单宁抑制了瘤胃中蛋白质降解菌的活性。而本研究中试验1的结果显示,添加2.00%以下的STE对培养液中NH3-N浓度没有显著影响。蛋白质降解提高NH3-N浓度,而微生物蛋白合成降低NH3-N浓度。因此,这可能是STE抑制了蛋白质的降解,同时抑制了瘤胃微生物蛋白合成造成的。由于本研究的试验1没有测定蛋白质降解率和微生物蛋白合成量,因此,不能确定添加STE没有影响培养液中NH3-N浓度的确切原因。
Arisya等[20]研究了栗树单宁提取物、朱缨花单宁提取物及毛野牡丹单宁提取物对体外瘤胃发酵饲粮粗蛋白质降解率的影响。结果表明,饲粮中添加2%(干物质基础)不同来源的单宁提取物均降低了饲粮干物质和粗蛋白质的降解率。Yang等[4]向肉牛饲粮中添加26.0 g/kg DM单宁酸也显著降低了饲粮的干物质、有机物、粗蛋白质的全消化道消化率。本试验结果显示,向发酵基质中添加0.50%、1.00%、2.00% STE均降低了体外DMD和CPD,这与Arisya等[20]和Yang等[4]的研究结果一致。STE降低DMD和CPD的原因可能是在瘤胃发酵阶段单宁与饲粮蛋白质结合形成了复合物,而在真胃消化阶段这种复合物没有被有效解离,因而降低了CPD和DMD。而本研究结果显示,在瘤胃发酵阶段或真胃消化阶段添加PEG均提高了体外CPD。这可能是在瘤胃发酵阶段,PEG与STE结合减少了STE与蛋白质结合的机会,因而提高了CPD。而本研究中试验2的结果显示,在发酵基质中含有STE的条件下,添加PEG提高了培养液中NH3-N浓度。这与刘艳玲[21]的研究结果及本研究中添加PEG提高体外CPD的结果一致。关于PEG在真胃消化阶段能否促进单宁-蛋白质复合物的解离,还需要进一步开展动物试验进行研究。
4 结论① STE抑制碳水化合物在体外瘤胃中的发酵,降低培养液中TVFA浓度,并降低体外DMD和CPD。
② 在瘤胃发酵阶段或者真胃消化阶段添加PEG均能够缓解STE对营养物质消化造成的抑制作用,提高体外DMD。在瘤胃发酵阶段添加PEG能够同时提高体外DMD和CPD。
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