2. 四川农业大学动物科技学院, 成都 611130
2. College of Animal Science and Technology, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China
作为畜牧生产大国，我国的饲料年总产量超2亿t。由于受到光照、温度、湿度、微生物等的影响，饲料往往会出现不同程度的氧化酸败。而这些氧化酸败饲粮会对动物的生长性能、免疫能力和抗氧化能力造成很多不良影响。已有的大量研究表明，陈化饲料或饲粮中使用氧化油脂会降低动物的生长性能，并导致动物机体的抗氧化能力受损，发生氧化应激[1-4]。
果胶寡糖(pectic oligosaccharide, POS)是果胶经过解聚作用后形成的一类稳定性好、耐热性好及甜度低的糖类化合物(主要成分是果胶二糖和果胶三糖)，但其并不能被人体和动物的消化系统消化吸收，而是被肠道微生物利用进而发挥作用[5]。近年来的研究表明，果胶寡糖具有诸多生理功能，如提高机体的抗氧化能力、改善肠道健康、调节脂类代谢、提高机体免疫等[6-8]。针对其抗氧化能力的研究表明，果胶寡糖在体内和体外均具有抗氧化作用。杜丽娟等[9]研究发现，山楂果胶寡糖对超氧自由基、羟自由基和二苯基苦基苯肼(1, 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)自由基均表现出了很强的清除作用。本课题组前期试验也表明，饲粮添加苹果果胶寡糖可显著提高断奶大鼠血清和断奶仔猪肠道的抗氧化能力，并可缓解轮状病毒攻毒诱导的仔猪肠道中抗氧化能力下降[7, 10]。因此，本研究拟探讨氧化饲粮中添加果胶寡糖是否可改善断奶大鼠生长性能、空肠和肝脏组织结构及抗氧化能力，以期进一步完善果胶寡糖提高机体抗逆性的可能机制，这将为果胶寡糖在畜禽生产上的应用提供理论基础。
1 材料与方法 1.1 试验材料果胶寡糖：购自河北某生物技术有限公司，由苹果果胶通过酶解而来，有效成分(果胶二糖和果胶三糖)含量>30%，其他成分为辅料(玉米淀粉)。
1.2 试验动物与设计试验选取18只健康的雄性3周龄断奶Wistar大鼠(成都达硕实验动物有限公司提供)，按体重相近原则随机分为3组，即对照组、氧化饲粮组和氧化饲粮补充果胶寡糖组，分别饲喂正常饲粮、氧化饲粮和添加200 mg/kg果胶寡糖的氧化饲粮，每组6个重复，每个重复1只大鼠。试验期为21 d。试验在四川农业大学动物营养研究所教学试验基地完成，试验大鼠采用单笼饲养，常规饲养管理，自然采光、通风，自由采食、饮水。
试验基础饲粮采用AIN-93G鼠纯合饲粮标准，交由成都达硕实验动物有限公司配制，基础饲粮组成及营养水平见表 1。添加果胶寡糖的饲粮是以200 mg/kg果胶寡糖等量替代基础饲粮中玉米淀粉配制而成。氧化饲粮和添加200 mg/kg果胶寡糖的氧化饲粮为2019年5月配制，常温保存；正常饲粮为2020年5月配制。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) |
测定各组饲粮的酸价(acid value, AV)和过氧化物值(peroxide value, POV)，具体方法分别参考《食品安全国家标准食品中酸价的测定》(GB 5009.229—2016)和《食品安全国家标准食品中过氧化值的测定》(GB 5009.227—2016)，用于表示饲粮的氧化程度；各组饲粮中黄曲霉毒素B1含量采用酶联免疫吸附测定(ELIAS)方法进行测定，试剂盒购于百奥森(江苏)食品安全科技有限公司。
1.3.2 果胶寡糖的体外抗氧化活性果胶寡糖的总还原能力和对DPPH自由基清除率具体测定方法参考钟伟萍[11]进行。果胶寡糖对2, 2′-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐[2, 2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid), ABTS+]自由基清除率采用上海碧云天生物技术有限公司生产的试剂盒测定，具体测定方法参照试剂盒说明书。所有指标均以维生素C作为阳性对照，并设空白对照。
1.3.3 生长性能每日记录采食量，于试验第1和22天对所有大鼠进行空腹称重，用于计算体增重和采食量。
1.3.4 样品采集试验第22天称重后，对所有大鼠进行乙醚麻醉，屠宰。迅速分离肝脏和空肠，于相同部位取组织块于4%多聚甲醛中固定，并取组织块分装于冻存管中，液氮速冻后置于-80 ℃保存。
1.3.5 空肠和肝脏组织病理观察空肠和肝脏组织石蜡切片的制作参考Mao等[10]的方法进行。对空肠和肝脏组织切片进行照相，分析和记录组织的病理变化。
1.3.6 空肠和肝脏抗氧化指标样品前处理方法：取0.1 g左右(分析天平称量精确至0.001 g)空肠或肝脏组织样品于2 mL的EP管中，按组织∶预冷生理盐水=1∶9(质量体积比)的比例加入预冷生理盐水，在匀浆机中充分匀浆，4 ℃、3 500 r/min离心10 min，吸取上清，用于抗氧化指标的测定。
空肠和肝脏组织样品中总蛋白与丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量、总抗氧化能力(total antioxidant capacity, T-AOC)以及总超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase, T-SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)活性采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒测定，具体测定方法参照试剂盒说明书。
1.4 数据处理与分析所有的数据采用Excel 2013进行初步整理后，大鼠生长性能和脏器抗氧化能力数据采用SPSS 25.0统计软件进行单因素方差分析，处理间差异显著时采用Duncan氏法进行多重比较；果胶寡糖与维生素C的体外抗氧化能力数据以每个剂量进行t检验。当P < 0.05时，表明差异显著。数据以平均值±标准误表示。
2 结果 2.1 饲粮的氧化程度和霉变情况从表 2中可以看出，与正常饲粮相比，经过1年常温存储的氧化饲粮和添加200 mg/kg果胶寡糖的氧化饲粮的酸价和过氧化值均升高；而与氧化饲粮相比，添加200 mg/kg果胶寡糖的氧化饲粮的酸价和过氧化值均有不同程度的降低。关于饲粮的霉变情况，通过观察，本试验开始前各组饲粮(包括2个长期存放的氧化饲粮)均未出现霉变；而各组饲粮中黄曲霉毒素B1含量的检测结果显示，其含量均低于1 μg/kg。这些可在一定程度上说明本试验使用的3种饲粮并未发生霉变。
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表 2 3种饲粮中酸价和过氧化值 Table 2 AV and POV in 3 kinds of diets |
从图 1中可以看出，在体外研究中，维生素C表现出了极强的总还原能力、DPPH自由基清除能力和ABTS+自由基清除能力，而果胶寡糖表现出的总还原能力和DPPH自由基清除能力并不明显，仅表现出对ABTS+自由基具有一定的清除能力。
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图 1 果胶寡糖的体外抗氧化活性 Fig. 1 In vitro antioxidant activity of POS |
从表 3中可以看出，与对照组大鼠相比，氧化饲粮组大鼠的体增重和采食量显著降低(P < 0.05)；而添加果胶寡糖可以显著缓解氧化饲粮引起的大鼠体增重和采食量下降(P < 0.05)。
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表 3 氧化饲粮中添加果胶寡糖对断奶大鼠生长性能的影响 Table 3 Effects of adding POS into oxidized diet on growth performance of weaned rats |
从图 2和图 3可以看出，对照组大鼠空肠和肝脏组织形态结构正常；氧化饲粮组大鼠空肠黏膜浅层可见黏膜上皮坏死，部分黏膜上皮脱落，肠腺内可见病理性核分裂，黏膜下层可见轻度淋巴细胞浸润，肝血窦淤血，中央静脉轻度淤血；氧化饲粮补充果胶寡糖组大鼠空肠黏膜轻度坏死，肝脏中央静脉轻度淤血。由此可见，氧化饲粮的饲喂会导致空肠和肝脏严重的病理变化，而果胶寡糖的添加可在一定程度上缓解空肠和肝脏病变的发生。
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A: 对照组；B: 氧化饲粮组；C: 氧化饲粮补充果胶寡糖组。表 3同。 A: control group; B: oxidized diet group; C: oxidized diet+POS group. The same as Table 3. 图 2 大鼠空肠组织形态 Fig. 2 Histomorphology of jejunum in rats (40×) |
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图 3 大鼠肝脏组织形态 Fig. 3 Histomorphology of liver in rats (40×) |
从表 4中可以看出，与对照组大鼠相比，氧化饲粮组大鼠空肠和肝脏中T-SOD、GSH-Px活性和T-AOC显著降低(P < 0.05)，MDA含量显著升高(P < 0.05)；果胶寡糖的添加显著缓解了氧化饲粮导致大鼠空肠和肝脏中T-AOC和T-SOD活性的下降及MDA含量的上升(P < 0.05)，但对GSH-Px活性无显著影响(P>0.05)。
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表 4 氧化饲粮中添加果胶寡糖对断奶大鼠肝脏和空肠抗氧化指标的影响 Table 4 Effects of adding POS into oxidized diet on antioxidant indices in liver and jejunum of weaned rats |
饲料氧化酸败会产生酮、醛等有异味的化合物，造成饲料哈变，降低饲料适口性，影响采食量，严重的会造成动物中毒，甚至死亡。大量研究发现，氧化饲粮不仅会降低动物的生长性能，同时还会对动物机体抗氧化性能、生物膜完整性以及机体免疫功能产生不良影响[12-15]。袁施彬等[2]研究发现，断奶仔猪饲粮中添加氧化鱼油显著降低了肝脏中超氧化物歧化酶(SOD)和GSH-Px活性，升高了MDA含量，且降低了断奶仔猪的生长性能和养分利用率。本试验中，对断奶大鼠饲喂长期常温存放的饲粮，且饲粮中酸价和过氧化值大幅提高(且已超过了相关标准)，用以模拟实际生产中氧化饲粮对动物机体的影响。试验结果表明，饲喂断奶大鼠氧化饲粮显著降低了其采食量和体增重，导致了空肠和肝脏组织的病变，并显著影响了大鼠空肠和肝脏的抗氧化能力，诱导了氧化应激。这些结果与前人的相关研究结果[2, 12-15]一致，因此，本试验成功构建了饲喂氧化饲粮损伤大鼠生长和健康的模型。
近年来的大量研究发现，饲粮中添加果胶寡糖可提高动物的生长性能。本课题组前期研究发现，饲粮中添加苹果果胶寡糖可提高断奶大鼠和断奶仔猪(甚至是轮状病毒攻毒仔猪)的生长性能[7, 10]。而本试验结果也表明，添加200 mg/kg的果胶寡糖能显著缓解氧化饲粮诱导断奶大鼠采食量和体增重的下降。机体生长的变化与其对营养物质的消化、吸收和利用有关，而肠道和肝脏是机体摄入营养物质的消化、吸收和代谢的主要器官，因此，本试验对大鼠的空肠和肝脏组织结构进行了观察。相关的结果表明，尽管饲喂添加200 mg/kg果胶寡糖的氧化饲粮的大鼠的空肠和肝脏组织仍存在一定病变，但与饲喂氧化饲粮的大鼠的空肠和肝脏组织相比，病变程度得到明显缓解。
氧化还原状态是机体(包括器官、组织和细胞)健康的重要基础[16]。果胶寡糖具有提高机体抗氧化能力的作用。Li等[6]研究发现，高脂饲粮中山楂果胶寡糖的添加能显著降低小鼠血清中MDA含量，提高血清中T-SOD活性。本课题组前期的研究表明，饲粮添加苹果果胶寡糖可以提高大鼠血清抗氧化能力[7]，并缓解轮状病毒攻毒诱导的仔猪肠道中抗氧化能力下降[10]。而本试验得到了类似的结果，即果胶寡糖的添加显著缓解了氧化饲粮对断奶大鼠空肠和肝脏抗氧化能力(包括T-AOC、T-SOD活性和MDA含量)的负面影响。那么，可以推测，果胶寡糖改善氧化饲粮诱导空肠和肝脏组织损伤与其改善机体的抗氧化能力有关。
除了刺激机体提高抗氧化能力外，果胶寡糖本身也具有抗氧化活性。杜丽娟等[9]研究发现，山楂果胶寡糖对超氧自由基、羟自由基和DPPH自由基均表现出了很强的清除能力。丁鹏等[17]对黑莓果胶寡糖的研究发现，其对DPPH自由基和ABTS+自由基有很强的清除能力。本试验使用的果胶寡糖来源于苹果，对其总还原能力及DPPH自由基清除能力和ABTS+自由基清除能力的检测结果表明，来源于苹果的POS的总还原能力仅为相同剂量维生素C的5.88%~9.27%，对DPPH自由基的清除能力仅为相同剂量维生素C的3.13%~11.46%，对ABTS+自由基的清除能力为相同剂量维生素C的66.67%~81.72%。这些结果表明，本试验所用果胶寡糖(来源于苹果)表现出了一定的抗氧化活性，但仅对ABTS+自由基表现出较强的清除能力，其总还原能力和对DPPH自由基的清除能力较弱。与前人的研究结果存在差异的原因可能在于果胶寡糖的来源不同。根据果胶寡糖表现出的一定抗氧化活性，可以在一定程度上解释添加果胶寡糖的氧化饲粮过氧化值和酸价低于氧化饲粮。鉴于前人的研究结果发现，果胶寡糖还具有调节脂类代谢、免疫等营养生理功能，而这些功能是否在缓解氧化饲粮诱导机体损伤中发挥了作用，还有待于进一步研究。
4 结论尽管未完全缓解氧化饲粮对大鼠的影响，但添加果胶寡糖在一定程度上改善了断奶大鼠的生长性能，而这可能源于果胶寡糖通过提高机体抗氧化能力改善氧化饲粮对大鼠肝脏和空肠组织结构的破坏。
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