2. 中国科学院大学现代农业科学学院, 北京 100049;
3. 湖南先伟实业有限公司, 长沙 410016
2. College of Advanced Agricultural Sciences, University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China;
3. Hunan Xianwei Industrial Co., Ltd., Changsha 410016, China
植物提取物是来源于植物的具有多组分以及多生物学作用的物质，其具有多种活性成分，主要包括酚、醚、萜、酮、酸等活性物质，这些物质是植物生长过程中的代谢产物；同时植物提取物具有绿色、安全、无残留和无公害的特点，是饲料添加剂的新选择。近年来，相关学者对植物提取物在畜禽上的应用作了大量的研究，发现植物提取物具有抗菌抑菌、改善畜禽机体免疫力、提高饲料转化率和促进畜禽生产性能等作用[1-3]。
杜仲(Eucommia ulmoides Oliver)别名胶木，为杜仲科植物。杜仲叶提取物因含有桃叶珊瑚甙、绿原酸、京尼平苷酸和黄酮类化合物等，具有抗菌、消炎和抗氧化的功能[4-5]。Liu等[6]研究发现，饲粮添加杜仲叶提取物能够提高泌乳奶牛对营养物质的消化率和产奶量。孙玉丽等[7]通过在奶牛饲粮中添加杜仲素发现，杜仲素中的活性物质具有多羟基结构，能够使具有高强度氧化性的自由基还原，终止自由基链锁反应，清除自由基；通过自由基含量的降低从而降低脂质过氧化代谢产物丙二醛(MDA)的含量。迷迭香(Rosmarinus officinalis)为唇形科灌木，具有促进消化代谢、血液循环、改善血脂、保护肝脏和提高免疫力等作用，其主要活性物质为迷迭香酸、鼠尾草酸和酚类二萜等。相关研究发现，迷迭香具有很强的抗氧化功效，能够显著降低肉脂质的氧化和色泽损失[8]；也有研究发现，在羔羊饲粮中添加迷迭香对肉品质及肌肉成分没有显著影响[9]。Jordán等[10]在母羊饲粮中添加迷迭香发现，迷迭香中的黄酮类物质能与羊奶中的酪蛋白相互作用，从而显著增加羊奶中的黄酮类化合物含量。枇杷[Eriobotrya japonica (Thunb.) Lindl]为蔷薇科枇杷属，柿子(Diospyros kaki Thunb)为柿科柿属，其提取物活性物质主有熊果酸、齐墩果酸等，其中熊果酸具有降低肠道的炎症反应、调控肠道菌群、促进抗菌肽分泌和抗氧化的作用[11]；齐墩果酸具有保护肝脏、降低血糖血脂的作用[12]。本试验通过在山羊饲粮中添加复合植物(杜仲叶、迷迭香叶和枇杷叶和柿子)提取物，研究其对湘东黑山羊生长性能、营养物质表观消化率、血浆生化指标、免疫和抗氧化指标以及肌肉脂肪酸组成的影响，旨在为植物提取物在反刍家畜养殖应用提供相关理论依据和数据支持。
1 材料与方法 1.1 试验设计本试验所用复合植物提取物由湖南某有限公司提供，为淡黄色粉末物质，组成原料为枇杷叶和柿子叶提取物(400~600 g/kg)、迷迭香叶提取物(300~400 g/kg)和杜仲叶提取物(100~200 g/kg)；有效成分含量为：酚酸类20%~30%，二萜类25%~40%，黄酮类5%~15%，五环三萜类25%~40%。试验采用单因素随机分组方法，选取3~4月龄、体重[(9.82±0.83) kg]相近且体况良好的雌性湘东黑山羊20头，随机分为2组，每组10头。对照组饲喂基础饲粮，试验组饲喂在基础饲粮中添加0.15%的复合植物提取物的试验饲粮。将复合植物提取物与精料混合后进行饲喂，每日饲喂2次。基础饲粮组成及营养水平见表 1。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(干物质基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (DM basis) |
试验羔羊采用单栏饲喂，整个试验期共56 d，其中预试期14 d，正试期42 d。每日饲喂2次(06:30、18:30)，保证日剩料为投料量的5%~10%，记录采食量，自由饮水。
1.3 样品采集与处理 1.3.1 饲粮样试验期每周收集1次饲粮样品，将收集的饲粮样置于65 ℃恒温干燥箱中烘干，制成风干样，粉碎混匀后备用。
1.3.2 粪样正式试验期第37~41天，连续5 d晨饲前采集未被污染的粪样，将每天收集的粪样称重，取10%粪样，按每100 g粪样加入25 mL硫酸(10%)的方式进行固氮处理，另取10%粪样供常规营养成分测定，于-20 ℃进行冷冻保存。采样结束后将5 d收集的粪样混匀置于恒温干燥箱中65 ℃烘至恒重，制成风干样进行保存。
1.3.3 血浆正式试验期第40~41天，连续2 d晨饲前用含有乙二胺四乙酸(EDTA)的采血管于颈静脉采集血样10 mL，4 ℃下3 000 r/min离心15 min，取血浆于-20 ℃冷冻保存。
1.3.4 肌肉样正式试验结束后，对山羊进行屠宰，采集山羊右侧胴体背最长肌30 g于-20 ℃冷冻保存。
1.4 指标测定与方法 1.4.1 生长性能正式试验开始晨饲前对山羊进行称重，记为初始重，试验期间每隔10 d晨饲前进行称重，试验结束时进行最后一次称重，记为末重，计算平均日增重(ADG)，并根据山羊试验期总采食量和总增重量计算料重比。
1.4.2 常规营养物质表观消化率营养物质表观消化率以酸不溶灰分(AIA)为内源指示剂，采用内源指示剂法(GB/T 23742—2009)[13]计算。参照GB/T 6435—2014[14]测定水分含量，计算干物质(DM)含量；采用凯氏定氮法(GB/T 6432—2018[15])测定粗蛋白质(CP)含量；参照GB/T 20806—2006[16]测定中性洗涤纤维(NDF)含量；参照NY/T 1459—2007[17]测定酸性洗涤纤维(ADF)含量；参照GB/T 6438—2007[18]测定粗灰分含量；参照GB/T 6433—2006[19]测定脂肪含量；钙(Ca)含量的测定采用高锰酸钾法(GB/T 6436—2002[20])；磷(P)含量的测定采用分光光度法(GB/T 6437—2002[21])。
1.4.3 血浆生化、免疫和抗氧化指标血浆尿素氮(UN)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、总胆固醇(CHOL)、葡萄糖(GLU)、总蛋白(TG)、总胆汁酸(TBA)含量的均采用RX-Daytona全自动生化仪(Beckman公司)进行测定，所用试剂盒均购自北京德曼生化技术有限公司。血浆免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)含量、总抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)活性、MDA含量采用分光光度法测定，所用试剂盒购自于维世尔生物科技有限公司。
1.4.4 肌肉脂肪酸含量取约0.5 g冻干肌肉样品于10 mL离心管中，加入4 mL苯与石油醚(体积比为1 ∶ 1)的混合物后浸提24 h，然后加入4 mL氢氧化钾-甲醇溶液(0.4 mol/L)进行甲酯化，涡旋混合器上振荡3 min，静置30 min，加入超纯水分层后，取上层溶液，加入一定量无水硫酸钠，吸取样品中的水分。取200 μL待测样品，加800 μL己烷稀释后，用0.22 μm滤膜过滤后用气相色谱仪GC 2010(A09056)测定脂肪酸含量。
1.5 数据处理与分析使用Excel 2010软件对试验数据进行初步处理，使用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，以0.05＜P＜0.10、0.01＜P＜0.05和P＜0.01分别表示有差异显著趋势、差异显著和差异极显著，结果以平均值和均值标准误(SEM)表示。
2 结果与分析 2.1 生长性能由表 2可知，与对照组相比，试验组山羊ADG增加14.56%(P＞0.05)，ADFI降低了9.65 g/d(P＞0.05)，F/G降低了13.16%(P＞0.05)。
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表 2 复合植物提取物对山羊生长性能的影响 Table 2 Effects of compound plant extracts on growth performance of goats |
由表 3可知，与对照组相比，试验组对山羊DM、OM、CP、EE、NDF和ADF表观消化率均在数值上有所提高，但差异不显著(P＞0.05)。
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表 3 复合植物提取物对山羊营养物质表观消化率的影响 Table 3 Effects of compound plant extracts on nutrient apparent digestibilities of goats |
由表 4可知，与对照组相比，试验组山羊血浆中TG含量显著增加(P＜0.05)，TBA含量有增加趋势(0.05＜P＜0.10)，但GLU含量有降低趋势(0.05＜P＜0.10)；试验组山羊血浆中其余各项生化指标含量在数值上都略有增加，但差异均不显著(P＞0.05)。
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表 4 复合植物提取物对山羊血浆生化指标的影响 Table 4 Effects of compound plant extracts on plasma biochemical indexes of goats |
由表 5可知，对照组和试验组山羊血浆中IgA、IgG和IgM含量均没有显著差异(P＞0.05)。但试验组血浆中SOD活性和T-AOC分别比对照组提高10.62%(P＜0.05)和10.14%(P＜0.01)。
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表 5 复合植物提取物对山羊血浆免疫和抗氧化指标的影响 Table 5 Effects of compound plant extracts on plasma immunity and antioxidant indexes of goats |
由表 6可知，对照组山羊与饲粮添加复合植物提取物的山羊肌肉中顺式油酸(C18 ∶ ln9c)含量最高，硬脂酸(C18 ∶ 0)和棕榈酸(C16 ∶ 0)含量次之。与对照组相比，饲粮中添加复合植物提取物在数值上提高了山羊背最长肌中月桂酸(C12 ∶ 0)、肉豆蔻酸(C14 ∶ 0)、棕榈酸(C16 ∶ 0)、棕榈油酸(C16 ∶ 1)、亚油酸(C18 ∶ 2n6c)、花生酸(C20 ∶ 0)、α-亚麻酸(C18 ∶ 3n3)、二十碳三烯酸(C20 ∶ 3n6)、花生四希酸(C20 ∶ 4n6)和二十二碳六烯酸(C22 ∶ 6n3)的含量，但差异均不显著(P＞0.05)；并且在数值上能够降低山羊背最长肌中饱和脂肪酸(SFA)和多不饱和脂肪酸(PUFA)的含量，提高背最长肌中单不饱和脂肪酸(MUFA)含量，但差异均不显著(P＞0.05)。
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表 6 复合植物提取物对山羊背最长肌脂肪酸含量的影响(占总脂肪酸的百分比) Table 6 Effects of compound plant extracts on muscle fatty acid contents of goats (percentage of total fatty acids) |
植物提取物的成分与植物种类有关，但是其主要的生物活性成分没有很大的差别，主要包括甙、酸、酚、酮类和萜类等。相关研究表明，在饲粮中添加植物提取物能够提高山羊的生长性能，也有研究报道植物提取物并不能显著影响动物的生长性能[22]。有研究发现，在生长育肥猪饲粮中添加杜仲提取物能够提高ADG，降低F/G[23]。Yagoubi等[24]通过在羔羊饲粮中添加迷迭香蒸馏残渣发现，试验组羔羊生长性能有所提高。李书仪等[25]认为，植物提取物能够有效地改善山羊的瘤胃发酵性能，从而改善山羊的生长性能。木其尔[26]发现，植物提取物能够通过调控激素来改善小尾寒羊的生长性能。植物提取物中不仅含有能够促进生长的营养物质，也含有一些能够降低动物生长性能的抗营养因子，比如蛋白酶抑制剂、单宁、凝集素、非淀粉多糖和植酸等。本试验中，与对照组相比，虽然试验组山羊在数值上ADG增加，F/G下降，但差异并不显著，这有可能是因为复合植物提取物中含有的抗营养因子降低了植物提取物中活性物质的作用效果，也有可能是复合植物提取物添加量较少和饲养周期过短，因此未能显著改善山羊的生长性能。
3.2 复合植物提取物对山羊营养物质表观消化率的影响反刍动物由于瘤胃的特殊存在，营养物质首先在瘤胃经瘤胃微生物的作用下，发酵生成瘤胃微生物蛋白(MCP)、挥发性脂肪酸(VFA)、氨(NH3)、甲烷(CH4)和二氧化碳(CO2)等，然后再进入后肠道供机体消化吸收。植物提取物中的活性物质具有一定的抗菌作用[27-28]，能够抑制有害菌的生长，促进有益菌的生长，改善瘤胃微生物群落，从而提高山羊对饲粮中营养物质的消化率。相关研究发现，在荷斯坦奶牛饲粮中添加植物提取物，能够调节瘤胃机能，增加瘤胃细菌细胞壁的通透性，从而显著提高奶牛对饲粮中营养物质的表观消化率[29]。Liu等[30]研究发现，在育肥羊饲粮中添加杜仲叶提取物能够降低瘤胃氨氮含量，从而减少饲粮中蛋白质在瘤胃中分解，提高进入后肠道的蛋白质数量。杜仲含有的绿原酸能够促进肠道蠕动和胃液的分泌，从而提高对饲粮中营养物质的消化率。本试验中，试验组山羊CP、NDF、ADF和OM的表观消化率都略有提高，EE的表观消化率略有下降，但是差异均不显著，这有可能是植物提取物中的活性物质在瘤胃微生物的作用下被部分分解；也有可能是山羊正处于生长发育阶段，对营养物质需求量较高，因此未能显著改变山羊对营养物质的表观消化率。
3.3 复合植物提取物对山羊血浆生化指标的影响血浆生化指标能够反映动物机体新陈代谢、组织器官机能变化、营养物质利用沉积和机体健康状况的情况[31]。组织蛋白质合成与血浆TP含量密切相关，血浆TP含量越高，机体合成蛋白质的能力就越强[32]。李燕舞等[33]通过在肉兔饲粮中添加杜仲叶提取物发现，杜仲提取物中含有的京尼平苷酸和松脂醇二葡萄苷能够促进机体蛋白质的合成，从而导致试验组肉兔血清中TP和ALB含量升高。本试验中，相对于对照组，试验组山羊血浆中TP和ALB含量均有所增加，但是差异并不显著。杜仲提取物中含有的京尼平苷酸和松脂醇二葡萄苷能够促进动物机体蛋白质的合成代谢，而本试验中导致差异并不显著的原因可能是山羊正处于生长阶段，机体组织对于蛋白质的利用代谢较快所致。
UN是动物机体利用蛋白质的代谢产物，其含量与动物机体蛋白质代谢以及氨基酸平衡相关[34]。机体组织分解氨基酸产生NH3和CO2，后在肝脏中合成尿素，肾脏为尿素的主要排泄器官，而反刍动物瘤胃的特殊存在，会在瘤胃微生物的作用下，产生NH3和CO2后进入血液。李燕舞等[33]通过在肉兔饲粮中添加杜仲叶提取物发现，杜仲提取物中含有的活性物质导致肉兔机体内氨基酸代谢的不平衡，降低了蛋白质和氨基酸的代谢率，从而显著提高了肉兔血清中UN的含量。本试验中，试验组山羊血浆中UN含量在数值上高于对照组，但差异并不显著，说明在山羊饲粮中添加复合植物提取物能够降低机体对蛋白质的代谢，也有可能是复合植物提取物对瘤胃微生物的生长具有促进作用，瘤胃产生的NH3和CO2含量增加，从而导致血浆中UN的含量增加。Zoral等[35]通过对鲤鱼饲粮添加迷迭香提取物发现，迷迭香提取物中含有的单萜和倍萜烯会导致机体出现剂量依赖性组织病理学变化，对肝脏和肾脏具有一定的毒性；肾脏出现病理变化，会导致UN的排泄受到阻碍，因此也会导致血液中UN含量升高。
GLU是动物机体的主要能量来源，血液中的GLU含量都处于一个相对稳定的状态。血液中GLU的主要来源为：食物的消化吸收、肝糖原的转化以及蛋白质和脂肪的转化。相关研究发现，杜仲具有提高绵羊血液中GLU含量的作用[36]，而迷迭香的有效成分(迷迭香酸和鼠尾草酸等)以及齐墩果酸能够降低血液中的GLU含量。本试验中，试验组山羊血浆中GLU含量有低于对照组的趋势，这有可能是试验组山羊血液中GLU供能与转化为蛋白质和脂肪增加，也有可能是迷迭香中的有效成分和齐墩果酸的作用大于杜仲叶中有效成分的作用，从而导致试验组山羊血浆中GLU含量有低于对照组的趋势。
TG是反映动物机体血脂含量高低的重要指标，血浆中TG的含量处于动态平衡，是动物机体主要的供能物质之一，动物机体摄入的脂肪在TBA的作用下被肠黏膜细胞吸收后在肠黏膜上皮细胞内形成TG。动物机体几乎所有部位都能合成CHOL，而CHOL是TBA合成的主要原料，动物机体合成的CHOL大约有1/2在肝脏中被羟化酶转化为TBA。相关研究发现，杜仲叶中绿原酸能够抑制外源脂肪的转化吸收和肝脏CHOL的合成[37]；贾少丹[38]在绵羊饲粮中添加杜仲叶提取物发现，试验组绵羊血液CHOL含量显著降低；Mahgoub等[39]通过试验发现，迷迭香提取物可以降低鹌鹑血液CHOL的含量；齐墩果酸和熊果酸能够降低酰基辅酶A胆固醇酰基转移酶活性，从而降低CHOL含量[40]。本试验中，试验组山羊血浆TG含量显著高于对照组，TBA含量有高于对照组的趋势，2组山羊血浆中CHOL含量差异不显著。杜仲中所含的绿原酸能够促进胃液分泌和利胆的作用，京尼平苷也能够促进胆汁的分泌；熊果酸和齐墩果酸也有促进TBA分泌的作用[41-42]，与本试验中结果一致。因为试验组山羊血浆中TBA含量的升高，因此加快了机体组织对外源脂肪的摄入和吸收，从而增加了血浆中TG的含量；胆汁酸含量的增加导致对合成原料CHOL的需求量增加，因此机体会产生更多的CHOL用于TBA的合成，从而导致血浆中CHOL含量升高，并未体现复合植物提取物对机体CHOL合成的抑制作用。
3.4 复合植物提取物对山羊血浆免疫及抗氧化指标的影响动物机体血浆中免疫球蛋白含量能够反映机体的免疫系统情况，主要分为IgA、IgG、IgM、免疫球蛋白D(IgD)和免疫球蛋白E(IgE)。IgG是动物机体内最主要抗体，具有凝聚和沉淀抗原、抗菌和抗病毒的作用；血清中的IgA为单体，具有较低免疫作用，IgM是分子质量最大的免疫球蛋白，具有很强的免疫作用[43]。陈敬佳[44]发现，在断奶仔猪饲粮中添加杜仲提取物可显著提高血浆中免疫球蛋白的含量；而杨改青等[36]在绵羊饲粮中添加杜仲叶提取物发现，血浆中免疫球蛋白含量并没有显著升高；有关研究发现，熊果酸能够有效地改善肠道免疫屏障，从而提高机体的免疫力[11]。本试验中，添加复合植物提取物后，试验组血浆中IgA和IgG含量均有所下降，IgM含量升高，但是差异并不显著。虽然复合植物提取物中的活性成分均具有提高免疫力的作用，但是免疫球蛋白是具有抗体的活性的球蛋白，而动物机体只有在被病毒或者细菌侵入后，淋巴B细胞分泌一系列具有抗体活性的免疫球蛋白，与病毒或者微生物携带的抗原结合从而达到免疫的作用，免疫结束后机体体液中的免疫球蛋白含量将会降低。本试验中，试验组血浆IgA和IgG含量有所降低，有可能是因为对照组山羊非特异性免疫能力较弱，对外界病原体的抵御能力较低，从而需要体液免疫过程分泌更多的免疫球蛋白来抵御病原体的侵入。
植物提取物有效成分中的酚类物质具有抗氧化活性，能够通过单电子转移和H+转移机制来清除自由基、螯合物和抑制氧化酶活性[45-46]。Ortuño等[47]通过试验发现，在育肥羊饲粮中添加迷迭香提取物，能够抑制脂肪氧化；高银辉等[48]在小鼠饲粮中添加杜仲素发现，杜仲素能够降低小鼠肝脏的损伤，能够提高肝细胞清除自由基酶的活性来提高小鼠的抗氧化能力；也有研究发现，熊果酸和齐墩果酸具有提高肝脏和血液中抗氧化酶的活性，具有抑制氧化酶活性和清除自由基的作用[49]。本试验中，试验组血浆中SOD的活性显著高于对照组，血浆T-AOC极显著高于对照组，这与先前报道的结果一致，说明复合植物提取物能够保护山羊肝脏，其有效活性成分能够提高山羊体内清除自由基酶的活性，从而降低血浆MDA含量和提高SOD的活性，提高山羊的抗氧化能力。
3.5 复合植物提取物对山羊背最长肌脂肪酸组成的影响肌肉脂肪酸含量会影响肉质的风味和嫩度，其主要以SFA和MUFA为主[50]。杜仲叶中含有丰富的不饱和脂肪酸(UFA)，能够增加动物机体肌肉以及其他组织UFA合成的前体物，同时杜仲叶中含有的黄酮类活性物质能够影响动物机体脂肪的分配，抑制SFA的合成[51]；熊果酸和齐墩果酸也能够降低动物机体血液中游离脂肪酸含量，从而影响肌肉脂肪酸的合成[52]；Liotta等[53]通过在猪的饲粮中添加迷迭香提取物发现，迷迭香提取物中含有的酚类活性物质能够终止氧化链反应和提高PUFA合成过程中各种酶(Δ-5去包和酶和Δ-6去饱和酶)的活性，从而增加猪肉肌肉中PUFA的含量，本试验中，在山羊饲粮中添加复合植物提取物后，试验组山羊肌肉中SFA、MUFA含量有所升高，PUFA含量降低，但是差异并不显著。动物机体内所有脂肪酸的合成都是以乙酰辅酶A为原料，而SFA向UFA的转变需要一系列脱饱和酶，动物机体主要产生棕榈油酸和油酸等MUFA；PUFA的合成较少，主要直接从饲粮中摄取。有可能复合植物提取物中的活性成分能够提高山羊机体内脱饱和酶的活性，从而导致山羊背最长肌中MUFA的含量有所升高；PUFA主要从饲粮中摄入，这也是试验组与对照组山羊肌肉中PUFA含量没有显著差异的主要原因。
4 结论① 饲粮中添加0.15%的复合植物提取物能够提高山羊的ADG和F/G，但是效果并不显著。
② 饲粮中添加0.15%的复合植物提取物能够显著提高山羊的抗氧化能力。
③ 饲粮中添加0.15%的复合植物提取物能够提高山羊血浆中TG含量和降低GLU含量。
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