原虫在反刍动物瘤胃发酵过程中具有十分重要的作用，每毫升瘤胃内容物中有105~107个原虫[1]。瘤胃原虫有吞噬细菌、降低细菌对饲粮中淀粉消化率的作用，同时也可以将饲粮中纤维物质和淀粉等转化成挥发性脂肪酸，减缓碳水化合物在瘤胃内的发酵速度，稳定瘤胃pH。除此之外，原虫也有增加甲烷产量的负面作用[2]。植物单宁也叫鞣酸、鞣质或植物多酚，在植物体内含量仅次于纤维素、半纤维素和木质素[3]。根据结构及性质不同，将单宁分为缩合单宁(CT)和可水解单宁(HT)。CT又名原花青素，分子质量大，可以被氧化，但不易被水解[4]。HT是儿茶酚和没食子儿茶酚单体的多聚物[5]，以多糖为中心结构，其具有的羟基能与酸发生酯化反应，在热刺激或者弱酸条件下易被分解，是一种能够改善畜禽健康的优质天然植物提取物[6]，也是一种天然的反刍动物瘤胃发酵调控剂。Cieslak等[7]研究发现，在奶牛饲粮中添加越橘单宁，瘤胃原虫总数显著降低。体外培养试验中，向培养液中混合添加HT和CT或者单独添加HT时，发现纤毛虫数量均有所下降，分别下降36.2%和12.3%[8]。李大彪等[9]发现，在绵羊和绒山羊饲粮中添加6%的CT，绒山羊的瘤胃原虫数量显著低于对照组，绵羊瘤胃原虫数量与对照组相比有下降趋势。但是，也有研究表明，在奶牛饲粮中添加的单宁含量达105 g时，对原虫数量无显著影响[10]。本课题组前期研究发现，饲粮中含2%和4%的单宁可显著降低绵羊单位干物质采食量的甲烷排放量[11]，这是否与单宁影响了瘤胃原虫种群数量和区系有关？为此，本试验应用显微镜计数方法结合高通量测序技术，检测了单宁对绵羊瘤胃原虫数量和种群多样性的影响，旨在为富含单宁粗饲料资源的开发利用提供科学依据。
1 材料与方法 1.1 试验设计及饲粮本试验选取体况良好、体重45 kg左右的杜蒙杂交羯羊15只，随机分为3组，分别为Ⅰ组(对照组，不含单宁)、Ⅱ组(含2%单宁)和Ⅲ组(含4%单宁)，每组5只羊。饲粮中单宁来自结荚期的柠条，柠条购自内蒙古百瑞草业有限公司。饲粮的精粗比为4∶6，3组饲粮根据等能等氮的原则加工成全混合日粮颗粒。柠条的营养成分和缩合单宁含量见表 1[11]。试验动物于每天09：00和17：00分别饲喂1次，自由饮水。试验动物在预试期统一驱虫处理。试验预试期14 d，正试期20 d，采用单因素完全随机试验设计。饲粮营养水平参考《动物营养参数与饲养标准》[12]，其组成及营养水平见表 2。
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表 1 柠条中的营养成分和缩合单宁含量(风干基础) Table 1 Nutritional components and condensed tannin content in Caragana korshinskii (air-dry basis) |
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表 2 饲粮组成及营养水平(干物质基础) Table 2 Composition and nutrient levels of diets (DM basis) |
在正试期的第18天和第19天晨饲前和晨饲后6 h通过口腔采样器采集瘤胃液，迅速经4层纱布过滤后，将一部分瘤胃液用2倍体积的甲基绿福尔马林(MFS)染色液进行固定，用于计数原虫。另外，将晨饲后6 h瘤胃液分装于冻存管中液氮速冻后-80 ℃保存，用于高通量测序分析。
1.3 瘤胃液中原虫计数 1.3.1 固定原虫用染色液的配制方法MFS染色液：100 mL 35%福尔马林、8.0 g氯化钠、0.6 g甲基绿加入到900 mL蒸馏水中混合均匀。
瘤胃液混匀，过滤，将10 mL滤液和20 mL固定用MFS染色液混匀，轻摇，4 ℃保存备用。
1.3.2 原虫计数方法计数原虫数量选用血球计数板，深0.5 mm，25个中格，16个小格，按对角线方位，数左上、左下、右上、右下的4个中方格和中央1个中方格的菌数，共为80个小格，每个样品计数3次，取平均值。
计数前，轻轻摇均混合溶液，用移液枪吸取0.5 mL混合溶液，从盖上盖玻片的计数板一侧缓慢添加使之不产生气泡，“H”型玻璃槽被填满溶液后静置10~15 min。
1.3.3 计算公式
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式中：X为每毫升瘤胃液样品中所含原虫数；A为5个中方格内的原虫数；B为稀释倍数。因每个计数室体积为0.5 mm3，将其换算成1 cm3(1 mL)时需乘以2×1 000。
1.4 瘤胃液中微生物总DNA提取、扩增和测序瘤胃液样品送至上海美吉生物医药科技有限公司分析原虫多样性，采用十六烷基三甲基溴化铵法(CTAB)提取原虫的基因组总DNA。使用特异性引物Pssu316F(5′-GCTTTCGWTGGTAGTGTATT-3′)和Pssu539R(5′-CTTGCCCTCYAATCGTWCT-3′)[13]，进行PCR扩增，扩增程序为：95 ℃预变性3 min，30个循环(95 ℃变性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s)，最后72 ℃延伸10 min(PCR仪：ABI GeneAmp® 9700型)。PCR反应体系为20 μL，详见表 3。PCR产物经2%琼脂凝胶电泳检测，使用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit对PCR产物纯化，文库构建使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit。构建完成后经QuantusTM Fluorometer进行PCR产物的定量检测，使用Miseq PE300平台进行测序。使用UPARSE软件根据97%的相似度对序列进行操作分类单元(OTU)聚类。
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表 3 PCR反应体系 Table 3 System for PCR reaction |
数据经Excel 2013整理，采用SAS 9.2软件包中的mixed程序进行方差分析，多重比较采用Duncan氏法，结果用平均值和标准误表示，以P < 0.05作为差异显著性判断标准。
2 结果 2.1 绵羊瘤胃原虫测序深度本试验各组测序覆盖度均达到了0.99，表示覆盖度足够，满足后续分析要求。本试验的15个样品中共得到941 190条高质量序列，每个样品为62 746条序列。以97%的一致性聚类为40个OTU。绵羊瘤胃原虫Shannon稀释曲线(图 1)最终趋于平缓，说明本试验的测序深度已经覆盖了瘤胃液中绝大部分的原虫样品，可进行后续数据分析。
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图 1 原虫Shannon稀释曲线 Fig. 1 Shannon dilution curve of protozoac |
由表 4可知，Ⅱ组和Ⅲ组绵羊瘤胃原虫Chao 1指数显著低于对照组(P < 0.05)，Shannon指数、Simpson指数和Ace指数随着饲粮单宁水平增加呈现逐渐降低的趋势，但3组间差异不显著(P>0.05)。
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表 4 饲粮不同水平单宁对绵羊瘤胃原虫alpha多样性的影响 Table 4 Effects of dietary different levels of tannin on alpha diversity of rumen protozoa in sheep |
由表 5可知，在晨饲前和晨饲后6 h，Ⅲ组原虫数量显著低于对照组(P < 0.05)，Ⅱ组有低于对照组的趋势，但差异不显著(P>0.05)。
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表 5 饲粮不同水平单宁对绵羊瘤胃原虫数量和属水平物种组成的影响 Table 5 Effects of dietary different levels of tannin on number of protozoa and species composition at genus level of rumen in sheep |
由表 5可知，绵羊瘤胃液中主要原虫属为头毛虫科下的未分类的属、内毛虫属、前毛虫属、厚毛虫属、两腰纤毛虫属和均毛虫属。3个组的优势原虫属均为头毛虫科下未分类的属。Ⅲ组的均毛虫属相对丰度显著高于对照组和Ⅱ组(P < 0.05)，对照组和Ⅱ组间无显著差异(P>0.05)。Ⅱ组和Ⅲ组内毛虫属相对丰度有低于对照组的趋势(P=0.06)；Ⅱ组和Ⅲ组前毛虫属相对丰度有低于对照组的趋势(P=0.07)；头毛虫科下的未分类的属、厚毛虫属和两腰纤毛虫属相对丰度各组间无显著差异(P>0.05)。
2.4 绵羊瘤胃原虫种群韦恩(Venn)图分析由图 2可知，3组绵羊瘤胃共享的核心原虫OTU数为29个，占各组OTU数的比例均为82.9%。对照组和Ⅱ组共享的OTU数为31个，各自特有的OTU数分别为1和2个。对照组和Ⅲ组共享的OTU数为32个，各自特有的OTU数均为1个。Ⅱ组和Ⅲ组共享的OTU数为31个，各自特有的OTU数分别为2和1个。
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Ⅰ：对照组；Ⅱ：Ⅱ组；Ⅲ：Ⅲ组。 Ⅰ: control group; Ⅱ: group Ⅱ; Ⅲ: group Ⅲ. 图 2 瘤胃原虫OTU水平Venn分析图 Fig. 2 Venn analysis graph of rumen protozoa at OTU level |
由图 3可知，Ⅱ组和Ⅲ组瘤胃原虫组成明显单独聚集成簇(R=0.4760;P=0.0190)(图 3-C)；对照组和Ⅱ组瘤胃原虫的相似性也较小(R=0.276 0;P=0.096 0)(图 3-A)，而对照组和Ⅲ组之间瘤胃原虫组成相似性较高(R=-0.064 0;P=0.616 0)(图 3-B)。
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图 3 绵羊瘤胃原虫种群主坐标分析图 Fig. 3 PCoA diagram of rumen protozoa population in sheep |
原虫是反刍动物瘤胃微生物的重要组成部分，而且原虫在众多的瘤胃微生物中所占体积最大，占总微生物体积的30%~80%[13]。本试验中研究得出，饲粮中含4%柠条来源的单宁显著降低了晨饲前和晨饲后6 h瘤胃原虫数量，饲粮中含2%单宁也有降低瘤胃原虫数量的趋势。Jolazadeh等[14]在荷斯坦公牛饲粮中添加从开心果提取的缩合单宁，结果发现其降低了瘤胃原虫总量。丁学智[15]研究发现，在瘤胃体外发酵试验中，随着单宁浓度的增加原虫数量显著减低。杨凯[16]发现肉牛饲粮中添加6.5、13.0和26.0 g/kg单宁时，瘤胃原虫数量均显著降低。上述研究结果均与本试验结果一致，分析其原因可能是单宁降低了瘤胃细菌的数量，间接影响了原虫氮的供给，进而抑制了原虫的生长[5, 17]。但是，也有试验结果表明，单宁对瘤胃原虫的相对丰度无显著影响[18]。不同的研究得出的单宁对瘤胃原虫数量影响的结果不一致，这可能与不同的试验单宁来源、单宁添加量、采样时间、动物品种不同有关。
3.2 单宁对绵羊瘤胃原虫多样性的影响瘤胃原虫在反刍动物瘤胃发酵过程中扮演十分重要的作用，原虫的丰度与多样性受饲粮、动物品种等多种因素的影响。近年来，植物提取物影响反刍动物瘤胃原虫多样性与丰度的研究受到广泛关注。王彩蝶等[19]研究发现，醋酸棉酚对绵羊瘤胃液原虫多样性无显著影响。有研究报道，存在于印度田菁叶中的单宁对原虫多样性没有显著影响[20]。本试验结果显示，绵羊饲粮中含2%和4%柠条来源的单宁对绵羊瘤胃原虫Shannon指数、Simpson指数无显著影响，但会降低瘤胃原虫相对丰度。从Venn图的试验结果可以发现，对照组与2个试验组的共享原虫占总原虫比例达到82.9%，这表明单宁对瘤胃液原虫多样性没有产生显著影响。从主坐标分析的试验结果可以发现，对照组和2个试验组原虫组成均具有一定的相似性，这也表明单宁对瘤胃液原虫多样性没有产生显著影响。本研究得出，在属水平上，动物瘤胃内原虫各属的数量随着饲粮中单宁含量的变化而有所变化, 2个试验组的内毛虫属和前毛虫属相对丰度都显示有低于对照组的趋势，与多样性指数中的Chao1指数得出的结论一致，这表明在属水平上，单宁可以降低部分原虫属的相对丰度，内毛虫属在瘤胃蛋白质降解和微生物氮循环中发挥重要作用，这说明单宁可能会通过降低瘤胃内毛虫属的数量对瘤胃蛋白质的利用起到负面效果。除此，有研究发现，一些植物提取物对反刍动物瘤胃原虫多样性会造成影响，赵士萍等[21]研究发现，奶牛每天饲喂30或40 g茶皂素均可显著降低瘤胃原虫的多样性，其原因可能是单宁有抑制瘤胃细菌增殖的作用[22]，瘤胃原虫可以吞噬细菌，细菌数量和多样性的改变进而导致原虫多样性的降低，这还有待通过体外细菌和原虫共培养试验来进一步验证。
4 结论饲粮含2%和4%来源于柠条的单宁显著降低绵羊瘤胃原虫数量，但对原虫种群多样性无显著影响；饲粮含4%来源于柠条的单宁显著增加了均毛虫属的相对丰度，饲粮含2%和4%来源于柠条的单宁有降低前毛虫属和内毛虫属相对丰度的趋势。
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