2. 中国科学院大学现代农业科学学院, 北京 100049;
3. 湖南师范大学生命科学学院, 动物肠道功能湖南省重点实验室, 长沙 410081
2. College of Advanced Agricultural Sciences, University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China;
3. Hunan Provincial Key Laboratory of Animal Nutritional Physiology and Metabolic Process, College of Life Science, Hunan Normal University, Changsha 410081, China
天冬氨酸(Asp)作为一种功能性氨基酸[1],在糖代谢、尿素循环、线粒体功能等代谢方面发挥着重要的生物学作用[2],可改善动物机体免疫和抗氧化功能以及促进生长发育[3]。而作为L-天冬氨酸(L-Asp)的同分异构体D-天冬氨酸(D-Asp)则很少被关注。研究表明,经碱性、高pH和长期加热等加工技术处理的食品含有包括D-Asp在内的大量D-氨基酸[4],体内也可通过D-天冬氨酸氧化酶和天冬氨酸消旋酶转化或者合成获得[4-6]。
D-Asp大多分布于脑(包括海马和前额叶皮层)和内分泌器官(肾上腺、垂体和睾丸)中,对维持动物正常的中枢神经系统和神经元功能以及调控激素水平等方面发挥重要作用[7]。添加D-Asp可调节小鼠生长激素的释放,促进小鼠的生长发育[8],在热应激条件下,饲粮添加适量D-Asp或添加可产生D-Asp的活菌,可通过调节神经系统有效降低直肠温度,产生镇静作用,从而改善雏鸡的采食量以及生长性能[9]。除了在缓解雏鸡热应激方面有很大潜力,D-Asp也可以通过改变肠道微生物菌群区系影响断奶仔猪的生长性能[10]。目前关于D-Asp功能研究大多集中于医学和药学领域,在畜牧养殖业中关于D-Asp对生猪机体健康和生长性能的影响研究鲜少报道。因此,本研究拟通过在饲粮中添加不同水平的D-Asp,探讨其对断奶仔猪生长性能、血清生化指标、游离氨基酸含量以及营养物质表观消化率的影响,为改善仔猪生长性能和提高营养物质表观消化率提供理论依据,同时为畜禽功能性氨基酸营养需要与饲养管理提供新的调控策略。
1 材料与方法 1.1 试验材料D-Asp(纯度≥98%)购自湖南某生物科技有限公司。基础饲粮购自长沙某饲料科技有限公司。三元杂交(杜×长×大)断奶仔猪购于湖南某农牧发展有限公司。
1.2 试验设计选择44头体况相近的45日龄健康三元杂交(杜×长×大)断奶仔猪,平均体重为(10.74±0.25) kg,随机分为4组,每组11个重复,每个重复1头猪,公母各占1/2,其中对照组饲喂粗蛋白质(CP)含量为17%的玉米-豆粕型基础饲粮,D-Asp添加量根据Li等[10]和前期预试验结果设置,试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组分别饲喂在基础饲粮中添加50、500和5 000 mg/kg D-Asp的试验饲粮。基础饲粮的配制参照NRC(2012)中10~30 kg体重断奶仔猪营养需要标准,其组成及营养水平见表 1,饲粮中氨基酸含量见表 2。
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表 1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础) Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (air-dry basis) |
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表 2 饲粮中氨基酸含量 Table 2 Amino acid contents in diets |
本试验在中科院亚热带农业生态研究所动物饲养室进行,全封闭式猪舍,漏缝金属材质地板,不锈钢可调式料槽,乳头式饮水器。仔猪单笼饲养,并按照猪场标准饲养管理程序对试验猪进行驱虫与免疫处理。预试期5 d,正试期28 d。每天饲喂粉料3次,时间为07:30、12:00和18:30,自由饮水和采食,以食槽无剩料为原则。整个圈舍采取自然通风,在养殖期内对所有圈舍进行不定期消毒和清扫。
1.4 样品采集和指标测定 1.4.1 生长性能的测定于试验第14、21和28天,分别对断奶仔猪进行称重,记录每天的采食量和健康状况,根据采食量和体重计算平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和料重比(F/G)。
1.4.2 脏器指数的测定饲养试验结束后,每组随机选取6头猪,共24头猪,禁食12 h,麻醉后屠宰解剖,屠宰后取出心脏、肝脏、脾脏和肾脏,将表面水分吸干后进行称重,并计算脏器指数。
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饲养试验结束后,断奶仔猪禁食12 h,进行空腹采血,取前腔静脉血液10 mL,3 000 r/min、4 ℃离心10 min,取上层血清于1.5 mL离心管中,-20 ℃冻存。待测时,将血清解冻,取300 μL用CX4型全自动生化分析仪(美国Backman公司)测定,测定总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、尿素氮(UN)、葡萄糖(GLU)、氨的含量及谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)的活性。测定方法按罗氏(Roche)生化试剂盒操作说明进行。
取700 μL血清,加入8%磺基水杨酸700 μL,充分混匀,静置1 h,4 ℃,10 000 r/min离心20 min,离心过后取下层水相,过0.22 μm滤膜后装入上样瓶存于4 ℃,用氨基酸分析仪(L8900,日本)测定血清游离氨基酸的含量。
1.4.4 粪便的收集处理和营养物质表观消化率的测定 1.4.4.1 粪便的采集、处理及测定在试验结束前3天对粪样进行采集,混匀后将收集的粪样分为2份,其中一份使用10% HCl进行固氮,以10 g/mL的浓度进行,用于测定粪便中的粗蛋白质含量。另一份粪样置于105 ℃烘箱中处理,待到恒重后取出称重,用于测定粪便中的绝干干物质含量。将烘干的样品粉碎过40目筛保存待测。
1.4.4.2 营养物质表观消化率的测定饲粮和粪便样品中的干物质含量根据GB/T 6435—2006测定;粗蛋白质含量根据GB/T 6432—1994测定;粗脂肪(EE)含量根据GB/T 6433—2006测定;粗灰分(Ash)含量根据GB/T 6438—2007测定;粗纤维(CF)含量根据GB/T 6434—2006测定。
本试验采用内源指示剂-盐酸不溶灰分(AIA)法进行表观消化率的测定,计算公式如下:
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试验数据先用Excel 2018软件进行整理和分析,数据以平均值(mean)±标准误(standard error, SE)表示,然后使用SPSS 22.0统计软件对数据进行单因素方差分析(one-way ANOVA)。单因素方差分析显著时,采用Duncan氏法对数据进行多重比较,以P < 0.05作为显著性判断依据,0.05≤P < 0.10为有差异趋势。
2 结果 2.1 D-Asp对断奶仔猪生长性能的影响由表 3可知,试验第14天,试验Ⅰ组的平均体重、ADFI和ADG显著高于其他3组(P < 0.05),且比对照组分别提高19.6%、8.8%和35.6%。而试验Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ组F/G均显著低于对照组(P < 0.05),分别降低16.4%、10.6%和12.8%,其中试验Ⅰ组F/G最低。
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表 3 D-Asp对断奶仔猪生长性能的影响 Table 3 Effects of D-Asp on growth performance in weaned piglets |
试验第21天,试验Ⅰ组平均体重最高,较对照组提高13.5%,并且较试验Ⅱ和Ⅲ组分别提高12.1%和9.2%,但是各组之间差异不显著(P>0.05)。试验Ⅰ组的ADFI最高,试验Ⅱ组的ADFI最低。试验Ⅰ组的ADG显著高于其他3组(P < 0.05),与对照组相比,显著提高了16.4%。试验Ⅰ组的F/G也显著低于其他3组(P < 0.05),较对照组降低20.2%。
试验第28天,试验Ⅰ组平均体重最高,较对照组提高10.2%,并且相较试验Ⅱ和Ⅲ组分别提高11.3%和8.4%,但是各组之间差异不显著(P>0.05)。与对照组相比,试验Ⅱ组的ADFI显著降低(P < 0.05);试验Ⅰ组ADFI最高,且显著高于试验Ⅲ组(P < 0.05)。试验Ⅰ组的ADG显著高于其他3组(P < 0.05),与对照组相比,显著提高了23.5%。试验Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ组F/G均显著低于对照组(P < 0.05),分别降低16.3%、11.0%和15.8%,其中试验Ⅰ组F/G最低。
2.2 D-Asp对断奶仔猪脏器指数的影响由表 4可知,饲粮添加不同水平D-Asp对断奶仔猪脏器指数无显著影响(P>0.05)。
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表 4 D-Asp对断奶仔猪脏器指数的影响 Table 4 Effects of D-Asp on organ indexes in weaned piglets |
由表 5可知,随着D-Asp添加水平的增加,血清TP和ALB含量也随之增加,呈现剂量效应,且试验组的血清ALB含量均显著高于对照组(P < 0.05)。试验Ⅱ、Ⅲ组血清TP含量显著高于对照组(P < 0.05)。与对照组相比,添加不同水平D-Asp均可显著提高血清ALP活性(P < 0.05),且试验Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ组间无显著差异(P>0.05)。各组之间血清GLU、氨含量及ALT和AST活性无显著差异(P>0.05)。
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表 5 D-Asp对断奶仔猪血清生化指标的影响 Table 5 Effects of D-Asp on serum biochemical indexes in weaned piglets |
由表 6可知,对于必需氨基酸,随着饲粮中D-Asp添加水平的增加,断奶仔猪血清中的游离异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)和缬氨酸(Val)含量呈线性降低趋势,对照组中所含Ile、Leu和Val含量显著高于其他试验组(P < 0.05);与对照组相比,添加不同水平的D-Asp可显著提高断奶仔猪血清中赖氨酸(Lys)含量,同时不同程度降低苯丙氨酸(Phe)的含量;饲粮中添加不同水平D-Asp对血清中蛋氨酸(Met)和苏氨酸(Thr)含量无显著影响(P>0.05)。对于非必需氨基酸,饲粮中添加不同水平D-Asp对血清丝氨酸(Ser)、谷氨酸(Glu)、丙氨酸(Ala)、酪氨酸(Tyr)和脯氨酸(Pro)含量均无显著影响(P>0.05);随着饲粮中D-Asp添加水平的增加,血清组氨酸(His)的含量降低,对照组的含量最高且显著高于试验组(P < 0.05);与对照组相比,试验Ⅰ组血清甘氨酸(Gly)和半胱氨酸(Cys)含量显著升高(P < 0.05),且显著高于其他2组试验组(P < 0.05),试验Ⅲ组血清Asp含量显著高于其他3组(P < 0.05)。试验Ⅲ组血清精氨酸(Arg)含量也显著高于试验Ⅰ和Ⅱ组(P < 0.05),与对照组差异不显著(P>0.05)。
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表 6 D-Asp对断奶仔猪血清游离氨基酸含量的影响 Table 6 Effects of D-Asp on serum free amino acid contents in weaned piglets |
由表 7可知,与对照组相比,试验Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ组的粗脂肪表观消化率显著提高(P < 0.05),分别提高了7.8%、10.3%和10.5%,但粗灰分表观消化率显著降低(P < 0.05),分别降低了14.5%、11.6% 和11.1%。与对照组相比,试验Ⅰ和Ⅱ组粗蛋白质和粗纤维表观消化率显著降低(P < 0.05),试验Ⅲ组与对照组间无显著差异(P>0.05)。与对照组相比,试验Ⅰ组总能表观消化率显著降低了3.1%(P < 0.05),其他试验组与对照组间无显著差异(P>0.05)。不同水平D-Asp对干物质表观消化率无显著影响(P>0.05)。
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表 7 D-Asp对断奶仔猪营养物质表观消化率的影响 Table 7 Effects of D-Asp on nutrient apparent digestibilities in weaned piglets |
在养猪生产过程中,断奶仔猪阶段生长性能的好坏直接关系生猪后期育肥阶段的生长和肉品质安全,是影响经济效益的关键指标[11]。在动物体内,L-Asp是肠上皮细胞的主要能量来源,与谷氨酸同是合成Pro、Arg、丙氨酸(Ala)等氨基酸的底物,可通过改善肝脏代谢来缓解仔猪氧化应激[12]。而D-Asp则主要分布于神经和内分泌系统中,可有效调控动物激素水平进而影响动物的生理活动[13]。本研究结果表明,饲粮中添加不同水平D-Asp可以不同程度地改善断奶仔猪ADFI、ADG和降低F/G。尤其是添加50 mg/kg D-Asp时,可显著提高断奶仔猪的ADG和ADFI以及降低F/G。添加500和5 000 mg/kg的D-Asp在平均体重方面与对照组差异不显著,但是仍然可以显著降低F/G,这意味着添加不同水平D-Asp可不同程度地改善断奶仔猪的生长性能和提高饲料转化率。其原因可能如下:一方面D-Asp可转化为L-氨基酸用于机体蛋白质的合成,另一方面D-Asp也可合成N-甲基-D-天冬氨酸直接或间接刺激N-甲基D-天冬氨酸受体[14],而适量的N-甲基D-天冬氨酸能够调控动物生长激素等激素的水平,调控脂肪代谢,从而显著提高仔猪的生长速度和采食量[15]。Li等[10]研究表明,饲粮添加1% L-Asp对断奶仔猪生长性能无显著影响,但添加1% D-Asp会抑制其生长和破坏仔猪免疫功能。也有研究表明,在饲粮中添加2% D-Asp显著抑制鸡的生长,添加6% L-Asp则不会抑制生长[16]。这些结果与本研究结果均相反,这可能是因为饲粮中添加过量的D-Asp不能有效地被动物机体内的天冬氨酸消旋酶或氧化酶所降解,导致细胞内D-Asp过量积累,阻碍畜禽生长发育[4],但是适量D-Asp的添加则可促进动物的生长发育。
脏器指数主要是反映动物内脏器官是否中毒以及脏器功能强弱的一个关键指标[17],同时也可以反映动物生长发育的状况和营养物质吸收情况[18]。本试验研究发现,饲粮中添加不同水平的D-Asp对断奶仔猪的心脏指数、肝脏指数、脾脏指数、肺脏指数以及肾脏指数均没有显著影响,这表明低水平D-Asp对断奶仔猪内脏器官无毒害作用。
3.2 D-Asp对断奶仔猪血清生化指标的影响动物机体的原料以及消化产物的代谢都是通过血液的运输来实现,血清生化指标的变化能够直接反映动物的营养状态和健康状况,也能反映组织器官机能的变化[19]。本研究结果表明,断奶仔猪血清TP和ALB的含量呈剂量效应,即随着D-Asp添加水平的增加,血清TP和ALB含量显著增加。血清TP和ALB的含量主要受饲粮类型以及营养水平的影响,可以反映机体的蛋白质代谢水平和免疫机能[20]。血清TP和ALB含量的提高,则说明断奶仔猪体内的蛋白质合成代谢增加以及提高免疫力。动物血清中的ALT、AST和ALP的活性可以反映动物肝脏功能的受损程度和抗应激能力[21]。本试验中,添加不同水平的D-Asp对仔猪血清中AST和ALT活性并没有显著影响,却可显著提高血清中ALP的活性,这一结果与Li等[10]研究添加1% D-Asp或DL-Asp的结果相一致。这可能是由于添加D-Asp会促进肝脏代谢,增强肝脏中的D-Asp氧化酶活性,加快脂肪消化吸收和钙磷沉积,提高机体抗应激能力,从而改善仔猪的生长发育。
3.3 D-Asp对断奶仔猪血清游离氨基酸含量的影响Lys是生猪生长过程中的第一限制性氨基酸,本研究发现,添加不同水平D-Asp可显著提高血清游离Lys含量,这表明体内蛋白质合成速度加快,提高产肉效率,促进肌肉的生长发育[22]。支链氨基酸(Val、Leu、Ile)参与机体内蛋白质和能量的代谢,可以通过哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路调节机体能量和蛋白质的代谢,促进动物生长和健康[23],而添加不同水平的D-Asp则显著降低血清支链氨基酸含量,这是否预示着添加D-Asp干扰了支链氨基酸的代谢,有待进一步研究。本研究表明,添加不同水平的D-Asp显著降低血清Phe含量,而Phe与Tyr具有协同作用,Phe与Tyr的比值可以作为衡量Phe在体内的累积情况,在本试验中各组Phe与Tyr的比值分别为0.80、0.72、0.88和0.73,表明不添加或添加中剂量的D-Asp可有Phe累积的现象[24],从而抑制了仔猪生长发育,这也进一步证实了500 mg/kg D-Asp添加量的仔猪表现出比其他组生长发育迟缓和采食量低的现象。当饲粮提供的非必需氨基酸不能满足动物机体需求时,动物机体能通过一系列转氨反应合成非必需氨基酸以满足动物的需求[25]。本研究发现,添加不同水平的D-Asp可显著影响血清非必需氨基酸Asp、Gly、Cys、His和Arg的含量,但对Ser、Glu、Ala、Tyr和Pro含量无显著影响。添加低水平和中水平的D-Asp可降低血清Arg和His含量,这可能是因为添加少量的D-Asp可有效提高精氨酸酶和组氨酸酶的活性,从而加速Arg和His的分解[26]。血清中Gly和Cys主要是参与机体的脂肪代谢和解毒作用[27-28],添加50 mg/kg的D-Asp可显著增加血清中的Gly和Cys的含量,从而调控机体的脂肪代谢,促进断奶仔猪生长发育和蛋白质的合成。
3.4 D-Asp水平对断奶仔猪营养物质表观消化率的影响目前国内外尚无对D-Asp影响断奶仔猪表观消化率的影响研究,因此,本试验探讨了饲粮添加不同水平D-Asp对断奶仔猪营养物质表观消化率的影响,以期说明具有旋光性的D-氨基酸对断奶仔猪营养需求的作用。本研究发现,添加不同水平D-Asp可有效提高断奶仔猪粗脂肪表观消化率。饲粮中的脂肪通常是在肠道脂肪酶的作用下,将其分解为游离脂肪酸和甘油,以乳糜微粒的形式进入血液循环[29]。口服D-Asp会引起新生雏鸡体温的抑制,同时也可以影响血浆代谢产物中的甘油三酯含量[9],这进一步证明D-Asp与机体脂质代谢有关,可以影响小肠对脂质的吸收。有研究报道,D-氨基酸的添加会导致消化道蠕动能力降低,进而降低动物营养物质消化率[30]。这与本试验结果一致,本试验发现添加不同水平D-Asp可降低断奶仔猪粗蛋白质和总能表观消化率,且添加50 mg/kg D-Asp时,其粗蛋白质和总能表观消化率最低,这主要是因为D-Asp会降低肠道蠕动能力,同时此处理增加了断奶仔猪的采食量,在这双重因素的作用下降低了饲粮的消化率。营养物质表观消化率的变化一定程度上也与肠道微生物有关,D-氨基酸可阻止各种细菌生物膜的形成和促进已形成的生物膜分解,从而影响肠道微生物有益菌和有害菌的分布[31]。D-Asp作为D-氨基酸的一种,也可影响动物肠道微生物种群区系,从而影响了粗纤维及其他营养物质表观消化率,但具体的作用机制还需要进一步研究。
4 结论饲粮中添加不同水平的D-Asp,尤其是添加50 mg/kg的D-Asp时,可有效提高断奶仔猪的生长性能和饲料转化率,促进营养物质的吸收利用,影响体内氨基酸代谢。因此,50 mg/kg D-Asp有潜力作为一种新型的功能性添加剂应用于断奶仔猪饲粮中。
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